專利名稱：水稻根尖特異表達(dá)啟動(dòng)子Pro-Os02g54880及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種水稻根尖特異表達(dá)啟動(dòng)子Pro-0s02g54880及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
通過轉(zhuǎn)基因方法研究基因功能甚至改變重要作物的農(nóng)藝性狀已經(jīng)成為一種常用手段。以往人們利用組成型啟動(dòng)子啟動(dòng)相關(guān)基因的表達(dá)，但這種方法不僅過分消耗了植株能量，而且可能得不到期望的表型。將目標(biāo)基因以期望的水平在特定組織中表達(dá)對(duì)于研究基因功能、改良植物性狀是切實(shí)可行的。因此，選擇合適的器官特異啟動(dòng)子，有利于控制基 因在時(shí)間及空間上不同水平的表達(dá)，以減少過多的能量消耗以及不期望的其它性狀。植物根系在土壤養(yǎng)分吸收中起重要作用，并且能與土壤微生物相互作用、分泌抗病蟲物質(zhì)以抵抗病菌對(duì)植物的侵襲。更重要的是，根系能夠在各種非生物脅迫條件下保護(hù)地上部分，如干旱、酸性條件及重金屬。當(dāng)與養(yǎng)分吸收和耐脅迫相關(guān)的基因被特異的表達(dá)在根部細(xì)胞后，植物則會(huì)在營養(yǎng)匱乏及脅迫條件下正常生長。近些年，為了調(diào)控外源基因在轉(zhuǎn)基因株系中不同時(shí)間及空間的表達(dá)，研究者已經(jīng)克隆了很多具有不同器官或組織特異性的啟動(dòng)子。例如，從種子貯藏蛋白基因及非種子貯藏蛋白基因都克隆到了種子特異表達(dá)的啟動(dòng)子。幾種花器官特異的啟動(dòng)子也已被鑒定。雖然已有少數(shù)根部特異表達(dá)的啟動(dòng)子被克隆并應(yīng)用于基因功能的研究，但這些啟動(dòng)子中大部分只是在根部表達(dá)較強(qiáng)，并不完全特異在根中表達(dá)。另外，能夠在水稻根尖特異表達(dá)的啟動(dòng)子更是鮮為人知。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供水稻根尖特異表達(dá)啟動(dòng)子Pro-0s02g54880及其應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的水稻根尖特異表達(dá)啟動(dòng)子Pro-0s02g54880，其具有i) SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列；或ii) SEQ ID No. I所示核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸且同等功能的由i)衍生的核苷酸序列。本發(fā)明還提供含有上述啟動(dòng)子的載體、含有上述啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系以及含有上述啟動(dòng)子的工程菌。本發(fā)明還提供含有上述啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因株系。本發(fā)明還提供水稻根尖特異表達(dá)啟動(dòng)子Pro-0s02g54880在調(diào)控下游基因表達(dá)中的應(yīng)用，優(yōu)選下游基因?yàn)镚US基因、GFP基因、LUC基因等報(bào)告基因，或CKX基因、OsNAC IO基因等目標(biāo)基因。優(yōu)選下游基因?yàn)镃KX基因或OsNACIO基因。當(dāng)下游基因?yàn)镃KX基因或OsNACIO基因時(shí)，可促進(jìn)水稻根系生長并提高水稻抗旱能力。將水稻基因0s02g54880的起始密碼子ATG上游2. 273kb序列擴(kuò)增后，連接到⑶S表達(dá)載體PCAMBIA3301上，將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化水稻，獲得轉(zhuǎn)基因株系，并用GUS顯示底物x-gluc對(duì)轉(zhuǎn)基因植株染色,觀察根尖部位的著色情況。本發(fā)明首次提出一個(gè)新的能夠在水稻根尖部位特異表達(dá)啟動(dòng)子Pro-0s02g54880，該啟動(dòng)子適用于啟動(dòng)目標(biāo)基因(如GUS基因或GFP基因)在水稻根尖的特異性表達(dá)。由于該啟動(dòng)子的特異性很強(qiáng)，因此為后續(xù)進(jìn)一步確定根尖特異表達(dá)的順式作用元件奠定了基礎(chǔ)，且為植物抗逆基因工程研究提供了新的啟動(dòng)子元件。


圖I為本發(fā)明實(shí)施例2中構(gòu)建的Pro-0s02g54880_GUS載體圖譜。圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中轉(zhuǎn)基因水稻不同組織器官的染色結(jié)果；其中，A為根系染色結(jié)果，B為葉片染色結(jié)果。圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中多個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因株系的根和葉片中GUS活性測(cè)定結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
