本發(fā)明屬于snp檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種硫代修飾引物及應(yīng)用該引物的snp檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，snp),主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的dna序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見(jiàn)的一種。占所有已知多態(tài)性的90％以上。snp在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個(gè)堿基對(duì)中就有1個(gè)，估計(jì)其總數(shù)可達(dá)300萬(wàn)個(gè)甚至更多。

目前snp的常用檢測(cè)方法是等位基因特異性pcr(alleleapecificpcr，as-pcr)，as-pcr是基于引物3`端堿基與dna模板匹配與否來(lái)區(qū)分snp位點(diǎn)。理論上，只要末位堿基不配對(duì)，那么引物無(wú)法有效延伸；但是末位單堿基錯(cuò)配往往不能達(dá)到預(yù)期的分辨效果。由于pcr反應(yīng)中dna呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，當(dāng)與引物3`端堿基錯(cuò)配的dna模板在第一個(gè)循環(huán)有少量的擴(kuò)增時(shí)，其復(fù)制出來(lái)的dna模板在后續(xù)的循環(huán)里與原引物的錯(cuò)配就不存在。隨著指數(shù)級(jí)的dna擴(kuò)增，錯(cuò)配產(chǎn)物的數(shù)量也相當(dāng)可觀。達(dá)到影響分辨率的程度。

授權(quán)公告號(hào)為cn103320514b的發(fā)明專利公開(kāi)了一種檢測(cè)臨近snp的多重pcr方法，可以解決擴(kuò)增抑制問(wèn)題并提高擴(kuò)增效率；但是該方法需要設(shè)計(jì)多對(duì)引物，工作量較大，操作較為繁瑣。因此，提供一種新的snp檢測(cè)方法，以提高靈敏性和準(zhǔn)確性，防止錯(cuò)配延伸，成為本領(lǐng)域研究人員急需解決的技術(shù)問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種硫代修飾引物及應(yīng)用該引物的snp檢測(cè)方法。

本發(fā)明具體技術(shù)方案如下：

本發(fā)明一方面提供了一種硫代修飾引物，所述引物的硫代修飾位點(diǎn)為3`端第一和第二個(gè)堿基之間的磷酸二酯鍵。

本發(fā)明另一方面提供了一種應(yīng)用該引物的的snp檢測(cè)方法，包括如下步驟：

s1：設(shè)計(jì)并合成用于擴(kuò)增目的基因的特異性引物，所述特異性引物包括兩條上游引物f1、f2和一條下游引物r，所述f1引物和所述f2引物3`端第一位堿基不同，其余序列均相同；

s2：分別對(duì)所述f1引物和所述f2引物進(jìn)行硫代修飾；

s3：用所述引物對(duì)目的基因進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

s4：對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

進(jìn)一步地，所述pcr的反應(yīng)體系中使用的dna聚合酶為pfu高保真dna聚合酶。

snp位點(diǎn)的識(shí)別，即單個(gè)堿基的識(shí)別。高保真dna聚合酶比普通taqdna聚合酶對(duì)錯(cuò)配堿基的識(shí)別能力更強(qiáng)。但是高保真dna聚合酶具有3`-5`核酸外切酶活性，在pcr的過(guò)程中會(huì)切掉不匹配的堿基；硫代修飾的作用是改變堿基間的連接方式，將堿基間磷酸二酯鍵中的氧原子換成硫原子，3`-5`核酸外切酶在pcr過(guò)程中不能識(shí)別該位點(diǎn)，從而不能將不匹配的堿基切除。由此可以提高snp檢測(cè)的特異性和準(zhǔn)確性。

進(jìn)一步地，所述步驟s3中，分別采用f1引物和f2引物為上游引物、以r引物為下游引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr。

進(jìn)一步地，所述pcr的反應(yīng)體系中包括如下組分：

模板dna0.2ng/μl、f1引物或f2引物0.5μm、r引物0.5μm、dntp0.2mm、pfu高保真dna聚合酶0.02u/μl以及1×的sybrgreen。

不同種類生物的不同基因片段大小不同，差距可達(dá)兩個(gè)數(shù)量級(jí)，用量約在0.02～2ng/μl之間。本研究中應(yīng)用的是人基因組片段，因此模板用量為0.2ng/μl。

進(jìn)一步地，所述pcr的反應(yīng)條件如下：

(1)預(yù)變性：98℃3min；

(2)擴(kuò)增：98℃10s，58℃30s，共40個(gè)循環(huán)；

(3)擴(kuò)增曲線：95℃15s；60℃15s；95℃15s。

分別以兩種上游引物進(jìn)行擴(kuò)增，當(dāng)特異性引物與模板完全匹配時(shí)，引物可以正常延伸，產(chǎn)生擴(kuò)增曲線；當(dāng)特異性引物與模板不能匹配時(shí)，引物不能延伸，不能產(chǎn)生擴(kuò)增曲線。由此，可以對(duì)模板中的snp位點(diǎn)起到檢測(cè)作用。

