本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及與杜氏鹽藻細(xì)胞抗鹽能力相關(guān)的mirna。

背景技術(shù)：

microrna(mirna)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼rna，其長度約為21-25個(gè)核苷酸。成熟mirna的產(chǎn)生是由較長的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本(pri-mirna)經(jīng)過一系列核酸酶的剪切加工而成的，隨后組裝進(jìn)rna誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式識(shí)別靶mrna，并根據(jù)互補(bǔ)程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mrna或者阻遏靶mrna的翻譯。研究表明mirna參與了生命過程中多種重要進(jìn)程，包括發(fā)育、細(xì)胞增殖和凋亡、細(xì)胞分化、脂肪代謝等等。目前在mirbase數(shù)據(jù)庫中收錄有人(homosapiens)的pre-mirna(mirna前體)1881條，小鼠(musmusculus)有1193條，大鼠(rattusnorvegicus)有495條，萊茵衣藻(chlamydomonasreinhardtii)有50條，而在杜氏鹽藻(dunaliellasalina，d.salina)中發(fā)現(xiàn)的mirna少之又少。杜氏鹽藻是一種比較獨(dú)特的高度耐鹽單細(xì)胞真核生物，屬綠藻門綠藻綱團(tuán)藻目多睫毛科。杜氏鹽藻細(xì)胞沒有細(xì)胞壁，具雙鞭毛而能游動(dòng)，含有一個(gè)較大的杯狀葉綠體能進(jìn)行光合作用；可在含有0.05m-5mnacl的鹽水中生長，抗逆性極佳，是一種較為理想的抗逆境生物。杜氏鹽藻細(xì)胞因含有豐富的β-胡蘿卜素而具有獨(dú)特經(jīng)濟(jì)價(jià)值。極其耐鹽的能力、簡單的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、便利的培養(yǎng)條件及豐富的營養(yǎng)價(jià)值使杜氏鹽藻成為進(jìn)行生物能源、耐鹽抗逆性等研究的重要模式生物和遺傳學(xué)研究的良好材料。mirna具有物種和組織特異性，最近幾年關(guān)于植物mirna的各類研究越來越多，例如抗旱、抗鹽等抗逆性研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明以杜氏鹽藻為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)了一些在mirbase數(shù)據(jù)庫中未被收錄的預(yù)測(cè)mirna，其核苷酸序列如seqidno.1-16所示。經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，其與杜氏鹽藻細(xì)胞抗鹽能力相關(guān)。

因此，本申請(qǐng)?zhí)峁┝诵碌呐c抗鹽脅迫相關(guān)的mirna序列。

在此基礎(chǔ)上，所述mirna的前體序列及其前體序列的編碼序列也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

經(jīng)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，前述mirna的表達(dá)量受到鹽脅迫的調(diào)節(jié)，且調(diào)節(jié)效果明顯，說明其在杜氏鹽藻適應(yīng)高鹽脅迫機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

所述試驗(yàn)研究具體為，通過對(duì)高鹽(含3.0mnacl)和低鹽(含0.75mnacl)培養(yǎng)條件下測(cè)序獲得的杜氏鹽藻樣品小rna序列進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并采用fisher精確檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，上述mirna與杜氏鹽藻細(xì)胞的抗鹽能力顯著相關(guān)。具體表現(xiàn)為：相對(duì)在低鹽環(huán)境中的表達(dá)量，上述其中一條mirna(seqidno.1)在高鹽環(huán)境中的表達(dá)量顯著降低(p<0.05)，其余15條mirna(seqidno.2-16)在高鹽環(huán)境中的表達(dá)量顯著升高(p<0.05)。

因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述mirna在杜氏鹽藻抗鹽脅迫中的應(yīng)用，以及其在培育耐鹽轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，具體為在所述轉(zhuǎn)基因植物中過表達(dá)所述mirna或抑制所述mirna的表達(dá)。

更進(jìn)一步地，基于前述研究及發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)本發(fā)明所述mirna的試劑也應(yīng)當(dāng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，所述試劑可用于判斷/檢測(cè)杜氏鹽藻細(xì)胞的抗鹽能力。

不僅如此，基于前述研究及發(fā)現(xiàn)，可從本發(fā)明提供的mirna(seqidno.1-16)中單獨(dú)取其中一個(gè)/多個(gè)進(jìn)行抗鹽脅迫研究，并且還能夠聯(lián)合目前已發(fā)現(xiàn)的mirna一起用于定制芯片，用于藻類或植物耐鹽抗逆性等研究。

因此，本發(fā)明還提供了一種mirna芯片，其可鑒定本發(fā)明所述的mirna是否表達(dá)，或檢測(cè)本發(fā)明所述mirna表達(dá)量的高低，但并不限于僅檢測(cè)本發(fā)明所提供的mirna。應(yīng)當(dāng)理解的是，只要所述mirna芯片可用于檢測(cè)本發(fā)明所述的mirna，該mirna芯片均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)并提供了新的與杜氏鹽藻細(xì)胞抗鹽能力相關(guān)的mirna，可以選取其中一個(gè)或多個(gè)進(jìn)行杜氏鹽藻抗鹽活動(dòng)的研究，并且還能夠與目前已發(fā)現(xiàn)的mirna一起用于定制芯片，用于藻類或植物耐鹽抗逆性等研究。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。需要理解的是以下實(shí)施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1、杜氏鹽藻細(xì)胞總rna的提取鑒定