·
以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。以下實(shí)例中未注明具體的實(shí)驗(yàn)方法，均可按照常規(guī)方法進(jìn)行或按照制造生產(chǎn)廠商的使用說明。實(shí)施例I水稻根尖特異表達(dá)啟動(dòng)子Pro-0s02g54880的克隆I. I生物材料I. I. I植物材料水稻轉(zhuǎn)基因受體材料為日本品種‘kitaake’。I. I. 2菌株和載體使用的農(nóng)桿菌菌株為EHA105，載體為pCAMBIA3301。I. 2 方法I. 2. I水稻根尖特異表達(dá)啟動(dòng)子Pro-0s02g54880的克隆及Pro-0s02g54880_GUS載體的構(gòu)建以水稻日本晴葉片為材料，用天根植物基因組提取試劑盒提取水稻總DNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。登錄 http://rice, plantbiology. msu. edu/analyses_search_locus. shtml 網(wǎng)站，找到水稻轉(zhuǎn)錄因子0s02g54880基因，根據(jù)其上游2. 273kb序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，并分別在兩條引物的5’端添加與載體pCAMBIA3301線性化位點(diǎn)同源的15個(gè)堿基。引物序列分別為prol-F:5’-CCATGATTACGAATTCTCCCCCGTGTCAACTGGATA-3 ' ;prol_R:5’-CTCAGATCTACCATGGGGACGACGTACGACGATGGT-3’。PCR 擴(kuò)增體系為PCR 反應(yīng)緩沖液 25 μ l，dNTP 4 μ 1，ddH20 17. 5 μ I，PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(購自 Takara 公司)O. 5 μ I。反應(yīng)程序?yàn)闊釂?dòng)98°C 10秒，57°C 5秒，72°C 2. 5分鐘，30個(gè)循環(huán)后72°C延伸10分鐘，最后25°C反應(yīng)結(jié)束。PCR結(jié)束后，用凝膠回收試劑盒(Axygen公司)回收PCR產(chǎn)物。載體pCAMBIA3301線性化通過常規(guī)酶切。限制性內(nèi)切酶EcoR I和Nco I購自Fermentas公司，反應(yīng)體系為5 μ I IOX反應(yīng)緩沖液，2μ I EcoR I ,2μ I Nco I，質(zhì)粒2yg，用ddH20補(bǔ)足至50μ I。PCR儀上37 °C反應(yīng)20分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，用凝膠回收試劑盒(Axygen公司)回收PCR產(chǎn)物。用丨n-Fusion HD Cloning KitCClontech公司)連接載體與目的片段。吸取2 μ I反應(yīng)體系直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，所構(gòu)建的載體Pro-0s02g54880-GUS圖譜見圖1，載體序列如SEQ ID No. 2所
/Jn οI. 2. 2轉(zhuǎn)基因水稻植株的獲得取水稻‘kitaake’成熟種子，人工或機(jī)械脫殼，挑選飽滿光潔無菌斑的種子經(jīng)消毒之后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。選擇外觀良好，生長力好的水稻愈傷組織為受體材料，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Pro-0s02g54880-GUS轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織中，用含有100 μ M的乙酰丁香酮和O. D.值為O. 7的農(nóng)桿菌的AAM轉(zhuǎn)化液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化液浸泡過的愈傷組織置于共培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)，25°C暗培養(yǎng)3d后置于篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)約30d,每IOd繼代一次。然后將篩出的抗性愈傷轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上分化約20d，每IOd繼代一次。將分化出綠色小苗的抗性愈傷轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上生根，待約7d長出發(fā)達(dá)根系后煉苗，并計(jì)算轉(zhuǎn)化所 獲轉(zhuǎn)基因苗數(shù)。煉苗7d后轉(zhuǎn)移至大田生長。