(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種具有殼聚糖水解活性的雙功能葡聚糖酶及其應(yīng)用。

(二)

背景技術(shù)：

葡聚糖酶(glucanase，e.c3.2.1.73)可水解β-糖苷鍵而形成葡萄糖聚合物等小分子物質(zhì)，屬于纖維素酶類的一種。β-葡聚糖酶廣泛應(yīng)用于啤酒釀造、飼料等行業(yè)。

殼聚糖(chitosan)又稱脫乙酰甲殼素，是由自然界廣泛存在的幾丁質(zhì)(chitin)經(jīng)過脫乙酰作用得到的，化學(xué)名稱為聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-β-d葡萄糖。殼聚糖是自然界唯一帶正電荷的堿性聚糖，廣泛用于醫(yī)藥、食品、化工、化妝品、水處理、金屬提取及回收、生化和生物醫(yī)學(xué)工程等諸多領(lǐng)域。殼聚糖被作為增稠劑、被膜劑列入國家食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)gb-2760。

殼寡糖是殼聚糖經(jīng)過酶法或者化學(xué)裂解后得到的一種聚合度在2-20之間的寡糖產(chǎn)品，分子量≤3000da，它具有殼聚糖所沒有的較高溶解度，全溶于水，容易被生物體吸收利用。殼寡糖具有抗氧化，抗腫瘤，降血脂，降血壓，抗菌抗炎等多種生物學(xué)活性，是一種極具開發(fā)潛力的食品，藥品原料，也是一種綠色飼料添加劑，可部分替代抗生素，2014年被國家衛(wèi)計委列為新食品原料。

殼聚糖水解酶類主要來源于微生物，主要包括細(xì)菌(芽孢桿菌、黃桿菌)、真菌(曲霉、毛霉、木霉等)。其中某些具有殼聚糖水解活性的酶本身是葡聚糖酶，屬于非專一性酶，不僅能夠內(nèi)切水解葡聚糖，而且能夠有效水解殼聚糖生成殼寡糖。而常見的專一性殼聚糖酶往往只能水解殼聚糖。普通的殼聚糖酶沒有被列入可用于食品和藥品的酶制劑種類，而葡聚糖酶是可用于食品和飼料添加的安全酶制劑。具有殼聚糖酶活性的葡聚糖水解酶用于殼寡糖的生產(chǎn)，安全性更有保障，更符合國家的食品安全法規(guī)。

殼聚糖酶解過程中需較長時間的高溫反應(yīng)(50-60℃，8小時)，因為高溫可以促進(jìn)底物的離子化，加速反應(yīng)的進(jìn)行；同時高濃度的殼聚糖底物具有較高的粘度，不利于實際生產(chǎn)操作，而高溫能夠有效降低底物粘度，加快反應(yīng)速度，提升產(chǎn)物殼寡糖的純度。常見殼聚糖酶耐熱性能普遍較差(溫度穩(wěn)定范圍35-45℃)，酶活力低(10-50u/ml)不能滿足生產(chǎn)的需求。因此只有兼具耐高溫性能好和高活性殼聚糖水解能力的酶，才能廣泛地用于水解殼聚糖生產(chǎn)殼寡糖的生產(chǎn)中。

(三)

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種具有殼聚糖水解活性的新型耐高溫雙功能葡聚糖酶(即prg酶)，該酶同時具有葡聚糖和殼聚糖水解活性，解決了現(xiàn)有殼聚糖生產(chǎn)中缺乏專一性、安全、耐高溫且能夠高效降解殼聚糖的水解酶的問題。prg酶水解殼聚糖能力略高于葡聚糖底物的能力；prg酶耐熱性能良好，最適反應(yīng)溫度55℃，在70℃水浴環(huán)境中處理120min，殘余酶活力還能夠達(dá)到71％。prg酶能夠水解10％濃度的殼聚糖底物生產(chǎn)低分子量殼寡糖，平均分子量為1200。prg酶在枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中高效整合分泌表達(dá)，酶活力單位達(dá)到1000u/ml，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價值。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種具有殼聚糖水解活性的雙功能葡聚糖酶，所述雙功能葡聚糖酶的氨基酸序列為seqidno.1所示，酶蛋白由306個氨基酸組成，其理論分子量：33009.1da。

