本發(fā)明涉及一種植物根特異性啟動子及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

啟動子是基因的組成部分，控制基因表達(dá)的起始和表達(dá)程度。在轉(zhuǎn)基因育種中，外源基因在植物體中的精確調(diào)控主要是通過合適的啟動子實現(xiàn)的。目前，在基因工程中廣泛使用的是組成型啟動子，但是由于組成型啟動子驅(qū)使目的基因在植物組織中的表達(dá)是恒定和持續(xù)的，不受時空和外界因素的限制，會過度消耗細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)和能量，產(chǎn)生大量異源蛋白質(zhì)或代謝產(chǎn)物，破壞了植物原有的生理代謝平衡，導(dǎo)致植物生長異常甚至死亡。與組成型啟動子相比，根特異性啟動子驅(qū)動外源基因在受體植物根中表達(dá)，克服了組成型啟動子由于持續(xù)、高效的啟動外源基因非特異性表達(dá)而造成的細(xì)胞物質(zhì)的過度消耗。隨著轉(zhuǎn)基因植物安全標(biāo)準(zhǔn)的提高，包括所有商業(yè)化轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物在內(nèi)，要求必須對所用啟動子的表達(dá)活性、潛在重組能力、對周邊環(huán)境以及安全性影響進(jìn)行詳細(xì)的研究。

大豆是一種重要的糧油飼兼用作物，在我國大豆產(chǎn)區(qū)大多處于干旱、鹽堿及高寒等區(qū)域，應(yīng)用的大豆品種耐逆性不強，嚴(yán)重的旱澇病蟲害等非生物和生物逆境脅迫顯著影響大豆產(chǎn)量。目前在轉(zhuǎn)基因大豆中使用的都是camv35s啟動子。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種植物根特異性啟動子及其應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種dna分子，命名為gmgrplp-1999，獲自栽培大豆williams82，為如下(1)或(2)或(3)：

(1)序列表中序列1所示的dna分子；

(2)在嚴(yán)格條件下與(1)限定的dna序列雜交且具有啟動子功能的dna分子；

(3)與(1)限定的dna序列具有90％以上同源性且具有啟動子功能的dna分子。

上述嚴(yán)格條件可為在0.1×sspe(或0.1×ssc)、0.1％sds的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。

含有所述dna分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述重組載體可為在植物表達(dá)載體的多克隆位點或重組位點插入所述dna分子得到重組質(zhì)粒。所述植物表達(dá)載體具體可為pc13p1載體。所述重組載體具體可為將所述dna分子插入pc13p1載體的多克隆位點得到的重組質(zhì)粒。所述重組載體具體可為將所述dna分子取代pc13p1載體的kpni和psti之間的小片段，得到的重組質(zhì)粒。

所述pc13p1載體為序列表的序列2所示的環(huán)形質(zhì)粒。

本發(fā)明還保護(hù)所述dna分子作為啟動子的應(yīng)用。所述應(yīng)用中，所述作為啟動子具體為作為根特異性啟動子。所述應(yīng)用中，所述作為啟動子具體為作為植物根特異性啟動子。

本發(fā)明還保護(hù)所述dna分子在啟動目的基因表達(dá)中的應(yīng)用。所述啟動目的基因表達(dá)可為啟動目的基因特異性表達(dá)。所述特異性表達(dá)具體可為根特異性表達(dá)。所述根特異性表達(dá)具體可為在根尖和/或根中柱特異性表達(dá)。所述啟動目的基因表達(dá)具體可為啟動植物中的目的基因表達(dá)。所述目的基因具體可為gus基因。

所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物可為被子植物。所述被子植物可為豆目植物。所述豆目植物可為豆科植物。所述豆科植物可為大豆屬植物。所述大豆屬植物具體可為大豆，例如栽培大豆williams82。

所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物可為被子植物。所述被子植物可為山柑目植物。所述山柑目植物可為十字花科植物。所述十字花科植物可為擬南芥屬植物。所述擬南芥屬植物具體可為擬南芥，例如columbia型擬南芥。