用Basta篩選轉(zhuǎn)基因水稻，長出4片幼葉后開始噴灑Basta(1:1000，V :V)，隔I天噴I次，共噴灑3次。共獲得轉(zhuǎn)基因水稻18株。其中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為N6大量+B5微量+NB有機(jī)+鐵鹽+銅鈷母液+2. 5mg/L2，4D+0. 6g/L酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制，調(diào)pH至5. 8^5. 9后加入植物凝膠4g/L。共培養(yǎng)基配方為N6大量+B5微量+NB有機(jī)+鐵鹽+2. 5mg/L 2，4D+0. 5g/L谷氨酰胺+0. 6g/L酸水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L鹿糖，以水配制,調(diào)pH至5. 2后加入植物凝膠4g/L。滅菌后，50°C左右加入乙酰丁香酮lOOlOOyg/mL。篩選培養(yǎng)基配方為N6大量+B5微量+NB有機(jī)+鐵鹽+銅鈷母液+2. 5mg/L2，4D+0. 6g/L酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制，調(diào)PH至5. 8^5. 9后加入植物凝膠4g/L。滅菌后加入35mg/L潮霉素(購自上海紐津生物技術(shù)有限公司)或5mg/L Bialaphos (購自北京拜爾迪生物技術(shù)公司)。分化培養(yǎng)基配方為MS無機(jī)+MS-B5微量+MS有機(jī)+鐵鹽+MS-銅鈷母液+0. 05mg/L NAA+2. 0mg/L Kinetin (激動(dòng)素)+30g/L山梨醇+2g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖，以水配制，調(diào)pH至5. 8^5. 9后加入植物凝膠4g/L。實(shí)施例2水稻根尖特異表達(dá)啟動(dòng)子Pro-0s02g54880調(diào)控下游基因⑶S的表達(dá)I. I⑶S組織染色確定啟動(dòng)子的表達(dá)模式用⑶S顯示底物x-gluc對(duì)實(shí)施例I中獲得的轉(zhuǎn)基因植株根部及葉片進(jìn)行染色。GUS 染色液配方0. 05mmol/L 鐵氰化鉀,0. 05mmol/L 亞鐵氰化鉀,2mmol/L EDTA, 10mmol/L磷酸緩沖液，0.1% Triton X-100,0. 5mg/ml X-gluc，以水配制。黑暗下37°C染色8 12個(gè)小時(shí)后拍照。結(jié)果如圖2所示，只有水稻主根根尖、側(cè)根生長點(diǎn)和側(cè)根根尖被特異染色(圖2A)，而葉片及根的其他部位都未被染色(圖2B)，表明該啟動(dòng)子只在根尖表達(dá)，且特異性強(qiáng)。I. 2⑶S酶活定量I. 2. I蛋白定量I.標(biāo)準(zhǔn)蛋白稀釋用蛋白提取液將10mg/ml BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白母液分別稀釋為0、5、10、20、50、100呢/1111，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.考馬斯亮蘭G-250染料試劑稱IOOmg考馬斯亮蘭G-250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀釋至1L。3.將G-250溶液按照I :4稀釋，200ul稀釋溶液各加5ul不同梯度BSA。測(cè)定各樣品在595nm處的光吸收值A(chǔ)595，不加蛋白的G-250為對(duì)照。NANO繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測(cè)定各蛋白樣品的蛋白濃度。I. 2. 2⑶S蛋白的提取、測(cè)定I.取一定量材料于I. 5ml離心管中，加入液氮，打成粉末，加入適量蛋白提取液；2. 13000rpm 4°C離心 IOmin,取上清后，13000rpm 4°C離心 IOmin,去除細(xì)胞碎片；3.取適量的上清，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白的含量；4. 4-MU標(biāo)準(zhǔn)曲線配制4-MU梯度濃度液(由反應(yīng)終止液配制)10 μ mol/L,·
2.5 μ mol/L, I μ mol/L, 500nmol/L, lOOnmol/L, lOnmol/L (0-10 μ M),在激發(fā)光 365nm,發(fā)射光455nm，狹縫3nm條件下，測(cè)定各樣品的熒光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；4.將 180ul 的 0. 2Mm Na2CO3 預(yù)熱；5.將提取的蛋白與4-MUG I 1混合，使總體積達(dá)到80ul，37°C反應(yīng)，并在反應(yīng)30分鐘后取50ul反應(yīng)液加入到Na2CO3中終止反應(yīng),保持黑暗；6.