本發(fā)明還提供一種所述雙功能葡聚糖酶的編碼基因，所述編碼基因核苷酸序列為seqidno.2所示。

本發(fā)明涉及一種由所述雙功能葡聚糖酶編碼基因構(gòu)建的重組載體以及由所述重組載體轉(zhuǎn)化制備的重組基因工程菌。

本發(fā)明所述雙功能葡聚糖酶基因(即prg)的重組載體優(yōu)選為pax01-prg。將本發(fā)明的新型雙功能葡聚糖酶基因插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點之間，使其受到強(qiáng)啟動子木糖啟動子調(diào)控，優(yōu)選插入到質(zhì)粒pax01上的bamhi和sacii限制性酶切位點之間，使該核苷酸序列位于木糖啟動子的下游并受其調(diào)控，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pax01-prg。工程菌優(yōu)選含雙功能葡聚糖酶基因prg的重組枯草芽孢桿菌bs168。

此外，本發(fā)明還提供一種所述雙功能葡聚糖酶在降解殼聚糖生產(chǎn)殼寡糖中的應(yīng)用，具體所述的應(yīng)用以含雙功能葡聚糖酶編碼基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的上清液提取的純酶為催化劑，以殼聚糖為底物，以ph5.0、100mm醋酸-醋酸鈉緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)構(gòu)成反應(yīng)體系，55℃反應(yīng)8小時，反應(yīng)液經(jīng)過陶瓷微濾膜(0.1微米孔徑)過濾，然后濾液冷凍干燥，獲得分子量小于1500da的低分子量殼寡糖，產(chǎn)物收率高達(dá)105％(該反應(yīng)是水合反應(yīng)，每一個化學(xué)鍵斷裂，都會有一個水分子加入到了產(chǎn)物中，因此最終產(chǎn)率高于100％)。

進(jìn)一步，所述反應(yīng)體系中，底物終濃度為100g/l，所述催化劑用量為5u/ml。

進(jìn)一步，本發(fā)明所述催化劑按如下方法制備：(1)將含雙功能葡聚糖酶編碼基因的重組工程菌(枯草芽孢桿菌bs168)單菌落接種至lb液體培養(yǎng)基，37℃、200rpm轉(zhuǎn)速搖床培養(yǎng)過夜(10小時)，獲得種子液；

(2)將種子液以十分之一體積的接種量接種至裝有5升發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，37℃，攪拌槳轉(zhuǎn)速200rpm，通氣量20升/分鐘，培養(yǎng)12小時至od600＝2，加入終濃度2mg/ml的d-木糖作為誘導(dǎo)劑，相同條件下(37℃，攪拌槳轉(zhuǎn)速200rpm，通氣量20升/分鐘)培養(yǎng)誘導(dǎo)48小時，高速離心機(jī)10000rpm離心發(fā)酵液，棄菌體，收集上清液，通過微孔濾膜(孔徑0.22微米)和陶瓷膜(孔徑0.1微米)先后過濾處理后，獲得澄清粗酶液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量組成：5％玉米淀粉，1％工業(yè)蛋白胨，0.5％玉米漿干粉，1％(nh4)2so4，0.2％mgso4，0.5％nacl，溶劑為去離子水，ph值7.0；

