Casp8基因突變檢測特異性引物和液相芯片的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種CASP8基因突變檢測液相芯片和特異性引物，該液相芯片主要包括有：每種由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點(diǎn)的特異性引物序列組成的ASPE引物，所述特異性引物序列為：針對G1122A位點(diǎn)的SEQ?ID?NO.13及SEQ?ID?NO.14，針對G808C位點(diǎn)的SEQID?NO.15及SEQ?ID?NO.16，針對T845A位點(diǎn)的SEQ?ID?NO.17及SEQ?ID?NO.18，針對G34767T位點(diǎn)的SEQ?ID?NO.19及SEQ?ID?NO.20，針對T35438G位點(diǎn)的SEQ?ID?NO.21及SEQ?ID?NO.22，和/或針對缺失突變位點(diǎn)的SEQ?ID?NO.23及SEQ?ID?NO.24；有不同anti-tag序列包被的微球；擴(kuò)增引物。本發(fā)明所提供的檢測液相芯片的檢測結(jié)果與測序法的吻合率高達(dá)100％，實(shí)現(xiàn)多個(gè)突變位點(diǎn)的野生型和突變型并行檢測。
【專利說明】CASP8基因突變檢測特異性引物和液相芯片
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及一種CASP8基因突變檢測特異性引物和液相芯片。
【背景技術(shù)】
[0002]CASP8 (apoptosis-related cysteine peptidase)基因的全稱是半胱;氛酸蛋白酶(apoptosis-related cysteine peptidase)基因，簡寫為 CASP8 或 caspase8,是一種編碼蛋白型基因，屬于半胱；氛酸蛋白酶 caspase (cysteine-aspartic acid protease caspase)家族，該基因定位于人2號染色體的長臂33-34，DNA全長2938bp，是單外顯子基因，外顯子位于202-1818bp處，mRNA全長2097bp，其中編碼序列1998bp，編碼665個(gè)氨基酸、分子量為73Kd 的驅(qū)動蛋白樣 DNA 結(jié)合蛋白(kinesin-like DNA binding protein, kinesin_like4,Kid) o CASP8是CASP家族的第8個(gè)成員，因此也被命名為caspase8 (caspase family8)。該家族作為非活化的蛋白酶原，由一系列蛋白結(jié)構(gòu)域，大小蛋白酶亞基組成的，在細(xì)胞凋亡活化的執(zhí)行期起重要作用。其中CASP8需要由在保守氨基酸末端的蛋白水解過程中產(chǎn)生的二聚酶來激活。它的基因編碼產(chǎn)物由Fas和多種不同的細(xì)胞凋亡激活因子誘導(dǎo)，研究表明，caspases對免疫細(xì)胞的生死存亡起決定性作用，其表達(dá)或激活異常與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病有關(guān)。caspase-8由CASP8基因編碼，它是死亡配體-受體相互作用介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程的起始型caspase。來自死亡配體與受體結(jié)合的凋亡信號，首先激活caspase-8,后者將凋亡信號傳遞給caspase_10(由CASP10基因編碼)引起caspase級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在該過程中，CFLAR (由CFLAR基因編碼)對caspase-8起負(fù)調(diào)節(jié)作用。這三個(gè)凋亡相關(guān)分子在凋亡信號傳導(dǎo)過程共同作用 ，是細(xì)胞凋亡事件中的關(guān)鍵分子。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，CASP8基因與多種常見腫瘤，包括頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、腦膜瘤、膀胱癌、肺癌、食管癌、結(jié)直腸癌、子宮頸癌、乳腺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)呈現(xiàn)相關(guān)性。
[0003]目前，CASP8基因突變檢測方法主要有=Illumina光纖微珠芯片技術(shù)、PCR-RFLP技術(shù)、SNPlexTM System技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)，雖然Illumina光纖微珠芯片技術(shù)是高靈敏度和精確性的高通量檢測系統(tǒng)，但是自動化程度低，手工操作比較多，難以滿足實(shí)際應(yīng)用的需要，PCR-RFLP法是基于基因突變造成的限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的改變，如位點(diǎn)丟失或產(chǎn)生新位點(diǎn)，通過PCR擴(kuò)增某一特定片段，再用限制性內(nèi)切酶酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳觀察片段的大小，
[0004]這種方法用于檢測酶切位點(diǎn)改變的基因突變，可直接判斷基因型，但該法不能用于沒有產(chǎn)生新酶切位點(diǎn)的基因突變檢測。SNPlexTM System技術(shù)對SNP序列特異性要求較高，不能隨意地分析所選擇的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，難以應(yīng)用于臨床檢測診斷，而且該方法操作比較復(fù)雜，不能滿足實(shí)際應(yīng)用的需要。而熒光定量PCR技術(shù)靈敏度高、特異性強(qiáng)、自動化程度高的特點(diǎn)，但存在樣品易污染、假陽性率高的缺點(diǎn)，且每次只能檢測一種突變類型，同樣不能滿足實(shí)際應(yīng)用的需要。
