亨廷頓蛋白的磷酸化修飾方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種亨廷頓蛋白的磷酸化修飾方法，包括以下步驟：（1）、獲取重組蛋白Htt（1-90）：a、亨廷頓蛋白基因的獲得；b、重組表達質(zhì)粒pTWIN1-htt的構(gòu)建；c、表達亨廷頓蛋白的重組大腸桿菌菌株DH5α-htt的構(gòu)建；d、重組蛋白的表達；（2）、重組蛋白Htt（1-90）的純化；（3）、SPPS方法獲得磷酸化修飾的Htt（Cys-K92-K158）多肽；（4）Htt（Cys-K92-K158）多肽的純化；（5）Htt（Cys-K92-K158）多肽與重組蛋白Htt（1-90）經(jīng)過偶聯(lián)獲得經(jīng)磷酸化修飾目的蛋白Htt（1-158）；（6）經(jīng)磷酸化修飾目的蛋白Htt（1-158）的純化。經(jīng)磷酸化修飾后的亨廷頓蛋白的凝聚性降低，凝聚時間、凝聚后的長度和高度都有所改善，明顯延緩了蛋白質(zhì)的凝聚性，很好的阻礙了亨廷頓蛋白對神經(jīng)細胞的毒副作用。
【專利說明】亨廷頓蛋白的磷酸化修飾方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾，具體涉及一種亨廷頓蛋白的磷酸化修飾方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)修飾是一個復(fù)雜的過程，在真核生物中修飾類型很多，常見的有糖基化、乙?；?、泛素化、磷酸化和SUMO化，蛋白質(zhì)修飾能夠改變蛋白質(zhì)的活性、定位或功能。蛋白質(zhì)的磷酸化作為蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要方式，是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能的最基本、最普遍也是最重要的機制。蛋白質(zhì)的磷酸化主要發(fā)生在兩種氨基酸上，一種是絲氨酸(Thr )和色氨酸(Ser )，另一種是酪氨酸。蛋白質(zhì)的磷酸化影響蛋白質(zhì)的折疊和凝聚，從而影響其三級結(jié)構(gòu)，進而影響蛋白質(zhì)的功能，尤其是對一些激酶(多是磷酸化蛋白)。因此研究蛋白質(zhì)的磷酸化對人類生命健康有重要的意義。
[0003]亨廷頓舞蹈病(Huntington disease,HD)是一種常染色體顯性遺傳的神經(jīng)變性疾病，HD基因編碼一個由3144個氨基酸組成的亨廷頓蛋白(Huntingtin，Htt)，從Htt氨基酸末端第17位開始有一段重復(fù)的谷氨酰胺(CAG)序列。CAG重復(fù)序列將產(chǎn)生兩個直接結(jié)果:一是使野生型亨廷頓蛋白(wild huntingtin, wHtt)缺失,二是產(chǎn)生突變型亨廷頓蛋白(mutant Htt,mHtt)。隨著多聚谷氨酰胺的過度延長,Htt蛋白會在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的作用下發(fā)生交聯(lián)而形成聚集體，在主鏈和側(cè)鏈酰胺基之間氫鍵連接的作用下，多聚谷氨酰胺序列可形成多聚物，稱為多聚谷氨酰胺序列(PolyQ)。正常人的PolyQ長度小于35個，而HD患者的PolyQ長度會超過37個。這些異常蛋白質(zhì)積聚成塊，損壞部分腦細胞，特別是那些與肌肉控制有關(guān)的細胞，導(dǎo)致患者神經(jīng)系統(tǒng)逐漸退化，神經(jīng)沖動彌散，動作失調(diào)，出現(xiàn)不可控制的顫搐，并能發(fā)展成癡呆，甚至死亡。臨床表現(xiàn)主要為舞蹈樣不自主動作、精神障礙和進行性癡呆。
[0004]沒有修飾的亨廷頓蛋白顯示出比較容易凝聚等，目前國內(nèi)還沒有研究所或者機構(gòu)對亨廷頓蛋白進行化學(xué)修飾。通過對亨廷頓蛋白磷酸化化學(xué)修飾顯示出蛋白的凝聚性降低，凝聚時間、凝聚后的長度和高度都有所改善，明顯延緩了蛋白質(zhì)的凝聚性，很好的阻礙了亨廷頓蛋白對神經(jīng)細胞的毒副作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種亨廷頓蛋白的磷酸修飾方法,通過對亨廷頓蛋白的磷酸化化學(xué)修飾,顯示出經(jīng)磷酸化修飾后的亨廷頓蛋白的凝聚性降低，凝聚時間、凝聚后的長度和高度都有所改善，明顯延緩了蛋白質(zhì)的凝聚性，很好的阻礙了亨廷頓蛋白對神經(jīng)細胞的毒副作用。
