本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及抗pd-l1蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的抗pd-l1單克隆抗體和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

程序性細(xì)胞死亡因子1配體1(processeddeath-1ligand1，pd-l1)又稱為b7-h1、cd274，是由cd274基因編碼的一個(gè)抑制性共刺激分子，是dong等于1999年從人類基因庫(kù)中搜尋b7.1和b7.2免疫球蛋白可變區(qū)及恒定區(qū)同源分子時(shí)在胎盤cdna文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)的。pd-l1屬i型跨膜糖蛋白,有290個(gè)氨基酸,包括胞外區(qū)、疏水跨膜區(qū)和尾部胞漿區(qū)。pd-l1蛋白則廣泛表達(dá)于淋巴細(xì)胞,如活化t和b細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、胸腺內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞以及心臟和胎盤等部位，同時(shí)也在多種腫瘤細(xì)胞及腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞中高表達(dá)，如肺癌、乳腺癌、食管癌、淋巴瘤等。

pd-l1在免疫調(diào)節(jié)中扮演著更關(guān)鍵的角色。腫瘤細(xì)胞表達(dá)的pd-l1與表達(dá)在活化t細(xì)胞上的負(fù)性共刺激分子pd-1結(jié)合，可抑制t細(xì)胞增殖，并促進(jìn)活化t細(xì)胞的凋亡。近年來，大量的研究表明pd-l1可以作為一種重要的分子標(biāo)志物在各種腫瘤中的靶向治療和預(yù)后診斷中發(fā)揮著重要的作用。

目前臨床上通常用免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,ihc)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)腫瘤細(xì)胞中pd-l1的表達(dá)狀況，其實(shí)驗(yàn)方法的核心為特異性結(jié)合pd-l1的單克隆抗體，其性能的優(yōu)劣直接決定著整個(gè)檢測(cè)的靈敏度和特異性。因此，研制出一種結(jié)合特異性較高的針對(duì)pd-l1蛋白的單克隆抗體具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供抗pd-l1蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的抗pd-l1單克隆抗體和應(yīng)用，提高所述雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單抗與pd-l1蛋白的結(jié)合特異性并應(yīng)用到相關(guān)產(chǎn)品的制備中。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

抗pd-l1蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，保藏編號(hào)為cgmccno：12287。

本發(fā)明所述抗pd-l1蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞由以下方法制備獲得：

(1)重組表達(dá)載體的構(gòu)建：根據(jù)pd-l1orf核苷酸序列(pd-l1orf核苷酸序列如seqidno.1所示，870bp；pd-l1氨基酸序列如seqidno.2所示)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，基因兩側(cè)分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)sgfi和mlui，插入表達(dá)載體pcmv6-entry(貨號(hào)ps100001，origene公司)，構(gòu)建pd-l1重組表達(dá)質(zhì)粒rc213071；

(2)pd-l1重組蛋白的表達(dá)與純化：將pd-l1重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hek293t，裂解離心取上清，ddk親和層析柱純化，獲得純化的pd-l1重組蛋白；

(3)單克隆抗體的篩選與制備：采用上述純化的pd-l1重組蛋白免疫balb/c小鼠，取小鼠脾臟細(xì)胞與sp2/0細(xì)胞進(jìn)行融合，有限稀釋法獲得單克隆，elisa法篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，獲得能分泌抗pd-l1特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株；通過無(wú)血清培養(yǎng)基制備抗體，通過親和層析柱純化獲得pd-l1單克隆抗體。通過免疫組化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該單克隆抗體的靈敏度和特異性。

經(jīng)過上述方法制備后，篩選出能夠穩(wěn)定分泌抗pd-l1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，命名為umab228，亞型鑒定為igg1，并于2016年4月27日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為cgmccno：12287。

同時(shí)，本發(fā)明還提供一種抗pd-l1蛋白單克隆抗體，由保藏編號(hào)為cgmccno：12287的雜交瘤細(xì)胞分泌產(chǎn)生。制備抗pd-l1蛋白單克隆抗體可采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)方法，如通過無(wú)血清培養(yǎng)基制備抗體，通過親和層析柱純化獲得pd-l1單克隆抗體。

本發(fā)明所述保藏編號(hào)為cgmccno：12287的雜交瘤細(xì)胞染色體穩(wěn)定，其分泌產(chǎn)生的抗pd-l1蛋白單克隆抗體為igg1型，效價(jià)較高。所述單克隆抗體的免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，其能夠特異性識(shí)別肺癌組織、乳腺癌組織、食管癌組織、淋巴瘤組織、正常扁桃體組織中的pd-l1蛋白。