本發(fā)明還保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是在出發(fā)植物中用所述dna分子啟動目的基因的表達(dá)，得到表達(dá)所述目的基因的轉(zhuǎn)基因植物。

所述“表達(dá)所述目的基因”可為“在根中特異性表達(dá)所述目的基因”。

所述“表達(dá)所述目的基因”具體可為“在根尖中特異性表達(dá)所述目的基因”。

所述“表達(dá)所述目的基因”具體可為“在根中柱中特異性表達(dá)所述目的基因”。

所述出發(fā)植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物可為被子植物。所述被子植物可為豆目植物。所述豆目植物可為豆科植物。所述豆科植物可為大豆屬植物。所述大豆屬植物具體可為大豆，例如栽培大豆williams82。

所述被子植物可為山柑目植物。所述山柑目植物可為十字花科植物。所述十字花科植物可為擬南芥屬植物。所述擬南芥屬植物具體可為擬南芥，例如columbia型擬南芥。

所述目的基因具體可為gus基因。

所述方法中，可將特異dna分子導(dǎo)入所述出發(fā)植物，從而在所述出發(fā)植物中用所述啟動子啟動目的基因的表達(dá)；所述特異dna分子自上游至下游依次包括所述dna分子和所述目的基因。所述特異dna分子具體可通過含有所述特異dna分子的重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述出發(fā)植物。所述重組表達(dá)載體具體可為以上任一所述的重組載體。

本發(fā)明還保護(hù)一種制備目的蛋白的方法，是在出發(fā)植物中用所述dna分子啟動所述目的蛋白的編碼基因的表達(dá)，得到所述目的蛋白。

所述目的蛋白特異性存在于植物根中。

所述目的蛋白特異性存在于植物根尖和/或根中柱中。

所述出發(fā)植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物可為被子植物。所述被子植物可為豆目植物。所述豆目植物可為豆科植物。所述豆科植物可為大豆屬植物。所述大豆屬植物具體可為大豆，例如栽培大豆williams82。

所述被子植物可為山柑目植物。所述山柑目植物可為十字花科植物。所述十字花科植物可為擬南芥屬植物。所述擬南芥屬植物具體可為擬南芥，例如columbia型擬南芥。

所述目的蛋白具體可為gus。所述目的蛋白的編碼基因具體可為gus基因。

所述方法中，可將特異dna分子導(dǎo)入所述出發(fā)植物，從而在所述出發(fā)植物中用所述dna分子啟動所述目的蛋白的編碼基因的表達(dá)；所述特異dna分子自上游至下游依次包括所述dna分子和所述目的基因。所述特異dna分子具體可通過含有所述特異dna分子的重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述出發(fā)植物。所述重組表達(dá)載體可為以上任一所述的重組載體。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種大豆來源的根特異啟動子gmgrplp-1999，gmgrplp-1999啟動子能夠有效啟動目的基因在根尖及根中柱組織中特異性表達(dá)。將本發(fā)明應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因植物研究中，能夠為轉(zhuǎn)基因植物研究提供更加豐富的啟動子元件，同時也能夠為培育耐旱、耐鹽、耐冷、耐鋁、耐重金屬等轉(zhuǎn)基因植物新品種提供一種手段。本發(fā)明為植物在根部的分子改良提供了一種手段，對植株的抗逆研究就有一定意義，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間和市場前景。

附圖說明

圖1為pc13p1載體的質(zhì)粒圖譜。

圖2為大豆轉(zhuǎn)化步驟。

圖3為轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)狀根的gus染色結(jié)果。

圖4為pc13(delta)gus載體的質(zhì)粒圖譜。

圖5為轉(zhuǎn)基因擬南芥t1代的分子檢測結(jié)果。其中，泳道m(xù)為dl2000plus的dna分子量標(biāo)準(zhǔn)。

圖6為轉(zhuǎn)基因擬南芥t3代植株gus染色結(jié)果。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。