[0006]本發(fā)明的目的可通過下列技術(shù)方案來實現(xiàn):一種亨廷頓蛋白的磷酸化修飾方法，包括以下步驟:(1)、獲取重組蛋白 Htt (1-90):a、亨廷頓蛋白基因的獲得；b、重組表達質(zhì)SpTWINl-Aii的構(gòu)建；c、表達亨廷頓蛋白的重組大腸桿菌菌株DH5a-htt的構(gòu)建；d、重組蛋白的表達；(2)、重組蛋白Htt (1-90)的純化；(3)、SPPS方法獲得磷酸化修飾的Htt(Cys-K92-K158)多肽；(4) Htt (Cys_K92_K158)多肽的純化；(5) Htt (Cys_K92_K158)多肽與重組蛋白Htt (1-90)經(jīng)過偶聯(lián)獲得經(jīng)磷酸化修飾目的蛋白Htt (1-158); (6)經(jīng)磷酸化修飾目的蛋白Htt (1-158)的純化。 [0007] 作為優(yōu)選，所述步驟(1)中:a、亨廷頓蛋白基因的獲得:以質(zhì)粒pcDNA3.1/mys-His為模板，設(shè)計合成含有I和I限制酶切位點的上下游引物Pl和P2，PCR擴增力--基因片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收，純化處理后與載體pMDlS-T連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109中，通過氨芐青霉素抗性篩選，得到重組質(zhì)粒pMD18T-Ai?，送至上海生工生物工程有限公司測序。將驗證后的重組質(zhì)粒用I和I雙酶切處理，酶切產(chǎn)物純化處理后置4°C冰箱保存；b、重組表達質(zhì)粒pTWINl-htt的構(gòu)建:將原核表達載體pTWINl用限制性內(nèi)切酶I和I雙酶切，純化處理后將線性pTWINl質(zhì)粒片段和Aii基因片段進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109中，經(jīng)過氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆子，提取質(zhì)粒并進行酶切鑒定，得到重組質(zhì)粒pTWINl-Α-- ;c、表達亨廷頓蛋白的重組大腸桿菌菌株DH5 a -htt的構(gòu)建:用電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pTWINl-Α--轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞中，利用氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆子，得到重組菌DH5a_Aii。
[0008]將重組菌DH5a-Aii接種至LB液體培養(yǎng)基，置37 °C搖床過夜培養(yǎng)。吸取過夜培養(yǎng)菌體以5%接種量接種LB液體培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng)至0D600=0.5^0.7，然后置20°C搖床培養(yǎng)加入lmmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達目的蛋白4~6h,離心收集菌體。在40mmol/L的TRIS-Acetate>5mmol/L pH=8.3的溶液中進行超聲破碎。通過離心(23000X g, 30 min,40°C)將細胞碎片和上清液分離開來。粗Htt (1-90)多肽純度為60%。
[0009]進一步地，所述的步驟(3)中合成Htt (Cys-K92_K158)多肽的過程分為三個片段合成:a、首先合成Cys-K92-1108片段；b、再合成CyS-E110_L136片段；C、最后合成Cys-S138-K158片段；d、每個片段通過自然化學(xué)連接NCL或EPL方法連接得到Htt(Cys-K92-K158)多肽。
[0010]進一步地，所述步驟(3)中磷酸化修飾位于亨廷頓外顯子2或外顯子3區(qū)域，即S95位點、T97位點、T107位點、SI 16位點、S120位點、S138位點和S143位點中的至少一個位點。
[0011]進一步地,合成Cys-K92_I108片段所用的固相載體是wang —樹脂。
[0012]進一步地，合成Cys-E110-L136片段和Cys-S138_K158片段所用的固相載體是N-?；?苯并咪唑酮樹脂。
[0013]經(jīng)磷酸化修飾的亨廷頓蛋白與野生型亨廷頓蛋白比較，具有以下優(yōu)點:野生型亨廷頓蛋白的纖維聚集速度遠大于經(jīng)磷酸化修飾過的Httl-158蛋白，即說明磷酸化修飾Httl-158能夠明顯抑制蛋白質(zhì)的凝聚；經(jīng)磷酸化修飾后的亨廷頓凝聚時間、凝聚后的長度和高度都有所改善，明顯延緩了蛋白質(zhì)的凝聚性，很好的阻礙了亨廷頓蛋白對神經(jīng)細胞的毒副作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為獲得Httl-90重組蛋白的流程圖；