(3)采用deaesepharose陰離子交換樹脂對粗酶液進(jìn)行純化，以ph6、20mmtris-hcl緩沖液為平衡液，目的蛋白的洗脫液為含100mmnacl的ph6、20mmtris-hcl緩沖液，洗脫后收集含有目的蛋白的洗脫液，即為催化劑。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明的新型耐高溫雙功能葡聚糖酶的耐熱性能良好，最適作用溫度55℃，耐高溫性能超過已有的商品化殼聚糖降解酶。prg酶是一種優(yōu)良的酸性殼聚糖水解酶，在ph2.0-6.5的條件下水解殼聚糖底物時的酶活穩(wěn)定，最佳催化ph值為5.0，恰好能夠滿足配置高濃度殼聚糖底物所需的酸性環(huán)境要求(ph5.0左右)。prg酶能夠高效水解100g/l的高濃度殼聚糖底物，8小時內(nèi)徹底水解底物，產(chǎn)物為分子量在1500da以下的低分子量殼寡糖，而且沒有單糖副產(chǎn)物產(chǎn)生。本發(fā)明的新型耐高溫重組雙功能葡聚糖酶通過枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)高效分泌表達(dá)后能夠達(dá)到較高的發(fā)酵水平，酶活力能夠達(dá)到1000u/ml，大大高于目前殼聚糖水解酶的普遍生產(chǎn)水平(10-100u/ml)。本發(fā)明首次使用枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶，發(fā)酵原料價格低廉，生產(chǎn)周期較短(3天左右)，上清液直接收集粗酶液，可直接用于實際生產(chǎn)，整體工藝路線簡單。本發(fā)明的新型耐高溫重組雙功能葡聚糖在殼寡糖工業(yè)生產(chǎn)中使用可大大降低生產(chǎn)成本，顯示出更大的應(yīng)用潛力。

(四)附圖說明

圖1枯草芽孢桿菌重組載體圖譜。

圖2枯草芽孢桿菌表達(dá)雙功能葡聚糖酶的純化蛋白電泳圖，泳道m(xù)為中分子量蛋白marker，1為不帶重組質(zhì)粒bs168菌株發(fā)酵液上清，2為帶有重組質(zhì)粒的bs168菌株發(fā)酵液上清，3為經(jīng)過超濾和陶瓷膜過濾后的bs168發(fā)酵液上清粗酶液，4為陰離子交換樹脂純化后的酶液，5為純化后酶蛋白。

圖3雙功能葡聚糖酶的最適反應(yīng)溫度柱形圖。

圖4雙功能葡聚糖酶的最適反應(yīng)ph值柱形圖。

圖5雙功能葡聚糖酶的溫度耐受性能曲線圖。

圖6雙功能葡聚糖酶的ph耐受性能柱形圖。

圖7雙功能葡聚糖酶水解殼聚糖的產(chǎn)物hplc圖。

(五)具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

本發(fā)明以下實施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)j.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進(jìn)行；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。

大腸桿菌菌株(escherichiacoli)jm109、枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)bs168、載體pax01購自德國mobitec公司。

質(zhì)粒dna提取試劑盒，膠回收試劑盒，pcr純化試劑盒購自上海生工公司。限制性內(nèi)切酶購自美國thermol公司。

lb液體培養(yǎng)基質(zhì)量組成：0.5％酵母粉，1％胰蛋白胨，1％nacl，溶劑為去離子水，ph7.0。

lb固體培養(yǎng)基質(zhì)量組成：0.5％酵母粉，1％胰蛋白胨，1％nacl，瓊脂2％，溶劑為去離子水，ph7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量組成：5％玉米淀粉，1％工業(yè)蛋白胨，0.5％玉米漿干粉，1％硫酸銨，0.2％mgso4，0.5％nacl，溶劑為去離子水，ph7.0。