上述技術(shù)方案可以通過(guò)設(shè)計(jì)分子信標(biāo)探針替代熒光染料，此時(shí)，所述步驟s3包括如下步驟：

s3.1：對(duì)目的基因通過(guò)as-pcr進(jìn)行位點(diǎn)識(shí)別；

s3.2：分子信標(biāo)擴(kuò)增：利用兩條分子信標(biāo)探針對(duì)步驟s3.1中得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

s3.3：信號(hào)產(chǎn)生：將反向引物結(jié)合到步驟s3.2中得到的擴(kuò)增產(chǎn)物上，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，使分子信標(biāo)的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分開(kāi)，從而產(chǎn)生信號(hào)。

第一輪pcr用于識(shí)別等位基因，產(chǎn)生大量帶有等位基因通用標(biāo)簽的pcr產(chǎn)物；第二輪pcr是以分子信標(biāo)探針作為引物，結(jié)合到通用標(biāo)簽序列部分，進(jìn)行pcr擴(kuò)增；第三輪pcr通過(guò)反向引物擴(kuò)增，將分子信標(biāo)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開(kāi)，使分子信標(biāo)的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分開(kāi)，從而產(chǎn)生信號(hào)。

進(jìn)一步地，所述f1引物的5`端連接有通用標(biāo)簽1，所述f2引物的5`端連接有通用標(biāo)簽2，所述通用標(biāo)簽1和所述通用標(biāo)簽2的堿基序列如下：

通用標(biāo)簽1：5`gaaggtgaccaagttcatgct3`；

通用標(biāo)簽2：5`gaaggtcggagtcaacggatt3`。

進(jìn)一步地，兩條所述分子信標(biāo)探針的3`端引物序列分別與通用標(biāo)簽1和通用標(biāo)簽2的序列相同，5`端分別標(biāo)記fam和hex作為熒光基團(tuán)，中間均標(biāo)記dabcyl作為淬滅基團(tuán)。

進(jìn)一步地，所述步驟s3中pcr反應(yīng)體系中包括如下成分：

模板dna0.2ng/μl、f1引物0.5μm、f2引物0.5μm、r引物0.5μm、分子信標(biāo)beacon-fam0.5μm、分子信標(biāo)beacon-hex0.5um、dntp0.2mm以及taqdna聚合酶0.02u/μl；

所述pcr的反應(yīng)條件如下：

(1)預(yù)變性：94℃5min；

(2)擴(kuò)增：94℃20s，58℃30s，共36個(gè)循環(huán)。

將三輪pcr所需的試劑合在一個(gè)反應(yīng)體系中，通過(guò)上述反應(yīng)條件，即可通過(guò)一次pcr達(dá)到三輪pcr的效果。

本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明提供了一種硫代修飾引物及應(yīng)用該引物的snp檢測(cè)方法，pcr過(guò)程中采用高保真dna聚合酶，提高了對(duì)特異性引物的識(shí)別能力，同時(shí)對(duì)引物進(jìn)行硫代修飾，避免了高保真酶將不匹配的堿基切下來(lái)，提高檢測(cè)方法的特異性；實(shí)時(shí)定量檢測(cè)中，通過(guò)擴(kuò)增曲線可以判定是否有非特異性擴(kuò)增，利用△ct判定分型結(jié)果，可以避免終點(diǎn)定量因非特異性擴(kuò)增造成假陽(yáng)性的問(wèn)題，具有較高的準(zhǔn)確度和靈敏性；該方法還可以借助分子信標(biāo)探針替代核酸染料，并將三步pcr擴(kuò)增合為一步反應(yīng)，以此達(dá)到同樣的效果，可以提高該方法的可行性，為實(shí)驗(yàn)操作提供了多種選擇。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)驗(yàn)例1中擴(kuò)增曲線1的示意圖；

圖2為實(shí)驗(yàn)例1中擴(kuò)增曲線2的示意圖；

圖3為實(shí)驗(yàn)例1中擴(kuò)增曲線1與擴(kuò)增曲線2的對(duì)比情況；

圖4為實(shí)驗(yàn)例2中擴(kuò)增結(jié)果示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1

一種利用堿基錯(cuò)配擴(kuò)增的snp檢測(cè)方法，包括如下步驟：

s1：以人基因組snp位點(diǎn)rs642431為目的基因,設(shè)計(jì)并合成用于擴(kuò)增目的基因的特異性引物，所述位點(diǎn)堿基序列如下：

所述引物的堿基序列如下：

f1：5`cggcacaccagtgtgtgtct*t3`；

r：5`attctgggaaccagggaagatgtgg3`；

其中f1引物經(jīng)過(guò)硫代修飾，硫代修飾的位點(diǎn)為3`端倒數(shù)第一和倒數(shù)第二個(gè)堿基之間的磷酸二酯鍵；

s2：用所述引物對(duì)目的基因進(jìn)行pcr擴(kuò)增，具體反應(yīng)體系如下；

模板dna10ng、f1引物0.5μm、r引物0.5μm、dntp0.2mm、pfu高保真dna聚合酶1u以及2.5μl的sybrgreen(20×)，補(bǔ)充ddh2o至終體積50μl；