圖2為SPPS方法獲得磷酸化的Htt (Cys-K92-K158)蛋白流程圖；圖3為經(jīng)磷酸化修飾目的蛋白Htt (1-158)的合成流程圖；
圖4:A為HttCys-K92-K158蛋白序列和合成片段；
B為Htt (Cys-K92-K158)多肽磷酸化修飾位點；
圖5為TEM對野生型和修飾型Htt (1-158)蛋白凝聚反應(yīng)檢測；
圖6為AFM對野生型和修飾型Htt (1-158)蛋白聚集反應(yīng)檢測；
圖7所示:表示的是野生型和磷酸化修飾后的Htt蛋白的平均高度(左圖)和長度(右圖)分布情況；
圖8表示的是HttWT和磷酸化修飾后的Httl-158經(jīng)過Ih的培養(yǎng)，纖維物質(zhì)的高度和直徑數(shù)目比較情況；
圖9表示的是野生型Htt-WT和磷酸化修飾后的Httl-158經(jīng)過7D的培養(yǎng)，纖維物質(zhì)的高度和直徑數(shù)目比較情況。
具體實施例
[0015]實施例1:獲得重組蛋白Httl-90 一)試驗材料
(I)載體和菌株
質(zhì)粒pcDNA3.1/mys-His由CHDI惠贈；表達載體pTWINl購自NEB公司；質(zhì)粒pMD18_T和大腸桿菌JM109、DH5a`購自Takara生物科技有限公司。
[0016](2)弓丨物
Pl:5-CCGGAATTCCTGCCGTGCC-3 (EcoR I)
P2: 5-AAAACTGCAGACAGCCGGGC-3 (Pst I)
由上海生工生物工程有限公司合成。
[0017]二)實施方案
1.亨廷頓蛋白基因的獲得
以質(zhì)粒pcDNA3.Ι/mys-His為模板，設(shè)計合成含有I和I限制酶切位點的上下游引物Pl和P2，PCR擴增Aii基因片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收，純化處理后與載體PMD18-T連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109中，通過氨芐青霉素抗性篩選，得到重組質(zhì)粒pMD18T-Aii，送至上海生工生物工程有限公司測序。將驗證后的重組質(zhì)粒用I和I雙酶切處理，酶切產(chǎn)物純化處理后置4°C冰箱保存。
[0018]2.重組表達質(zhì)粒pTWINl-Α--的構(gòu)建
將原核表達載體pTWINl用限制性內(nèi)切酶I和Pst I雙酶切，純化處理后將線性PTffINl質(zhì)粒片段和Ai?基因片段進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109中，經(jīng)過氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆子，提取質(zhì)粒并進行酶切鑒定，得到重組質(zhì)粒pTWINl-Α--。
[0019]3.表達亨廷頓蛋白的重組大腸桿菌菌株的構(gòu)建
采用電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pTWINl-Α--轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞中，利用氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆子，得到重組菌DH5 a -htt。
[0020]將重組菌DH5a-Aii接種至LB液體培養(yǎng)基，置37°C搖床過夜培養(yǎng)。吸取過夜培養(yǎng)菌體以5%接種量接種LB液體培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng)至0D600=0.5^0.7，然后置20°C搖床培養(yǎng)加入lmmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達目的蛋白4~6h,離心收集菌體。在40mmol/L的TRIS-Acetate>5mmol/L pH=8.3的溶液中進行超聲破碎。通過離心(23000X g, 30 min,40°C)將細胞碎片和上清液分離開來。粗多肽純度為60%。獲得重組蛋白Httl-90操作示意圖如圖1所示。
[0021]實施例2:重組蛋白Htt (1-90)的純化
Httl-90-1ntein-CBD融合蛋白中CBD成分可與幾丁質(zhì)樹脂特異結(jié)合，從而便于去除雜蛋白，隨后intein成分在一定條件下催化融合蛋白在httl-90和intein之間發(fā)生斷裂。