栽培大豆williams82：參考文獻(xiàn)：許碩.野生大豆鹽脅迫相關(guān)microrna的功能分析[d].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2011.；公眾可以從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。

pc13p1載體：序列表的序列2所示的環(huán)形質(zhì)粒。pc13p1載體上不含有任何啟動子，但含有g(shù)us報告基因。pc13p1載體的質(zhì)粒圖譜如圖1所示。

pc13(delt)gus載體：序列表的序列3所示的環(huán)形質(zhì)粒。pc13(delt)gus載體不含有g(shù)us基因，但含有卡那霉素抗性和潮霉素抗性。pc13(delt)gus載體的質(zhì)粒圖譜如圖4所示。

根癌農(nóng)桿菌gv3101：參考文獻(xiàn)：趙湛，李文生.不同根癌農(nóng)桿菌菌株類型對木霉菌遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響[j].北方園藝，2006(3)：14-15.；公眾可以從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。

columbia型擬南芥：參考文獻(xiàn)：郭曉麗.columbia型擬南芥愈傷組織培養(yǎng)研究[j].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009(1)：42-44.；公眾可以從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。

yep液體培養(yǎng)基由溶劑和溶劑組成；所述溶質(zhì)及其在yep液體培養(yǎng)基中的濃度為：nacl5g/l，酵母提取物5g/l，胰蛋白胨10g/l；所述溶劑為水。yep液體培養(yǎng)基的ph為7.0。

發(fā)芽培養(yǎng)基由溶劑和溶劑組成；所述溶質(zhì)及其在發(fā)芽培養(yǎng)基中的濃度為：b5鹽3.1g/l，蔗糖20g/l，瓊脂7g/l，1ml/l；所述溶劑為水。發(fā)芽培養(yǎng)基的ph為5.8。

共培養(yǎng)培養(yǎng)基由溶劑和溶劑組成；所述溶質(zhì)及其在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為：ms鹽0.31g/l，mes3.9g/l，蔗糖30g/l，瓊脂7g/l，ms有機1ml/l，dtt150mg/l，as0.02g/l；所述溶劑為水。共培養(yǎng)培養(yǎng)基的ph為5.4。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基由溶劑和溶劑組成；所述溶質(zhì)及其在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為：ms鹽2.165g/l，蔗糖30g/l，瓊脂7g/l，ms有機1ml/l，頭孢霉素250mg/l，羧芐青霉素鈉250mg/l；所述溶劑為水。誘導(dǎo)培養(yǎng)基的ph為5.8。

b5鹽：phytotech，目錄號：g768。

ms有機：phytotech，目錄號：m533。

ms鹽：phytotech，目錄號：m524。

dtt：sigma-aldrich，貨號：d5545。

as：sigma-aldrich，貨號：d134406。

頭孢霉素：sigma-aldrich，貨號：c7039。

羧芐青霉素鈉：inalco，貨號：1758-9317。

以下實施例中的gus組織化學(xué)染色方法如下：將待染色的組織樣品放入檢測液中，37℃溫育12-16h。觀察樣品的染色結(jié)果，并照相。白色背景下的藍(lán)色即為gus表達(dá)位點。

檢測液的組成：50mmol/l磷酸緩沖液(4.095gna2hpo4和2.537gnah2po4定容到1l水溶液中)，10mmol/ledta(ph7.0)，0.1％(質(zhì)量百分比)tritonx-100，2mmol/l鐵氰化鉀，2mmol/l亞鐵氰化鉀，5％(質(zhì)量百分比)x-gluc，余量為水。

實施例1、啟動子的發(fā)現(xiàn)

以栽培大豆williams82為研究材料，經(jīng)過大量序列分析、表達(dá)量分析與功能驗證，從大豆根系基因組dna中發(fā)現(xiàn)了一個啟動子，將其命名為gmgrplp-1999，如序列表的序列1所示。

實施例2、含有g(shù)mgrplp-1999啟動子的重組表達(dá)載體的構(gòu)建

1、提取栽培大豆williams82根系基因組dna。

2、以步驟1得到的基因組dna為模板，采用引物f-1999和引物r-1999組成的引物對進(jìn)行pcr擴增，回收約2000bp的pcr擴增產(chǎn)物。

f-1999：5′-ggtaccaatagtaggcttctctag-3′；

r-1999：5′-ctgcagcttaaactttttaggg-3′。

f-1999和r-1999中，下劃線分別標(biāo)注kpni和psti酶切位點。

3、限制性內(nèi)切酶kpni和psti雙酶切步驟2的pcr擴增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。