[0005]本發(fā)明目標(biāo)檢測的CASP8基因突變，如表所示:[0006]
序號|CASP8基因突變的內(nèi)容I標(biāo)記為
ISEQ ID N0.57的第158位核苷酸開始，發(fā)生了 6bp缺失缺失突變
[0007]SEQ ID N0.57CASP8 基因缺失突變
[0008]TGTCTTTACTCTGCATGCCAGGAGCTAAGTATTTTGCATGTATTAACTCATTTTGTTCTCATAATAACCTTCACATGCAGGAATCATTATAGCTACTTTATGAATGAGCCGAGGAAGGCACTGAGACGTTAAGTAACTTGCCCAAGGTCACGCAGCT ]αΟ?ΛΛΟ| TGGCAGAGCAAGAATTACTATGGCTTTATAAGCCTAGGAAAAAGTCTGAAAGAATCAAAATGTTAACAGCGGGGACCTCAAGGAAGCATTGAAGAGGCCATGGGAGAAGTTTTCACTTTGTTAAAAAATCAGTCCTTCAAATAAATAAATACAGTGAGGCTTCCCCAGAAGCAGATGTCACTA
[0009](說明:該序列從第158位堿基開始，發(fā)生了6位堿基的缺失突變，框中序列即為缺失區(qū)域，本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)技術(shù)手段，根據(jù)缺失區(qū)域前后的堿基組成，在基因庫中便能容易獲得該缺失區(qū)域的堿基組成，因此，本發(fā)明目標(biāo)檢測的CASP8基因缺失突變的內(nèi)容是充分公開的。)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的之一是提供CASP8基因突變檢測液相芯片，該液相芯片可用于單獨(dú)或并行檢測CASP8基因六種常見基因型Gl 122A、G808C、T845A、G34767T、T35438G和缺失突變的野生型和突變型。
[0011 ] 實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。`
[0012]一種CASP8基因突變檢測液相芯片，包括有:
[0013](A).針對CASP8基因不同突變位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)的野生型和突變型的ASPE引物對:每條ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點(diǎn)的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列為:針對G1122A位點(diǎn)的SEQ ID N0.13及SEQ ID N0.14，針對G808C位點(diǎn)的 SEQ IDN0.15 及 SEQ ID N0.16，針對 T845A 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.17 及 SEQ ID N0.18，針對 G34767T 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.19 及 SEQ ID N0.20，針對 T35438G 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.21 及SEQ ID N0.22，和/或針對缺失突變位點(diǎn)的SEQ ID N0.23及SEQ ID N0.24 ;所述tag序列選自 SEQ ID N0.1 ~SEQ IDN0.12 ；
[0014](B).有不同ant1-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述ant1-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述ant1-tag序列選自SEQ ID N0.25~SEQ IDN0.36,且所述ant1-tag序列能相應(yīng)地與(A)中所選的tag序列互補(bǔ)配對；
[0015](C).用于擴(kuò)增出需要檢測的、具有相應(yīng)突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列的引物。
[0016]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述擴(kuò)增引物為:針對G1122A位點(diǎn)的SEQ ID N0.37及SEQIDN0.38，針對 G808C 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.39 及 SEQ ID N0.40，針對 T845A 位點(diǎn)的 SEQ IDN0.41 及 SEQ ID N0.42，針對 G34767T 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.43 及 SEQ ID N0.44，針對 T35438G位點(diǎn)的SEQ ID N0.45及SEQ ID N0.46，和/或針對缺失突變位點(diǎn)的SEQ ID N0.47及SEQID N0.48。