[0022]具體操作如下:將上清液上樣于2ml幾丁質(zhì)重力柱。柱子先經(jīng)過A液(Na-HEPES(pH8.0) 20mmol/L, NaCl 500mmol/L, EDTA lmmol/L)進行平衡，上清液上樣后，再以 A 液洗脫。然后柱子在 B 液(Na-HEPES (pH8.0) 20mmol/L, NaCl 500mmol/L, EDTA lmmol/L, DTT50mmol/L)中 40°C下浸泡 16h。C 液(Na-HEPES (pH8.0) 20mmol/L, NaCl 500mmol/L)洗脫蛋白，每Iml收集。將每步收集到的樣品進行SDS-PAGE分析，鑒定蛋白質(zhì)的純度是90%。
[0023]洗脫蛋白溶液中加入含有0.25mmol/L pH7.8 MESNA的溶液，室溫搖床切割3次，每次24h。收集切割液加I倍體積的HEPES Buffer慢速沖洗柱子，合并二次洗脫液，最后一次切割液加壓吹干并回收樹脂。將蛋白洗脫液移至超濾管，10000r/min離心15_30min，超濾至1.5ml時移液槍轉(zhuǎn)移上層蛋白液，得到純度為99%的重組多肽2g，_4°C凍存。
[0024]實施例3 =SPPS方法獲得位于S95位點磷酸化修飾的Htt (Cys-K92_K158)多肽 本合成過程分為三個片段，首先合成Cys-S138-K158片段；再合成CyS-E110_L136片
段；最后合成Cys-K92-1108片段；每個片段通過自然化學(xué)連接NCL或EPL方法連接得到Htt(Cys-K92-K158)多肽。
[0025]固相肽的合成是在CS336X的多肽合成儀上進行的，Cys-S138_K158多肽的合成是基于Wang樹脂。樹脂的去保護和解聚在(TFA/DCM/H20/TIPS 90/5/2.5/2.5)溶液中能夠自發(fā)進行。然后通過10倍當(dāng)量的冷乙醚對其沉淀，這些原始多肽通過反相HPLC進行純化，使用waters 600泵和waters 2489紫外/可見光檢測器，柱子采用GRACE-Vydac 218TP54C18柱。流動相A是0.1%的三氟乙酸水溶液，流動相B是0.1%三氟乙酸乙腈溶液，多肽的檢測波長是214nm和234nm。多肽的質(zhì)量通過MALD1-TOF-MS和ES1-MSF分析。最終得到18mg、純度為99%的Cys-S138-K158多肽，產(chǎn)率為50%。
[0026]Cys-El 10-L136多肽合成基于NBZ樹脂，在多肽的C端產(chǎn)生一個NBZ衍生結(jié)構(gòu)方便進行NCL反應(yīng)。NBZ樹脂最初的制備是通過氨基酸化的MBHA樹脂和去保護的Fmoc與5倍當(dāng)量的D1-Fmoc-3，4二氨基苯甲酸偶聯(lián)得到的。多肽的延長通過Fmoc保護的氨基酸，當(dāng)DIPEA濃度達到0.5mol/L時,Dbz與4-硝基苯基氯甲酸酯f禹合時在分子內(nèi)形成環(huán)狀。最后通過鍵的斷裂得到的多肽，合成的多肽N端采用賽唑燒保護,在methoxyamine HCl pH4.0條件下噻唑烷化學(xué)鍵斷裂形成巰基。純化步驟同上。最終得到16mg、純度為99%的Cys-E110-L136多肽，產(chǎn)率為55%。[0027]Cys-K92-1108合成與E110-L136多肽合成類似，多肽的固態(tài)合成基于NBZ樹脂，在多肽的C端產(chǎn)生一個NBZ衍生結(jié)構(gòu)方便進行NCL反應(yīng)。S95位的絲氨酸過羥基先經(jīng)磷酸化，磷酸基團通過芐基保護，氨基Fmoc保護，通過固肽合成得到K92-1108-pS95多肽。最后合成的多肽在N端賽唑燒保護和C端NBZ衍生結(jié)構(gòu),在methoxyamine HCl pH4.0條件下噻唑烷化學(xué)鍵斷裂形成巰基，純化步驟同上。最終得到13mg、純度為99%的Cys-E110-L136多肽，產(chǎn)率為56%。S95位點磷酸化修飾的Htt (Cys-K92-K158)多肽合成示意圖如圖2所示。[0028]實施例4:位于S95位點經(jīng)磷酸化修飾的Htt (Cys-K92_K158)多肽的純化
多肽的鑒定和純化通過重新注入反相色譜，此時檢測器是二極管陣列檢測器，流動相同。流動相A是0.1%的三氟乙酸水溶液，流動相B是0.1%三氟乙酸乙腈溶液，多肽的檢測波長是214nm和234nm。最終得到7.23mg的HttCys-K92_K158蛋白，產(chǎn)率為15.4%。
[0029]實施例5:Htt (Cys-K92_K158)多肽與重組蛋白Htt (1_90)經(jīng)過偶聯(lián)獲得經(jīng)磷酸化修飾目的蛋白Htt (1-158)