4、用限制性內(nèi)切酶kpni和psti雙酶切pc13p1載體，回收約8700bp的載體骨架。

5、將步驟3得到的酶切產(chǎn)物和步驟4得到的載體骨架連接，得到重組表達(dá)載體pcam-grplp-1999。根據(jù)測序結(jié)果，對重組表達(dá)載體pcam-grplp-1999進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將pc13p1載體的kpni和psti酶切位點之間的小片段取代為了序列表的序列1的自5′端第1-1999位核苷酸所示的雙鏈dna分子。

實施例3、轉(zhuǎn)gmgrplp-1999大豆發(fā)狀根的獲得及表達(dá)特性研究

1、將實施例2得到的重組表達(dá)載體pcam-grplp-1999導(dǎo)入發(fā)根農(nóng)桿菌k599，得到重組農(nóng)桿菌。

2、將步驟1得到的重組農(nóng)桿菌接種于yep液體培養(yǎng)基(含卡那霉素50mg/l)，28℃、200rmp震蕩培養(yǎng)，得到od600nm＝0.6-0.8的重組農(nóng)桿菌菌液。

3、挑選無病蟲害的栽培大豆williams82種子置于培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放入干燥器中，在干燥器的燒杯中加入100ml次氯酸鈉，再沿?zé)屑尤?.5ml12n鹽酸，關(guān)閉干燥器，放置16h進(jìn)行消毒(圖2a)。

4、將步驟3消毒后的種子接種于發(fā)芽培養(yǎng)基中(圖2b)，28℃培養(yǎng)5天。5天后(圖2c)，取大豆子葉。

5、取步驟4得到的大豆子葉連帶胚軸用刀割下，切除多余的胚軸，保留子葉帶0.5cm的胚軸，用刀片將子葉節(jié)從中間分開，變成兩個單葉(圖2d)，用刀片在子葉和胚軸的連接處劃傷7-8下。將處理好的子葉節(jié)在步驟2得到的重組農(nóng)桿菌菌液中浸泡30min(圖2e)。

6、將步驟5浸泡好的子葉節(jié)轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，22℃暗培養(yǎng)5天(圖2f)。

7、將步驟6培養(yǎng)的子葉節(jié)在1/2ms液體培養(yǎng)基中清洗3次，然后轉(zhuǎn)移至誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)10-12天，可觀察到大量發(fā)狀根從劃傷處產(chǎn)生(圖2g)。將發(fā)狀根從子葉基部剪下，進(jìn)行g(shù)us組織化學(xué)染色。

8、采用發(fā)根農(nóng)桿菌k599代替重組農(nóng)桿菌，按照步驟2-7進(jìn)行操作，作為對照(ck)。

結(jié)果如圖3所示。從圖中可以看出，在轉(zhuǎn)入gmgrplp-1999的發(fā)狀根中，只在根尖和中柱檢測到gus基因的表達(dá)活性(藍(lán)色)，在其他組織沒有檢測到。而在轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌k599的對照發(fā)狀根中均無gus表達(dá)。三次重復(fù)實驗結(jié)果一致。

實施例4、轉(zhuǎn)gmgrplp-1999擬南芥的獲得及表達(dá)特性研究

1、將實施例2得到的重組表達(dá)載體pcam-grplp-1999導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌gv3101，得到重組農(nóng)桿菌grplp-1999。

2、將pc13(delt)gus載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌gv3101，得到重組農(nóng)桿菌pc13(delt)gus。

3、將步驟1得到的重組農(nóng)桿菌grplp-1999接種于yep液體培養(yǎng)基(含卡那霉素50mg/l)，28℃、220rmp震蕩培養(yǎng)，得到od600nm＝0.4-0.6的重組農(nóng)桿菌菌液grplp-1999。