[0017]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述ASPE引物對為:針對G1122A位點(diǎn)的由SEQ ID N0.1和SEQ IDN0.13組成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.14組成的序列，針對G808C位點(diǎn)的由SEQ IDN0.3和SEQ ID N0.15組成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.16組成的序列，針對T845A位點(diǎn)的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.17組成的序列及由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.18組成的序列，針對G34767T位點(diǎn)的由SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.19組成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQ IDN0.20組成的序列，針對T35438G位點(diǎn)的由SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.21組成的序列及由SEQ IDN0.10和SEQ ID N0.22組成的序列，和/或針對缺失突變位點(diǎn)的由SEQ ID N0.11和SEQ ID N0.23組成的序列及由SEQ ID N0.12和SEQ IDN0.24組成的序列。
[0018]本發(fā)明的另一目的是提供用于CASP8基因突變檢測的特異性引物。
[0019]實(shí)現(xiàn)該目的的技術(shù)方案如下。
[0020]用于CASP8基因突變檢測的特異性引物，所述特異性引物為針對G1122A位點(diǎn)的SEQ IDN0.13 及 SEQ ID N0.14，針對 G808C 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，針對T845A 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.17 及 SEQ ID N0.18，針對 G34767T 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.19 及 SEQID N0.20，針對T35438G位點(diǎn)的SEQ ID N0.21及SEQ ID N0.22，和/或針對缺失突變位點(diǎn)的 SEQ ID N0.23 及 SEQ ID N0.24。
[0021]本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于:
[0022]1.本發(fā)明所提供的檢測方法與測序法的吻合率高達(dá)100%。且檢測所需要的時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于常用的測序技術(shù)，特別符合實(shí)際應(yīng)用需要。所制備的CASP8基因突變檢測液相芯片具有非常好的信號-噪聲比，并且所設(shè)計(jì)的探針以及ant1-tag序列之間基本上不存在交叉反應(yīng)，tag標(biāo)簽序列、ant1-tag標(biāo)簽序列的選取以及tag標(biāo)簽序列與具體ASPE引物的結(jié)合，能夠避免交叉反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)多個(gè)突變位點(diǎn)的并行檢測。
[0023]2.本發(fā)明通過發(fā)明人長期積累的設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)和大量的實(shí)驗(yàn)操作，從眾多的特異性引物中選取了最優(yōu)的組合。本發(fā)明設(shè)計(jì)的ASPE引物特異性引物能夠靈敏特異地識別目標(biāo)檢測的突變位點(diǎn)，準(zhǔn)確區(qū)分各種型別的基因型；在同一個(gè)反應(yīng)體系中，不同的特異性引物之間、特異性引物與非目標(biāo)檢測的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之間基本上不存在交叉反應(yīng)，檢測特異性好，交叉反應(yīng)率低于3% ;除了能夠檢測單個(gè)位點(diǎn)突變情況，也能夠同時(shí)并行檢測多個(gè)突變位點(diǎn)的突變情況，檢測效果一致。
[0024]3.本發(fā)明的檢測方法步驟簡單，6種突變位點(diǎn)檢測可通過一步PCR即可完成6條含有突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列的擴(kuò)增，避免了反復(fù)多次PCR等復(fù)雜操作過程中存在的諸多不確定因素，因而可大大提高檢測準(zhǔn)確率，體現(xiàn)了精確的同時(shí)定性、定量分析特征。
[0025]4.本發(fā)明不僅克服了傳統(tǒng)固相芯片敏感性不高，檢測結(jié)果的可重復(fù)性差的缺陷，同時(shí)對現(xiàn)有的液相芯片技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，使得所制備微球能適用于不同的檢測項(xiàng)目，具有很強(qiáng)的拓展性。檢測的熒光信號值大大提高，從而使得檢測的靈敏度進(jìn)一步得到提高，信噪比增強(qiáng)，檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。
【具體實(shí)施方式】
[0026]實(shí)施例1CASP8基因突變檢測液相芯片，主要包括有:
[0027]一、ASPE 引物
[0028]針對CASP8 基因六種常見基因型 Gl 122A、G808C、T845A、G34767T、T35438G 和缺失突變的野生型和突變型，分別設(shè)計(jì)特異性引物序列。ASPE引物由“tag序列+特異性引物序列”組成。ASPE引物序列如下表所示:
[0029]表1CASP8基因的ASPE弓丨物序列(tag序列+特異性引物序列)
[0030]
【權(quán)利要求】