將重組蛋白Httl-90和位于S95位點經(jīng)磷酸化修飾的Htt (Cys-K92-K158)多肽放入緩沖液中，利用巰基和硫酯的特異性反應(yīng)，再經(jīng)過由S到N的轉(zhuǎn)變完成肽鍵的合成。其合成不意圖如圖3。
[0030]實施例6:目的蛋白Htt (1-158)的純化
NCL反應(yīng)后的Httl-158產(chǎn)物通過反相高效液相色譜純化，純化柱是C0SM0SIL5C4-AR-300 (4.6mm*150mm 5 μ m)，線性梯度是10_90%，產(chǎn)物洗脫是在55%梯度下，得到產(chǎn)物
5.2mg(0.5 μ mo I, 33%)，通過MALDI計算產(chǎn)物的分子量。通過超高效液相色譜UPLC評定產(chǎn)物的純度。
[0031]實施例7:野生型和磷酸化修飾的Httl-158蛋白的凝聚性能比較
樣品制備方法:兩個樣品分別溶解在50 μ mol的lOmmol/LTris 75mmol/L NaCl pH7.4的溶液中，然后IOOKDa透過膜，37°C去除聚集的培養(yǎng)物。
[0032]如圖5為TEM對野生型和修飾型Httl-158蛋白凝聚反應(yīng)檢測，圖6為AFM對野生型和修飾型Httl-158蛋白聚集檢測。
[0033]結(jié)果分析:在第一個小時的培育后，在野生型樣品中出現(xiàn)球狀聚集體，此時修飾過的Httl-158仍然只有小的單體；7天后，野生型的單體開始聚集成纖維結(jié)構(gòu)，有明顯的纖維狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，但是經(jīng)過修飾的Httl-158，培養(yǎng)7天后和培養(yǎng)Ih的相比，仍然沒有纖維狀結(jié)構(gòu)；培養(yǎng)到14天的時候，Htt-WT出現(xiàn)較多的纖維結(jié)構(gòu)，已經(jīng)看不到單體的存在，經(jīng)過修飾的Httl-158開始出現(xiàn)纖維狀結(jié)構(gòu)，并且纖維尺寸和培養(yǎng)7天后的Htt-Wt長度相當(dāng)。這些結(jié)果說明Htt-WT纖維聚集的速度遠大于修飾過的Httl-158，說明pS95磷酸化修飾Httl-158能夠明顯抑制蛋白質(zhì)的凝聚。
[0034]實施例8:野生型和磷酸化修飾的Httl-158蛋白的培養(yǎng)結(jié)果比較
如圖7所示:表示的是野生型和磷酸化修飾后的Htt蛋白的平均高度(左圖)和長度(右圖)分布情況。
[0035]從圖7中可以看出:培養(yǎng)14天后的平均高度,野生型的Htt在3.5nm_6nm區(qū)間較多，而磷酸化的Htt在1.5nm-3nm之間較多；同時，野生型的長度大于磷酸化的長度，長度小于200nm磷酸化修飾后的Htt比野生型多。說明磷酸化修飾后的Htt明顯降低了自身凝聚性。
[0036]圖8表示的是HttWT和磷酸化修飾后的Httl-158經(jīng)過Ih的培養(yǎng)，纖維物質(zhì)的高度和直徑數(shù)目比較情況。
[0037]從圖8中可以看出:野生型Htt在Ih時，高度沒有明顯區(qū)別，而野生型的Htt直徑比磷酸化修飾的直徑 大，野生型Htt出現(xiàn)直徑大約lOOnm，而磷酸化最大直徑?jīng)]有超過50nm,但是磷酸化修飾的Htt直徑小于50nm的直徑較多。
[0038]圖9表示的是野生型Htt-WT和磷酸化修飾后的Httl-158經(jīng)過7D的培養(yǎng)，纖維物質(zhì)的高度和直徑數(shù)目比較情況。
[0039]從圖9中可以看出:野生型和磷酸化修飾的Htt經(jīng)過7天培養(yǎng)后，磷酸化修飾的Httl-15高度和數(shù)目都比野生型大。野生型的Htt直徑在50nm以下的數(shù)目較少，主要原因是已經(jīng)形成大于直徑150nm的纖維狀物質(zhì)，此時磷酸化的Htt開始出現(xiàn)直徑比較大的顆粒型物質(zhì)，數(shù)目較多。
[0040]綜上所述，經(jīng)磷酸化修飾的(1-158)能夠明顯抑制亨廷頓蛋白的凝聚，其抑制速率按照經(jīng)顯微鏡纖維長度和直`徑大小的分析數(shù)據(jù)，大概在2-5倍左右。
【權(quán)利要求】