同時(shí)，采用origene高密度蛋白芯片檢測(cè)所述單抗的特異性試驗(yàn)表明，本發(fā)明所述單克隆抗體與近10000種其他蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。

因此，本發(fā)明還提供了保藏編號(hào)為cgmccno：12287的的雜交瘤細(xì)胞在制備抗pd-l1蛋白單克隆抗體中的應(yīng)用以及所分泌的抗pd-l1蛋白單克隆抗體在制備檢測(cè)pd-l1蛋白的免疫檢測(cè)產(chǎn)品中的應(yīng)用。

作為優(yōu)選，所述免疫檢測(cè)產(chǎn)品為試劑盒、試紙或芯片。

本發(fā)明還提供一種免疫組化檢測(cè)的試劑盒，包括保藏編號(hào)為cgmccno：12287的雜交瘤細(xì)胞分泌產(chǎn)生的抗pd-l1蛋白單克隆抗體。所述免疫檢測(cè)試劑盒可檢測(cè)腫瘤組織及其微環(huán)境中pd-l1的表達(dá)狀況。

此外，本發(fā)明還提供保藏編號(hào)為cgmccno：12287的雜交瘤細(xì)胞分泌產(chǎn)生的抗pd-l1蛋白單克隆抗體在制備標(biāo)記腫瘤組織及其微環(huán)境中淋巴細(xì)胞的試劑盒中的應(yīng)用。

作為優(yōu)選，所述腫瘤包括肺癌、淋巴瘤、食管癌、肝癌和乳腺癌。

本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞可穩(wěn)定分泌產(chǎn)生抗pd-l1蛋白單克隆抗體，且與pd-l1蛋白特異性結(jié)合，而與蛋白芯片上近10000種其他蛋白無(wú)交叉反應(yīng)，顯著提高了pd-l1蛋白免疫檢測(cè)的特異性、準(zhǔn)確性和可靠性，廣泛適用于各種腫瘤組織及其微環(huán)境中pd-l1的檢測(cè)。

生物保藏信息說明

umab228，分類命名為程序性死亡分子1(pd-l1)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，于2016年4月27日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為cgmccno：12287。

附圖說明

圖1所示為實(shí)施例1中克隆位點(diǎn)圖；

圖2所示為實(shí)施例2中pd-l1蛋白westernblot檢測(cè)結(jié)果圖，以anti-ddk檢測(cè)pd-l1蛋白在hek293t細(xì)胞中的表達(dá)，其中泳道l為轉(zhuǎn)染空載體的hek293t細(xì)胞裂解液為抗原的檢測(cè)結(jié)果、泳道r為轉(zhuǎn)染pcmv6-pd-l1質(zhì)粒的hek293t細(xì)胞裂解液抗原的檢測(cè)結(jié)果；

圖3所示為實(shí)施例2中pd-l1蛋白sds-page結(jié)果圖；

圖4所示實(shí)施例4肺癌組織免疫組化檢測(cè)結(jié)果圖(一抗為umab228分泌產(chǎn)生的pd-l1單抗，1:50)；

圖5所示實(shí)施例4淋巴瘤組織免疫組化檢測(cè)結(jié)果圖(一抗為umab228分泌產(chǎn)生的pd-l1單抗，1:50)；

圖6所示實(shí)施例4食管癌組織免疫組化檢測(cè)結(jié)果圖(一抗為umab228分泌產(chǎn)生的pd-l1單抗，1:50)；

圖7所示實(shí)施例4乳腺癌組織免疫組化檢測(cè)結(jié)果圖(一抗為umab228分泌產(chǎn)生的pd-l1單抗，1:50)；

圖8所示實(shí)施例4扁桃體組織免疫組化檢測(cè)結(jié)果圖(一抗為umab228分泌產(chǎn)生的pd-l1單抗，1:50)；

圖9所示實(shí)施例5origene蛋白芯片鑒定結(jié)果圖(一抗為umab228分泌產(chǎn)生的pd-l1單抗,1:100；二抗為alexa647-標(biāo)記的驢抗鼠igg，1:500)。

具體實(shí)施方式：

本發(fā)明公開了抗pd-l1蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的抗pd-l1單克隆抗體和應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