實施例1、prg酶基因的克隆

運(yùn)用dna提取試劑盒，提取解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)cctccm2016558基因組dna，以dna為模板，設(shè)計雙功能酶引物(prg5ecori，prg3noti)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，將pcr產(chǎn)物由bamhi和sacii進(jìn)行雙酶切，然后與經(jīng)過同樣酶切的表達(dá)載體pax01相連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌jm109感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)15μg/ml的紅霉素抗生素篩選后，菌落pcr獲得陽性克隆。提取陽性克隆的質(zhì)粒。送樣到上海英駿生物公司測序，測序結(jié)果表明，所獲得重組載體含有prg酶基因完整的開放閱讀框，此載體被命名為pax01-prg，載體圖譜見圖1。該prg酶基因，全長918bp，編碼306個氨基酸，核苷酸序列為seqidno.1所示，氨基酸序列為seqidno.2所示。

擴(kuò)增所用引物如下：

prg5-ecori：5’gaattcatggtcaagaagaaaaag3’

prg3-bamhi：5’ggatccgtaagtccaccaattaccac3’

實施例2、包含prg酶基因的枯草芽孢桿菌工程菌的構(gòu)建

將實施例1中獲得的重組表達(dá)載體pax01-prg采用saci進(jìn)行線性化，線性化后的重組載體電擊轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌bs168，電轉(zhuǎn)化后涂布于lb(neo+)平板上進(jìn)行篩選，得到枯草芽孢桿菌重組菌株，記為重組菌株pax01-prg-168?？莶菅挎邨U菌電轉(zhuǎn)化方法如下：

一、感受態(tài)細(xì)胞的制備

(1)從新鮮培養(yǎng)的平板上接種一個枯草芽孢桿菌bs168單菌落至3mllb液體培養(yǎng)基中，250rpm，37℃培養(yǎng)過夜(16h)。

(2)接種1.5ml過夜培養(yǎng)的種子至150ml(裝于500ml的三角瓶中)新鮮的lb培養(yǎng)基中，200rpm，37℃培養(yǎng)，至菌數(shù)達(dá)到約1×10⁸cells/ml。

(3)將菌液轉(zhuǎn)移至50ml的離心管中，冰浴15min，然后4℃，4,500rpm，15min，離心收集菌體。

(4)棄上清，用30ml冰冷的10％甘油重新垂懸菌體(輕輕吹打)，冰浴15min，然后4℃，4,500rpm，15min，離心收集菌體。

(5)棄上清，用15ml冰冷的10％的甘油垂懸菌體重懸菌體，冰浴15min，然后4℃，4,500rpm，15min，離心收集菌體。

(6)用2ml預(yù)冷的10％的甘油之中重懸菌體，細(xì)胞濃度1×10¹⁰cells/ml。

(7)將感受態(tài)細(xì)胞分裝于1.5ml的離心管中，每份50μl，超低溫速凍之后，于-70℃保藏。

二、電轉(zhuǎn)化

(1)冰上融化感受態(tài)細(xì)胞，然后加入載體3μl到感受態(tài)細(xì)胞中。

(2)冰浴5min，加入到預(yù)冷的電擊杯中，冰浴2min。

(3)設(shè)置儀器參數(shù)。電壓1500v，電擊時間2.5ms。

(4)將菌體轉(zhuǎn)移到0.2cm狹縫的電轉(zhuǎn)化杯中，輕彈幾下杯子讓樣品沉到底部。裝好杯子。電擊一次。

(5)電擊完畢取出杯子并立即加入500μlsmmp溶液，洗脫感受態(tài)細(xì)胞，加入到1.5ml離心管中，37℃，250rpm，復(fù)蘇1h。

(6)涂布相應(yīng)的lb抗性平板(neo+)，37℃培養(yǎng)36-48h。

(7)smmp溶液：55ml2×smm，40ml4×pab，5ml10％(w/v)bsa，調(diào)ph值到7.0，過濾除菌。

2×smm：25ml0.2m的馬來酸(順丁烯二酸)鈉鹽，40ml0.1nnaoh，調(diào)ph值到6.5，加入5ml1mmgcl2，42.7g蔗糖，溶解定容至125ml，過濾除菌。