1.一種亨廷頓蛋白的磷酸化修飾方法，其特征在于，包括以下步驟:(1)、獲取重組蛋白Htt (1-90):a、亨廷頓蛋白基因的獲得；b、重組表達質(zhì)粒pTWINl-Α--的構(gòu)建；c、表達亨廷頓蛋白的重組大腸桿菌菌株DH5a -htt的構(gòu)建；d、重組蛋白的表達；(2)、重組蛋白Htt (1-90)的純化；(3),SPPS方法獲得磷酸化修飾的Htt (Cys-K92_K158)多肽；(4) Htt(Cys-K92-K158)多肽的純化；(5) Htt (Cys-K92_K158)多肽與重組蛋白 Htt (1-90)經(jīng)過偶聯(lián)獲得經(jīng)磷酸化修飾目的蛋白Htt (1-158); (6)經(jīng)磷酸化修飾目的蛋白Htt (1-158)的純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亨廷頓蛋白的磷酸化修飾方法，其特征在于，所述步驟(1)中:a、亨廷頓蛋白基因的獲得:以質(zhì)粒pcDNA3.1/mys-His為模板，設(shè)計合成含有I和I限制酶切位點的上下游引物Pl和P2，PCR擴增Aii基因片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收，純化處理后與載體PMD18-T連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109中，通過氨芐青霉素抗性篩選，得到重組質(zhì)粒pMD18T-Aii，送至上海生工生物工程有限公司測序；將驗證后的重組質(zhì)粒用I和I雙酶切處理，酶切產(chǎn)物純化處理后置4°C冰箱保存；b、重組表達質(zhì)粒pTWINl-htt的構(gòu)建:將原核表達載體pTWINl用限制性內(nèi)切酶I和Pst I雙酶切，純化處理后將線性pTWINl質(zhì)粒片段和Aii基因片段進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109中，經(jīng)過氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆子，提取質(zhì)粒并進行酶切鑒定，得到重組質(zhì)粒pTWINl-Α-- ;c、表達亨廷頓蛋白的重組大腸桿菌菌株DH5 a -htt的構(gòu)建:用電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pTWINl-Α--轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞中，利用氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆子，得到重組菌DH5 a -htt ;將重組菌DH5 a -htt接種至LB液體培養(yǎng)基，置37°C搖床過夜培養(yǎng)；吸取過夜培養(yǎng)菌體以5%接種量接種LB液體培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng)至0D600=0.5~0.7，然后置20°C搖床培養(yǎng)加入lmmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達目的蛋白4~6h，離心收集菌體；在40mmol/L的TRIS_Acetate、5mmol/L pH=8.3的溶液中進行超聲破碎；通過離心(23000Xg，30 min, 40°C )將細胞碎片和上清液分離開來，粗Htt (1_90)多肽純度為60%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亨廷頓蛋白的磷酸化修飾方法，其特征在于，所述的步驟(3)中合成Htt (Cys-K92-K158)多肽的過程分為三個片段合成:a、首先合成Cys-S138_K158片段；b、再合成Cys-E110-L136片段；C、最后合成CyS-K92_I108片段；d、每個片段通過自然化學(xué)連接NCL或_EPL方法連接得到Htt (Cys-K92-K158)多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亨廷頓蛋白的磷酸化修飾方法，其特征在于，所述步驟(3)中磷酸化修飾位于亨廷頓外顯子2或外顯子3區(qū)域，即S95位點、T97位點、T107位點、SI 16位點、S120位點、S138位點和S143位點中的至少一個位點。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的亨廷頓蛋白的磷酸化修飾方法，其特征在于，合成Cys-S138-K158片段所用的固相載體是wang樹脂。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亨廷頓蛋白的磷酸化修飾方法，其特征在于，合成Cys-El 10-L136片段和CyS-K92_I108片段所用的固相載體是N-?；?苯并咪唑酮樹脂。
【文檔編號】C07K1/107GK103601799SQ201310555345
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月11日
【發(fā)明者】王喆明 申請人:杭州拜善晟生物科技有限公司