下面就本發(fā)明提供的抗pd-l1蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的抗pd-l1單克隆抗體和應(yīng)用做進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1：pd-l1重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)pd-l1的cdna序列合成基因，設(shè)計(jì)兩條引物并分別引入酶切位點(diǎn)sgfi和mlui，克隆入表達(dá)載體pcmv6-entry，建立pd-l1全長(zhǎng)蛋白的重組真核表達(dá)質(zhì)粒。克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)如圖1所示。

實(shí)施例2：pd-l1重組蛋白的表達(dá)與純化

1、轉(zhuǎn)染hek293t細(xì)胞：hek293t細(xì)胞以1:3傳至培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)；取7.5mldmem(無(wú)血清及抗生素)至50ml管中，加入300μlpeimegatran1.0混勻；加入75μgpd-l1重組質(zhì)粒dna至混勻液中，混勻并靜置30分鐘；分別取515μl至各培養(yǎng)皿中于37℃5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，每皿細(xì)胞添加25μl2m丁酸鈉至終濃度5mm。

2、裂解細(xì)胞：轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，進(jìn)行細(xì)胞裂解。吸去培養(yǎng)基，加入1mlpbs進(jìn)行漂洗，吸去pbs。加入1ml裂解緩沖液，使用前加入蛋白酶抑制劑pi和pmsf。置于冰盒中在搖床上振蕩，收集所有培養(yǎng)皿中得裂解液，4度離心，收集上清。

3、ddk親和層析柱純化：以0.45μm，33mmpvdf膜濾器過濾離心后的裂解液上清并轉(zhuǎn)入15ml管，加入混合好的beads1ml，封口后放入360度混勻器中，于4℃結(jié)合2小時(shí)；取出15ml管，將裂解液倒入bio-rad層析柱中，并接住穿透液，滴盡后穿透液取樣wb檢測(cè)，見圖2；以裂解緩沖液沖洗柱料1-2次，滴盡后再用tbst沖洗beads3次，滴盡后用0.1mglycineph3.5洗脫，第一次200μl，滴盡不收集，第二、三次各500μl，第三次250μl，收集至一個(gè)1.5mltube中，并迅速加入nah2po4(ph＝11.0)中和至ph7.0左右，每管加入甘油至終濃度為10％，tween-80至終濃度為0.1％。純化后的pd-l1蛋白用sds-page鑒定，見圖3。

由圖2結(jié)果可見，標(biāo)簽抗體anti-ddk能檢測(cè)到轉(zhuǎn)染pcmv6-pd-l1的重組質(zhì)粒的hek293t細(xì)胞裂解液中pd-l1重組蛋白(r)，由于pd-l1是i型跨膜糖蛋白，因此其蛋大小為45～55kda之間多條帶，與預(yù)期相符，表明pd-l1重組蛋白正確表達(dá)。

由圖3結(jié)果可見，經(jīng)過ddk親和層析柱純化，glycine洗脫可得到高純度的pd-l1重組蛋白。

實(shí)施例3：抗pd-l1單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞及其單克隆抗體的制備篩選

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法用重組產(chǎn)生的純化的全長(zhǎng)pd-l1重組蛋白(以下簡(jiǎn)稱為pd-l1抗原)用于對(duì)b6/c57小鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)進(jìn)行免疫。具體方法如下：

1、動(dòng)物免疫：經(jīng)過純化的pd-l1抗原以完全弗氏佐劑乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周齡balb/c小鼠，免疫劑量為50μg/只，間隔兩周后進(jìn)行第二次免疫，以不完全弗氏佐劑乳化，免疫劑量為50μg/只。免疫兩次后取尾血以elisa法梯度稀釋測(cè)定血清效價(jià)；根據(jù)結(jié)果確定是否加強(qiáng)免疫，選取抗體效價(jià)最高的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合。

2、細(xì)胞融合：骨髓瘤細(xì)胞采用balb/c來源的sp2/0，融合時(shí)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；取已免疫小鼠脾臟，制成淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液；小鼠脾淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以1:5-1:10混合，滴加37℃的50％peg(ph8.0)1ml，加入不完全培養(yǎng)基及其余終止液，離心棄上清后加入hat培養(yǎng)基懸浮混勻，mc定容到50ml，分裝到3.5cm培養(yǎng)皿中，放于濕盒中，置于37℃、5％co2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