4×pab：牛肉膏6g，酵母膏6g，蛋白胨20g，葡萄糖4g，nacl14g，k2hpo414.72g，kh2po45.28g。

實施例3、prg酶重組菌株的高效表達(dá)和純化

將實施例2重組菌株pax01-prg-168接種lb液體培養(yǎng)基，37℃、200rpm轉(zhuǎn)速搖床，過夜培養(yǎng)，即為種子液。

將種子液按照體積百分比10％的接種量接種至裝有5升發(fā)酵培養(yǎng)基的10升發(fā)酵罐中，37℃，200rpm攪拌轉(zhuǎn)速，通氣量20升/分鐘，培養(yǎng)12小時至od600＝2，加入終濃度為2mg/ml的d-木糖作為誘導(dǎo)劑，37℃，200rpm轉(zhuǎn)速，通氣量20升/分鐘，誘導(dǎo)48小時。10000rpm離心，取上清液，通過微孔濾膜(孔徑0.22微米)和陶瓷膜(孔徑0.1微米)先后過濾后，獲得澄清粗酶液。

采用deaesepharose陰離子交換樹脂對粗酶液進(jìn)行純化，平衡液為ph6.0的20mmtris-hcl緩沖液，目的蛋白的洗脫液為含100mmnacl的ph6.0、20mmtris-hcl緩沖液，收集目的蛋白，即為prg酶純酶溶液，總體積約為5.5ml，其酶活單位約為10000u/ml。

純化后的目的蛋白采用sds-page電泳進(jìn)行純度和分子量分析，電泳結(jié)果見圖2。sds-page電泳方法按照分子克隆中參考方法進(jìn)行。

實施例4、prg酶的殼聚糖酶活力測定

采用dns法進(jìn)行總活力檢測。

1個酶活單位(u)定義為：在規(guī)定條件(ph5.0，55℃，質(zhì)量濃度1％膠體殼聚糖底物)下，每分鐘釋放出具有相當(dāng)于1μmol葡萄糖反應(yīng)力的還原性碳水化合物所需的酶量(μmol/min)，得出實施例3制備的prg酶純酶水解殼聚糖底物的總活力約為10000u/ml。

實施例5、prg酶的葡聚糖酶活力測定

采用dns法進(jìn)行總活力檢測。

1個酶活單位(u)定義為：在規(guī)定條件(ph5.0，55℃，質(zhì)量濃度1％beta-1,3葡聚糖底物)下，每分鐘釋放出具有相當(dāng)于1μmol葡萄糖反應(yīng)力的還原性碳水化合物所需的酶量(μmol/min)，得出實施例3制備的prg酶純酶水解葡聚糖底物的總活力約為8500u/ml。

實施例6、prg酶水解殼聚糖底物的性質(zhì)測定

1、比活力測定

將實施例3制備的prg酶純酶，采用bradford試劑盒(上海生工公司)測定蛋白濃度，得出該prg酶純酶蛋白濃度約為2.1mg/ml，酶蛋白的活力單位數(shù)為10000u/ml，經(jīng)過計算，可得出實施例3制備的prg酶純酶的比活力為4761u/mg。

2、最適反應(yīng)溫度及ph測定

最適反應(yīng)溫度：將實施例3制備的prg酶純酶用100mm醋酸-醋酸鈉緩沖液(ph5.0)稀釋為1000u/ml的酶液。取25微升酶液，分別加入5ml、100mm醋酸-醋酸鈉緩沖液(ph5.0)，終濃度100g/l膠體殼聚糖底物，酶終濃度達(dá)到5u/ml。上述體系分別在不同溫度(25、30、35、4、45、50、55、60、65、70、75℃)條件下反應(yīng)20分鐘，通過dns法測定體系中的還原糖的含量，從而計算prg酶的酶活。以最高酶活力為100％，其它溫度下測得的酶活與之相比，即得到該溫度下的相對酶活。最適反應(yīng)溫度曲線見圖3。