1.一種CASP8基因突變檢測液相芯片，其特征是，包括有: (A).針對CASP8基因不同突變位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)的野生型和突變型的ASPE引物對:每條ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點(diǎn)的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列為:針對G1122A位點(diǎn)的SEQ ID N0.13及SEQ ID N0.14，針對G808C位點(diǎn)的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，針對 T845A 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.17 及 SEQ ID N0.18，針對 G34767T 位點(diǎn)的 SEQ IDN0.19 及 SEQ ID N0.20，針對 T35438G 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.21 及SEQ ID N0.22，和/或針對缺失突變位點(diǎn)的SEQ ID N0.23及SEQ ID N0.24 ;所述tag序列選自 SEQ ID N0.1 ~SEQ ID N0.12 ； (B).有不同ant1-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球，所述ant 1-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述ant1-tag序列選自SEQ ID N0.25~SEQ ID N0.36，且所述ant1-tag序列能相應(yīng)地與(A)中所選的tag序列互補(bǔ)配對； (C).用于擴(kuò)增出需要檢測的、具有相應(yīng)突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列的引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CASP8基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述擴(kuò)增引物為:針對 G1122A 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.37 及 SEQ ID N0.38，針對 G808C 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.39 及SEQ IDN0.40，針對 T845A 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.41 及 SEQ ID N0.42，針對 G34767T 位點(diǎn)的 SEQID N0.43 及 SEQ ID N0.44，針對 T35438G 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.45 及 SEQ ID N0.46，和 / 或針對缺失突變位點(diǎn)的SEQ ID N0.47及SEQ ID N0.48。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的CASP8基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述ASPE引物對為:針對G1122A位點(diǎn)的由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.13組成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ IDN0.14組成的序列，針對G808C位點(diǎn)的由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.15組成的序列及由SEQ IDN0.4和SEQ ID N0.16組成的序列，針對T845A位點(diǎn)的由SEQ ID N0.5和SEQID N0.17組成的序列及 由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.18組成的序列，針對G34767T位點(diǎn)的由SEQ ID N0.7和SEQID N0.19組成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.20組成的序列，針對T35438G位點(diǎn)的由SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.21組成的序列及由SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.22組成的序列，和/或針對缺失突變位點(diǎn)的由SEQ ID N0.11和SEQ ID N0.23組成的序列及由SEQ ID N0.12和SEQ IDN0.24組成的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的CASP8基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述間隔臂為5-10 個(gè) T0
5.用于CASP8基因突變檢測的特異性引物，其特征是，所述特異性引物為針對Gl122A位點(diǎn)的 SEQ ID N0.13 及 SEQ ID N0.14，針對G808C位點(diǎn)的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，針對 T845A 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.17 及 SEQ ID N0.18，針對 G34767T 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.19 及SEQ IDN0.20，針對T35438G位點(diǎn)的SEQ ID N0.21及SEQ ID N0.22，和/或針對缺失突變位點(diǎn)的 SEQID N0.23 及 SEQ ID N0.24。
【文檔編號】C12Q1/68GK103865988SQ201210545878
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月14日
【發(fā)明者】劉志明, 林麗 申請人:益善生物技術(shù)股份有限公司