反應(yīng)條件如下：

(1)預(yù)變性：98℃3min；

(2)擴(kuò)增：98℃10s，58℃30s，共40個(gè)循環(huán)；

(3)擴(kuò)增曲線：95℃15s；60℃15s；95℃15s；

s3：對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

實(shí)施例2

一種利用堿基錯(cuò)配擴(kuò)增的snp檢測(cè)方法，包括如下步驟：

s1：以人基因組snp位點(diǎn)rs642431為目的基因(堿基序列同實(shí)施例1),設(shè)計(jì)并合成用于擴(kuò)增目的基因的特異性引物，所述引物的堿基序列如下：

f2：5`cggcacaccagtgtgtgtct*g3`；

r：5`attctgggaaccagggaagatgtgg3`；

其中f2引物經(jīng)過(guò)硫代修飾，硫代修飾的位點(diǎn)為3`端倒數(shù)第一和倒數(shù)第二個(gè)堿基之間的磷酸二酯鍵；

s2：用所述引物對(duì)目的基因進(jìn)行pcr擴(kuò)增，具體反應(yīng)體系如下；

模板dna10ng、f2引物0.5μm、r引物0.5μm、dntp0.2mm、pfu高保真dna聚合酶1u以及2.5μl的sybrgreen(20×)，補(bǔ)充ddh2o至終體積50μl；

反應(yīng)條件如下：

(1)預(yù)變性：98℃3min；

(2)擴(kuò)增：98℃10s，58℃30s，共40個(gè)循環(huán)；

(3)擴(kuò)增曲線：95℃15s；60℃15s；95℃15s；

s3：對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

實(shí)施例3

一種利用堿基錯(cuò)配擴(kuò)增的snp檢測(cè)方法，包括如下步驟：

s1：以人基因組snp位點(diǎn)rs645112為目的基因,設(shè)計(jì)并合成用于擴(kuò)增目的基因的特異性引物和分子信標(biāo)探針，所述位點(diǎn)堿基續(xù)列如下：

其中f1引物和f2引物的5`端分別連接有通用標(biāo)簽1和通用標(biāo)簽2，連接有通用標(biāo)簽的引物序列如下：

f1`：5`gaaggtgaccaagttcatgcttggaaaacagaagcactaagttctt3`；

f2`：5`gaaggtcggagtcaacggatttggaaaacagaagcactaagttctg3`。

r：5`cacaaagatgatagaaattaagatttcaatggc3`；

兩條分子信標(biāo)探針的3`端引物序列分別與通用標(biāo)簽1和通用標(biāo)簽2的序列相同，所述分子信標(biāo)探針的堿基序列如下：

beacon-fam：fam-5`acgcgaagttaagacctatgcgcgt3`(dabcyl)gaaggtgaccaagttcatgct-磷酸化；

beacon-hex：hex-5`acgcgaagttaagacctatgcgcgt3`(dabcyl)gaaggtcggagtcaacggatt-磷酸化。

s2：用所述引物和分子信標(biāo)探針對(duì)目的基因進(jìn)行pcr擴(kuò)增，具體反應(yīng)體系如下；

模板dna10ng、f1引物0.5μm、f2引物0.5μm、r引物0.5μm、分子信標(biāo)beacon-fam0.5μm、分子信標(biāo)beacon-hex0.5μm、dntp0.2mm以及taqdna聚合酶1u，補(bǔ)充ddh2o至終體積50μl；

反應(yīng)條件如下：

(1)預(yù)變性：94℃5min；

(2)擴(kuò)增：94℃20s，58℃30s，共36個(gè)循環(huán)。

s3：對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

實(shí)驗(yàn)例1

提取目的基因，分別按照實(shí)施例1和實(shí)施例2中提供的方法對(duì)目的基因進(jìn)行snp檢測(cè)，并分別進(jìn)行多個(gè)平行實(shí)驗(yàn)；以實(shí)施例1的多個(gè)平行實(shí)驗(yàn)生成擴(kuò)增曲線1，以實(shí)施例2的多個(gè)平行實(shí)驗(yàn)生成擴(kuò)增曲線2，并進(jìn)行比較。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1～3所示，由于f1引物與模板能匹配，而f2引物與模板不能匹配，因此以f2作為上游引物的pcr擴(kuò)增受到抑制，其擴(kuò)增曲線的ct值比以f1為上游引物時(shí)更大，并且△ct＞3，因此認(rèn)為該位點(diǎn)為純合。

實(shí)驗(yàn)例2

提取目的基因，按照實(shí)施例3中提供的方法對(duì)目的基因進(jìn)行snp檢測(cè)，并進(jìn)行多次平行實(shí)驗(yàn)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，靠近y軸的數(shù)據(jù)點(diǎn)最多，占所有數(shù)據(jù)點(diǎn)中的一半，靠近x軸的數(shù)據(jù)點(diǎn)和趨向坐標(biāo)中間的數(shù)據(jù)點(diǎn)的數(shù)量接近。表明該snp位點(diǎn)上g的純合子較多，t的純合子以及g-t雜合子也有檢出。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。