C6orf97基因突變檢測特異性引物和液相芯片的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種C6ORF97基因突變檢測液相芯片和特異性引物，該液相芯片主要包括有：每種由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點的特異性引物序列組成的ASPE引物，所述特異性引物序列為：針對C1810T位點的SEQ?ID?NO.9及SEQ?ID?NO.10，針對T91235C位點的SEQ?ID?NO.11及SEQ?ID?NO.12，針對A68C位點的SEQ?ID?NO.13及SEQ?ID?NO.14，和/或針對A123001G位點的SEQ?ID?NO.15及SEQ?ID?NO.16；有anti-tag序列包被的微球；擴增引物。本發(fā)明所提供的檢測液相芯片的檢測結(jié)果與測序法的吻合率高達100％，實現(xiàn)多個突變位點的野生型和突變型并行檢測。
【專利說明】C60RF97基因突變檢測特異性引物和液相芯片
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學領域，涉及醫(yī)學和生物技術，具體的是涉及一種C60RF97基因突變檢測特異性引物和液相芯片。
【背景技術】
[0002]染色體6 開放閱讀框 97 (chromosome6open reading frame97)，位于 6 號染色體6q25.1上,在C6orf97蛋白的羧基端發(fā)現(xiàn)了染色體結(jié)構維護域,染色體蛋白在染色體動力學中發(fā)揮著重要作用。隨著對乳腺癌發(fā)病基因、全基因組關聯(lián)研究(GWASs)的深入，越來越多的資料顯示基因突變與乳腺癌的發(fā)病率有密切的關系，在8項GWAS研究中篩選出C6orf97基因的rs2046210和rs3757318兩個位點值得關注。進一步對C6orf97功能進行研究發(fā)現(xiàn)，該基因和腰椎骨密度存在一定的相關性。
[0003]目前，C60RF97基因突變檢測方法主要有=Illumina光纖微珠芯片技術、基質(zhì)輔助激光解析電離時間飛行質(zhì)譜技術(MALD1-T0F-MS)、SNPlexTM System技術和熒光定量PCR技術，雖然Illumina光纖微珠芯片技術是高靈敏度和精確性的高通量檢測系統(tǒng)，但是自動化程度低，手工操作比較多，難以滿足實際應用的需要，基質(zhì)輔助激光解析電離時間飛行質(zhì)譜技術是一種軟電離技術，在蛋白質(zhì)等生物大分子的檢測中有著強大而成熟的功能，但是在核酸檢測領域，由于核酸分子本身的特殊性，檢測受到一定的限制。SNPlexTM System技術對SNP序列特異性要求較高，不能隨意地分析所選擇的單核苷酸多態(tài)性位點，難以應用于臨床檢測診斷，而且該方法操作比較復雜，不能滿足實際應用的需要。而熒光定量PCR技術靈敏度高、特異性強、自動化程度高的特點，但存在樣品易污染、假陽性率高的缺點，且每次只能檢測一種突變類型，同樣不能滿足實際應用的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

`[0004]本發(fā)明的目的之一是提供C60RF97基因突變檢測液相芯片，該液相芯片可用于單獨或并行檢測C60RF97基因四種常見基因型C1810T、T91235C、A68C和A123001G的野生型
和突變型。
[0005]實現(xiàn)該目的的技術方案如下。
[0006]一種C60RF97基因突變檢測液相芯片，包括有:
[0007](A).針對C60RF97基因不同突變位點分別設計的野生型和突變型的ASPE引物對:每條ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列為:針對C1810T位點的SEQ ID N0.9及SEQ ID N0.10，針對T91235C位點的 SEQ IDN0.11 及 SEQ ID N0.12，針對 A68C 位點的 SEQ ID N0.13 及 SEQ ID N0.14，和/或針對A123001G位點的SEQ ID N0.15及SEQ ID N0.16 ;所述tag序列選自SEQ IDN0.1 ~SEQ ID N0.8 ；
[0008](B).有不同ant1-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述ant1-tag序列與微球連接中間還設有間隔臂序列；所述ant1-tag序列選自SEQ ID N0.17~SEQ IDN0.24,且所述ant1-tag序列能相應地與(A)中所選的tag序列互補配對；
[0009](C).用于擴增出需要檢測的、具有相應突變位點的目標序列的引物。
[0010]在其中一個實施例中，所述擴增引物為:針對C1810T位點的SEQ ID N0.25及SEQIDN0.26，針對 T91235C 位點的 SEQ ID N0.27 及 SEQ ID N0.28，針對 A68C 位點的 SEQ IDN0.29 及 SEQ ID N0.30，和 / 或針對 A123001G 位點的 SEQ ID N0.31 及 SEQ ID N0.32。
[0011]在其中一個實施例中，所述ASPE引物對為:針對C1810T位點的由SEQ ID N0.1和SEQ IDN0.9組成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.10組成的序列，針對T91235C位點的由SEQ IDN0.3和SEQ ID N0.11組成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.12組成的序列，針對A68C位點的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.13組成的序列及由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.14組成的序列，和/或針對A123001G位點的由SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.15組成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQID N0.16組成的序列。
[0012]本發(fā)明的另一目的是提供用于C60RF97基因突變檢測的特異性引物。
[0013]具體技術方案如下。
[0014]用于C60RF97基因突變檢測的特異性引物，所述特異性引物為:針對C1810T位點的 SEQID N0.9 及 SEQ ID N0.10，針對 T91235C 位點的 SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12，針對 A68C位點的 SEQ ID N0.13 及 SEQ ID N0.14，和 / 或針對 A123001G位點的 SEQ ID N0.15及 SEQ ID N0.16。