確定杜氏鹽藻細(xì)胞生長狀態(tài)良好，收集培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的杜氏鹽藻細(xì)胞。將杜氏鹽藻細(xì)胞培養(yǎng)液移入離心管中，離心沉淀細(xì)胞，棄去上清液。按照rnaisoplus[寶生物工程(大連)有限公司，中國]說明提取杜氏鹽藻細(xì)胞總rna。將總rna進(jìn)行液相質(zhì)譜(lc)檢測(cè)并根據(jù)質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)判斷提取的總rna質(zhì)量是否滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。評(píng)價(jià)結(jié)果表明，其od260/280比值≥1.8，rin值≥7且rrna28s/18s比值≥0.7，以上結(jié)果說明提取的總rna質(zhì)量較好，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

實(shí)施例2、小rna測(cè)序文庫的構(gòu)建和測(cè)序?qū)嶒?yàn)

實(shí)驗(yàn)流程按照illumina公司提供的標(biāo)準(zhǔn)步驟執(zhí)行，包括制備文庫和測(cè)序?qū)嶒?yàn)。小rna測(cè)序文庫制備采用truseqsmallrnasampleprepkits(illumina，sandiego，usa)試劑盒。杜氏鹽藻細(xì)胞樣本提取總rna后，利用mirna的屬性，即5'端為磷酸基團(tuán)，3'端為羥基基團(tuán)。首先使用t4rna連接酶2將一個(gè)腺苷化單鏈dna3'接頭和5'接頭相繼連接到smallrna上，其中3'端接頭的5端為rapp，3端有氨基保護(hù)，所以能夠減少mirna的自連，t4rna連接酶2(truncated)在連接反應(yīng)時(shí)不需要atp，只需要預(yù)腺苷化的接頭，所以能夠減少mirna以及接頭序列的自連。5'端接頭被設(shè)計(jì)成可以捕獲帶有5'磷酸基團(tuán)的smallrna。帶有5'與3'連接接頭的smallrna序列，通過與3'端互補(bǔ)的rt引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，最后對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cdna序列進(jìn)行pcr擴(kuò)增。最后，對(duì)140-160bp長度范圍的pcr產(chǎn)物進(jìn)行6％polyacrylamidetris-borate-edta膠回收，從而完成整個(gè)文庫的制備工作。對(duì)構(gòu)建好的文庫使用illuminahiseq2500進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序讀長為單端1x50bp。

實(shí)施例3、數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)新的mirna

應(yīng)用聯(lián)川生物公司所提供mirna數(shù)據(jù)分析軟件acgt101-mir(lcsciences，houston，texas，usa)實(shí)施例2獲得的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。其總體分析流程簡言之，即原始序列通過illuminafastqc進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估，獲取q30數(shù)據(jù)后，通過一系列數(shù)據(jù)處理，將由于樣本制備、測(cè)序接頭、非典型mirna特征序列(在此我們稱為垃圾序列)以及測(cè)序儀器光學(xué)數(shù)碼處理而產(chǎn)生的非純序列(n特征序列)進(jìn)行清理；隨后，進(jìn)行長度篩選，保留堿基長度在18-25nt(植物)，再將剩余序列比對(duì)各種rna數(shù)據(jù)庫序列(不包含mirna)，如mrna、rfam(包含rrna，trna，snrna，snorna等)和重復(fù)序列數(shù)據(jù)庫(repbase)，并進(jìn)行過濾。將上述清理、去除過后所剩余的測(cè)序序列，通過bowtie比對(duì)到mirbase21.0中特定物種的前體上，鑒定該物種已知的mirna，同時(shí)發(fā)現(xiàn)新的5p或者3pmirna序列。在比對(duì)分析中，5'和3'末端長度變化以及序列內(nèi)部有一個(gè)錯(cuò)配的情況，在比對(duì)中被允許。其中，比對(duì)到該特定物種的成熟體序列部分mirna即為已知報(bào)道的mirna，而如果檢測(cè)到的序列能夠比對(duì)到已知mirna的對(duì)應(yīng)臂部位則可以被確定為新的5p或者3pmirna候選序列。未比對(duì)上的序列，再一次通過bowtie比對(duì)到mirbase21.0中其它選定物種的前體上，并且比對(duì)上的mirna前體序列通過進(jìn)一步比對(duì)上測(cè)序物種的基因組序列從而鑒定出該類已報(bào)道m(xù)irna。由于以上兩類鑒定出的mirna都來自mirbase數(shù)據(jù)庫已報(bào)道的序列，因而我們定義為已知的mirna。其它未比對(duì)到所選物種的前體的序列，使其進(jìn)一步與基因組比對(duì)，對(duì)于比對(duì)上的序列，則在基因組上相應(yīng)比對(duì)位點(diǎn)，通過堿基數(shù)目延伸(植物120nt)，并采用rnafold軟件(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/rnafold.cgi)進(jìn)行rna二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。最終得到16個(gè)尚未收錄于mirbase數(shù)據(jù)庫的預(yù)測(cè)的mirna，命名為seqidno.1～seqidno.16。

序列表

<110>新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院

<120>與杜氏鹽藻細(xì)胞抗鹽能力相關(guān)的mirna

<130>khp171110216.0tq

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