最適反應(yīng)ph：將實施例3制備的prg酶純酶酶液用100mm醋酸-醋酸鈉緩沖液(ph5.0)稀釋為1000u/ml的酶液。取25微升酶液，分別加入5ml不同ph(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)100mm醋酸-醋酸鈉緩沖液，終濃度100g/l的膠體殼聚糖底物，酶終濃度達(dá)到5u/ml。上述體系分別在50℃水浴條件下反應(yīng)20分鐘，通過dns法測定體系中的還原糖的含量，分別計算酶活力。ph3.0、3.5、4.0、4.5的條件采用100mm醋酸醋酸鈉緩沖液，ph5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的條件采用50mmtris-hcl緩沖液。采用最高酶活為100％，其他檢測結(jié)果與之相比，即得到不同ph檢測條件下的相對酶活。最適反應(yīng)ph曲線見圖4。

結(jié)果表明：prg酶的最適反應(yīng)溫度為60℃，最適反應(yīng)ph為5.0。

3、耐熱性能測定

不同溫度耐熱性能：將實施例3制備的prg酶純酶用100mm醋酸-醋酸鈉緩沖液(ph5.0)稀釋到1000u/ml的酶液。分別取酶液25微升，加入到5ml、100mm醋酸-醋酸鈉緩沖液(ph5.0)，終濃度100g/l膠體殼聚糖底物，酶濃度達(dá)到5u/ml。上述體系分別在不同溫度下(30、40、50、60、70℃)的水浴保溫10-120分鐘后，采用實施例3中的酶活測定方法，測定殘余酶活力。以未經(jīng)處理的樣品含有的酶活力為對照計算其他樣品中的相對酶活，結(jié)果見圖5。

結(jié)果顯示prg酶的耐熱性能良好，在ph5.0，30-60℃環(huán)境中處理120min，酶活力基本沒有損失；在70℃環(huán)境中處理120min，殘余酶活力還能夠達(dá)到71％，完全可達(dá)到水解殼聚糖制備殼寡糖的生產(chǎn)要求。

4、ph穩(wěn)定性測定

將實施例3制備的prg酶純酶用100mm醋酸-醋酸鈉緩沖液(ph5.0)稀釋到1000u/ml的酶液。分別取酶液25微升，加入到5ml不同ph值(2、3、4、5、6、7、8)的緩沖液，終濃度濃度100g/l膠體殼聚糖底物，酶終濃度達(dá)到5u/ml，分別30℃放置8h，以未處理的酶液為對照，測定prg酶的相對酶活。ph2和3緩沖液采用50mm的甘氨酸-鹽酸緩沖液，ph4和5緩沖液采用100mm的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，ph4和5緩沖液采用200mm的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液,ph6、7、8緩沖液采用50mm的tris-hcl緩沖液。結(jié)果如圖6所示。

prg酶的最適催化ph為5.0，并且在ph3-7范圍內(nèi)較為穩(wěn)定，30℃保存8小時，殘余相對酶活均可達(dá)到80％以上，完全可以滿足殼聚糖水解所需的ph5.0的水解條件。

5、金屬離子和edta對酶活力的影響

將實施例3制備的prg酶純酶用100mm醋酸-醋酸鈉緩沖液(ph5.0)稀釋到1000u/ml，在5ml、100mm醋酸-醋酸鈉緩沖液(ph5.0)中加入終濃度100g/l膠體殼聚糖，加入酶5u/ml，再分別加入終濃度為5mm的na⁺、mg²⁺、ca²⁺、zn²⁺、fe²⁺、fe³⁺、mn²⁺、co²⁺、cu²⁺和edta。以不加任何金屬離子的體系酶活力為100％，其它溫度下測得的酶活與之相比，即得到該溫度下的相對酶活。結(jié)果如表1所示。