[0015]本發(fā)明的主要優(yōu)點在于:
[0016]1.本發(fā)明所提供的C60RF97基因突變檢測液相芯片的檢測結(jié)果與測序法的吻合率高達100%。且檢測所需要的時間遠遠低于常用的測序技術，特別符合實際應用需要。所制備的C60RF97基因突變檢測液相芯片具有非常好的信號-噪聲比，并且所設計的探針以及ant1-tag序列之間基本上不存在交叉反應，tag標簽序列、ant1-tag標簽序列的選取以及tag標簽序列與具體ASPE引物的結(jié)合，能夠避免交叉反應，實現(xiàn)多個突變位點的并行檢測。
[0017]2.本發(fā)明通過發(fā)明人長期積累的設計經(jīng)驗和大量的實驗操作，從眾多的特異性引物中選取了最優(yōu)的組合。本發(fā)明設計的ASPE引物特異性引物能夠靈敏特異地識別目標檢測的突變位點，準確區(qū)分各種型別的基因型；在同一個反應體系中，不同的特異性引物之間、特異性引物與非目標檢測的PCR擴增產(chǎn)物之間基本上不存在交叉反應，檢測特異性好，交叉反應率低于3% ;除了能夠檢測單個位點突變情況，也能夠同時并行檢測多個突變位點的突變情況，檢測效果一致。
[0018]3.本發(fā)明的檢測方法步驟簡單，4種突變位點檢測可通過一步PCR即可完成4條含有突變位點的目標序列的擴增，避免了反復多次PCR等復雜操作過程中存在的諸多不確定因素，因而可大大提高檢測準確率，體現(xiàn)了精確的同時定性、定量分析特征。
[0019]4.本發(fā)明不僅克服了傳統(tǒng)固相芯片敏感性不高，檢測結(jié)果的可重復性差的缺陷，同時對現(xiàn)有的液相芯片技術進行改進，使得所制備微球能適用于不同的檢測項目，具有很強的拓展性。檢測的熒光信號值大大提高，從而使得檢測的靈敏度進一步得到提高，信噪比增強，檢測結(jié)果更加準確可靠。
【具體實施方式】[0020]實施例1C60RF97基因突變檢測液相芯片，主要包括有:
[0021]一、ASPE 引物
[0022]針對C60RF97基因四種常見基因型C1810T、T91235C、A68C和A123001G的野生型和突變型，分別設計特異性引物序列。ASPE引物由“tag序列+特異性引物序列”組成。ASPE引物序列如下表所示:
[0023]表1C60RF97基因的ASPE弓丨物序列(tag序列+特異性引物序列)
【權利要求】
1.一種C60RF97基因突變檢測液相芯片，其特征是，包括有: (A).針對C60RF97基因不同突變位點分別設計的野生型和突變型的ASPE引物對:每條ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列為:針對C1810T位點的SEQ ID N0.9及SEQ ID N0.10，針對T91235C位點的 SEQ IDN0.11 及 SEQ ID N0.12，針對 A68C 位點的 SEQ ID N0.13 及 SEQ ID N0.14，和/或針對A123001G位點的SEQ ID N0.15及SEQ ID N0.16 ;所述tag序列選自SEQ IDN0.1 ~SEQ ID N0.8 ； (B).有不同ant1-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述ant1-tag序列與微球連接中間還設有間隔臂序列；所述ant1-tag序列選自SEQ ID N0.17~SEQ ID N0.24，且所述ant1-tag序列能相應地與(A)中所選的tag序列互補配對； (C).用于擴增出需要檢測的、具有相應突變位點的目標序列的引物。
2.根據(jù)權利要求1所述的C60RF97基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述擴增引物為:針對C1810T位點的 SEQ ID N0.25及 SEQ ID N0.26，針對T91235C位點的 SEQ ID N0.27及 SEQ IDN0.28，針對 A68C 位點的 SEQ ID N0.29 及 SEQ ID N0.30，和 / 或針對 A123001G位點的 SEQ IDN0.31 及 SEQ ID N0.32。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的C60RF97基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述ASPE引物對為:針對C1810T位點的由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.9組成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ IDN0.10組成的序列，針對T91235C位點的由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.11組成的序列及由SEQ IDN0.4和SEQ ID N0.12組成的序列，針對A68C位點的由SEQ ID N0.5和SEQID N0.13組成的序列及由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.14組成的序列，和/或針對A123001G位點的由SEQ ID N`0.7和SEQ ID N0.15組成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.16組成的序列。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的C60RF97基因突變檢測液相芯片，其特征在于，所述間隔臂為5-10個T。
5.用于C60RF97基因突變檢測的特異性引物，其特征在于，所述特異性引物為:針對C1810T 位點的 SEQ ID N0.9 及 SEQ ID N0.10，針對 T91235C 位點的 SEQ ID N0.11 及 SEQID N0.12，針對 A68C 位點的 SEQ ID N0.13 及 SEQ ID N0.14，和 / 或針對 A123001G 位點的SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16。
【文檔編號】C12Q1/68GK103865987SQ201210545876
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月14日 優(yōu)先權日:2012年12月14日
【發(fā)明者】吳詩揚, 鄒鳳文 申請人:益善生物技術股份有限公司