4、將步驟2得到的重組農(nóng)桿菌pc13(delt)gus接種于yep液體培養(yǎng)基(含卡那霉素50mg/l)，28℃、200rmp震蕩培養(yǎng)，得到od600nm＝0.4-0.6的重組農(nóng)桿菌菌液重組農(nóng)桿菌pc13(delt)gus。

5、將1體積份步驟3得到的重組農(nóng)桿菌菌液grplp-1999和1體積份步驟4得到的重組農(nóng)桿菌菌液重組農(nóng)桿菌pc13(delt)gus混合，加入silwetl-77，得到混合菌液，silwetl-77在混合菌液中的體積百分比為0.5％。

6、取開花期的columbia型擬南芥，每周進(jìn)行一次侵染，直至收獲t1代種子。

每次侵染的步驟均為：置于步驟5得到的混合菌液中浸泡1min，浸泡后遮光過夜，第二天恢復(fù)正常培養(yǎng)(光照16h/黑暗8h)。

t1代種子長成的植株為t1代植株。由t1代植株自交產(chǎn)生的種子為t2代種子。由t2代種子長成的植株為t2代植株。由t2代植株自交產(chǎn)生的種子為t3代種子。由t3代種子長成的植株為t3代植株。

7、將步驟6得到的t1代種子接種至含50mg/l潮霉素的1/2ms培養(yǎng)基上，篩選能夠正常生長的t1代植株。提取t1代植株的基因組dna，以基因組dna為模板，采用引物f-1999和引物r-1999組成的引物對進(jìn)行進(jìn)行pcr檢測。采用重組表達(dá)載體pcam-grplp-1999作為陽性對照。

如果得到約1999bp的擴增產(chǎn)物、待測植株為轉(zhuǎn)基因陽性植株，如果沒有得到所述擴增產(chǎn)物、待測植物為非轉(zhuǎn)基因植株(部分檢測結(jié)果如圖5所示。圖5中，ck+為陽性對照，泳道1-7為隨機選取的t1代植株)。

將經(jīng)過鑒定為轉(zhuǎn)基因陽性的t1代植株繼續(xù)培養(yǎng)，在t3代得到轉(zhuǎn)基因純合株系。

8、采用pc13p1載體代替重組表達(dá)載體pcam-grplp-1999，按照步驟1-7進(jìn)行操作，得到轉(zhuǎn)空載體株系。

9、分別取同一時期(出苗3天和10天)的columbia型擬南芥(野生型)植株、轉(zhuǎn)基因純合株系的t3代植株和轉(zhuǎn)空載體株系的t3代植株進(jìn)行g(shù)us染色。

結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因植株中，根尖可以檢測到gus基因的表達(dá)活性(藍(lán)色)，其他組織中沒有檢測到。在columbia型擬南芥(ck)和轉(zhuǎn)空載體擬南芥植株中均無gus表達(dá)。三次重復(fù)實驗結(jié)果一致。

<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所

<120>一種植物根特異性啟動子及其應(yīng)用

<160>3

<210>1

<211>1999

<212>dna

<213>大豆（glycinemax(linn.)merr.）

<400>1

aatagtaggcttctctagtttctttttcaacctaaagaattaaaattgatgaaaaataag60

aaaatgatattttattatttgtatttataaataaaaaataggtgaaaaataaaataatta120

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cttttatggcaatttattgttaaaattataattttgaaaatttgactgatcgacctgtta240

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cccacaaaagctcttaagctcccgtagttaaatctgcgagccattagttaaagaaaaaaa1980

aaaccctaaaaagtttaag1999

<210>2

<211>8766

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

cgagctcggtacccggggatcctgcagtctagaagcttccatggtagatctgagggtaaa60

tttctagtttttctccttcattttcttggttaggacccttttctctttttatttttttga120

gctttgatctttctttaaactgatctattttttaattgattggttatggtgtaaatatta180

catagctttaactgataatctgattactttatttcgtgtgtctatgatgatgatgatagt240

tacagaaccgacgactcgtccgtcctgtagaaaccccaacccgtgaaatcaaaaaactcg300

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