表1金屬離子和edta對prg酶活力的影響

結(jié)果表明，mn²⁺和co²⁺對酶催化有較強(qiáng)的增強(qiáng)作用，相對酶活力分別提高至230％和170％，mg²⁺、ca²⁺、na⁺對酶催化有一定的激活作用，酶活性分別促進(jìn)45％、43％、和11％；edta、zn²⁺對酶催化沒有影響；其余金屬離子ag⁺、fe²⁺對酶催化均有不同程度的抑制作用；而sds和fe³⁺、cu²⁺完全抑制了酶的催化活性。

實施例7、prg粗酶水解高濃度殼聚糖底物的實驗

水解反應(yīng)體系：取實施例3制備的粗酶液500微升(約500u)加入到100ml、ph5.0、100mm醋酸醋酸鈉緩沖液中，再加入終濃度100g/l的膠體殼聚糖底物，酶濃度為5u/ml，總反應(yīng)體系100ml，55℃水浴反應(yīng)8小時。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)體系10000rpm轉(zhuǎn)速離心20min，取上清液，陶瓷膜過濾(0.1微米孔徑)，流出液準(zhǔn)備hplc檢測。

hplc所需設(shè)備：hplc儀：waters公司產(chǎn)品，型號2414，層析柱：糖氨基柱(amindbeh,waters)，流動相：乙腈/水(體積比2:3)，柱溫40℃，上樣量10微升，檢測設(shè)備：waters示差折光顯示器。結(jié)果見圖7。

由圖7的結(jié)果，可以看出prg粗酶水解殼聚糖的產(chǎn)物主要是具有較高生物活性的2-6聚合度的殼寡糖，沒有單糖，沒有水解完全的殼聚糖底物也很少。說明prg粗酶催化殼聚糖水解是采用內(nèi)切模式進(jìn)行，水解較為徹底。殼二糖的抗炎生物活性最高。殼六糖具有很好的腫瘤細(xì)胞抑制活性。

現(xiàn)有的殼聚糖專一性降解酶的報道中，很多來源于海洋細(xì)菌的酶類，最適催化溫度一般在30-45℃，很難滿足殼聚糖水解生產(chǎn)殼寡糖的50-60℃催化條件的要求。報道的非專一酶，例如木瓜蛋白酶，綠色木霉纖維素酶等，雖然能夠降解殼聚糖，但是活力很低，酶活力一般在10-100u/ml的水平。同時這些非專一性酶很多具有外切酶活性，產(chǎn)物中含有很大比例的單糖(n-乙酰葡萄糖胺)，眾所周知，單糖是基本沒有生物活性的，可以歸為生產(chǎn)的副產(chǎn)物。prg酶水解殼聚糖的產(chǎn)物主要是2-6聚合度的寡糖，不產(chǎn)生單糖。

prg酶是一種性能優(yōu)異的耐高溫高活性葡聚糖酶，具有很強(qiáng)的殼聚糖水解能力?？莶菅挎邨U菌重組分泌表達(dá)的prg酶，表達(dá)量很高，發(fā)酵液上清中酶活力單位能夠達(dá)到1000u/ml。發(fā)酵液上清直接作為粗酶液水解100g/l濃度的殼聚糖底物生產(chǎn)殼寡糖，在8小時內(nèi)能夠完成整個水解反應(yīng)，主要產(chǎn)物是具有較高生物活性的2-6聚合度的殼寡糖，沒有單糖副產(chǎn)物產(chǎn)生。本發(fā)明提供了一種高效降解殼聚糖的雙功能葡聚糖酶，還證實作為食品安全微生物的枯草芽孢桿菌是表達(dá)殼聚糖水解酶類的適宜的宿主菌。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的prg酶將會在工業(yè)殼寡糖生產(chǎn)中展現(xiàn)出有巨大的應(yīng)用價值。

sequencelisting

<110>菩蕊生物科技（明光）有限公司

<120>一種具有殼聚糖水解活性的雙功能葡聚糖酶、基因、載體、工程菌及其應(yīng)用

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