采用Tristar LB941測(cè)定各樣品熒光值，并依據(jù)4-MU標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算4-MU濃度，根據(jù)公式“⑶S活力(pmol · μ g *min) =4_MU量/蛋白量/反應(yīng)時(shí)間”計(jì)算⑶S酶活。結(jié)果如圖3所示，根中的⑶S活性顯著高于葉片中的⑶S活性，進(jìn)一步表明Pro-0s02g54880啟動(dòng)子在根部特異表達(dá)。溶液配制如下200ml lmol/L Na2HPO4 溶液稱取 71. 628g Na2HPO4 · 12H20 溶于 200ml 水中；200ml ImoI/LNaH2PO4 溶液稱取 31. 202g NaH2PO4 · 2H20 溶于 200ml 水中；0. IM磷酸緩沖液(pH7. 0) :28.85ml lmol/L Na2HPO4 和 21. 15mllmol/L NaH2PO4 混合后加水至500ml ；0.5M EDTA (pH8. 0):在 80ml 水中加入 18. 61gNa2EDTA ·2Η20，用 NaOH 調(diào) pH 至 8· 0，溶解后定容至IOOml ；⑶S酶提取液50ml 0. IM 磷酸緩沖液(ρΗ7· 0)，2ml 0. 5MEDTA, IOOul TritonX-100，100 μ I β -巰基乙醇，加 ddH20 至 100ml ；MUG溶液取4-MUG 3. 5mg溶解于5ml提取緩沖液中，終濃度為2mM ；反應(yīng)終止液(0.2mol/L Na2CO3) :10. 6g Na2CO3 溶于 500ml 水；4-MU溶液配制稱0. 14096g 4-MU固體溶于40ml反應(yīng)終止液(0. 2M Na2CO3)中，配制成20mM的4-MU溶液，然后再稀釋到ImM濃度，貯存于_20°C，用于繪制MU標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過染色體步移、生物信息學(xué)分析、構(gòu)建植物表達(dá)載體及缺失片段載體的研究，可進(jìn)一步確定水稻根尖特異表達(dá)啟動(dòng)子Pro-0s02g54880的核心元件，為水稻根尖特異表達(dá)啟動(dòng)子Pro-0s02g54880功能的研究奠定了基礎(chǔ)。另外，本發(fā)明還驗(yàn)證了當(dāng)水稻根尖特異表達(dá)啟動(dòng)子Pro_0s02g54880控制的下游基因?yàn)镃KX基因或OsNACIO基因時(shí)，可促進(jìn)水稻根系生長并提高水稻的抗旱能力。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.水稻根尖特異表達(dá)啟動(dòng)子Pro-0s02g54880，其特征在于，其具有 i)SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列；或 ii)SEQID No. I所示核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸且同等功能的由i)衍生的核苷酸序列。
2.含有權(quán)利要求I所述啟動(dòng)子的載體。
3.含有權(quán)利要求I所述啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
4.含有權(quán)利要求I所述啟動(dòng)子的工程菌。
5.權(quán)利要求I所述的啟動(dòng)子在調(diào)控下游基因表達(dá)中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，下游基因?yàn)镚US、GFP、LUC、CKX或NAC基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，下游基因?yàn)镃KX基因或OsNACIO基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及水稻根尖特異表達(dá)啟動(dòng)子Pro-Os02g54880及其應(yīng)用，該啟動(dòng)子具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或該序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸且同等功能的由其衍生的核苷酸序列。本發(fā)明從克隆水稻根尖特異表達(dá)啟動(dòng)子Pro-Os02g54880入手，通過對(duì)水稻根尖特異表達(dá)啟動(dòng)子Pro-Os02g54880的功能分析，從實(shí)驗(yàn)水平上驗(yàn)證了該啟動(dòng)子適用于啟動(dòng)目標(biāo)基因在水稻根尖的特異性表達(dá)。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102839178SQ20121033089
公開日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2012年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月7日
發(fā)明者劉斌, 張春雨, 李宏宇, 趙濤, 劉軍, 林辰濤 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所