3、篩選和克隆：融合7-10天內(nèi)挑選細(xì)胞克隆，使用純化的pd-l1重組蛋白進(jìn)行elisa測(cè)試。標(biāo)記細(xì)胞株號(hào)。對(duì)陽(yáng)性孔細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋，每次有限稀釋后5-6天測(cè)定elisa值，挑取od280陽(yáng)性值較高的單克隆孔進(jìn)行有限稀釋，直至elisa測(cè)定96孔板全板結(jié)果為陽(yáng)性。挑取陽(yáng)性值高的單克隆定株。其對(duì)應(yīng)融合板細(xì)胞株為umab228。

4、細(xì)胞上清單抗的制備與純化：將細(xì)胞株umab228用含15％血清的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)于10cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，擴(kuò)培至約4×10⁷個(gè)時(shí)，800rpm離心5min，棄上清并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到2l轉(zhuǎn)瓶中，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，使細(xì)胞密度約為3×10⁵個(gè)/ml。繼續(xù)培養(yǎng)1～2周后，當(dāng)細(xì)胞死亡率達(dá)到60％-70％時(shí)(此時(shí)細(xì)胞密度大概為1-2×10⁶個(gè)/ml)，收取細(xì)胞懸液6000rpm高速離心20min，取上清，親和層析法進(jìn)行上清純化，根據(jù)抗體亞型選擇相應(yīng)柱料，細(xì)胞株umab228產(chǎn)生的單抗亞型為igg1，采用proteing進(jìn)行純化。純化后的單抗?jié)舛葴y(cè)定、分裝(100ul/管，濃度為1mg/ml)、保存在4-8℃。

實(shí)施例4：umab228分泌產(chǎn)生的單克隆抗體為一抗的免疫組化檢測(cè)

(1)實(shí)驗(yàn)方法：

1、分別取肺癌、淋巴瘤、食管癌、乳腺癌和扁桃體組織塊進(jìn)行石蠟包埋，使用sakura組織切片機(jī)進(jìn)行切片，組織厚度為4μm。

2、脫蠟與水化：分析純二甲苯3×10min，無(wú)水乙醇3×10min，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，去離子水浸泡3min×3次

3、加入抗原修復(fù)液(1mmedta,ph8.5的10mmtris-hcl緩沖液)高壓鍋高壓熱修復(fù)2.5min，待高壓鍋溫度降至約90℃時(shí)，打開高壓鍋，取出標(biāo)本，然后自然冷卻至室溫。去離子水浸泡3min×3次。

4、使用3％過氧化氫滅活組織內(nèi)源性過氧化物酶，室溫靜置10min。去離子水浸泡5min×3次。

5、加上封閉液(pbs+5％脫脂奶粉+5％正常山羊血清)，37℃孵育60min。

6、去除封閉液，勿沖洗，加入pd-l1單抗(umab228分泌產(chǎn)生)，稀釋比：1:50，使用封閉液進(jìn)行稀釋。置于濕盒中，37℃孵育60min。pbst(0.1％tween-20)洗滌2次，每次洗滌5min。pbst(0.02％tween-20)洗滌1次，每次洗滌5min。

7、滴加聚合物hrp染色試劑盒中試劑pv6000(catlogno.pv-6000)，37℃孵育15分鐘。使用pbs洗滌3次，每次5min。

8、應(yīng)用dab溶液(中杉金橋zli-9019)顯色，顯色3～10min。蒸餾水洗滌。

9、蘇木精復(fù)染細(xì)胞核2min，蒸餾水漂洗，1％鹽酸分化。蒸餾水漂洗3次，室溫靜置1min。

10、脫水和透明：75％乙醇5min，100％乙醇5minx3次，85％乙醇5min，95％乙醇5min，100％乙醇3×5min；二甲苯3×5min，中性樹膠封片。

11、鏡檢，見圖4、圖5、圖6、圖7和圖8。

(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

由圖4結(jié)果可見，pd-l1蛋白在肺癌組織的腫瘤細(xì)胞呈特異性細(xì)胞膜表達(dá)，如圖箭頭所示腫瘤細(xì)胞。

由圖5結(jié)果可見，pd-l1蛋白在淋巴瘤組織中的淋巴細(xì)胞上呈特異性細(xì)胞膜表達(dá)，如圖箭頭所示淋巴瘤細(xì)胞。

由圖6結(jié)果可見，pd-l1蛋白在食管癌組織的腫瘤細(xì)胞呈特異性細(xì)胞膜表達(dá)，如圖箭頭所示腫瘤細(xì)胞。

由圖7結(jié)果可見，pd-l1蛋白在乳腺癌組織的腫瘤細(xì)胞呈特異性細(xì)胞膜表達(dá)，如圖箭頭所示腫瘤細(xì)胞。

由圖8結(jié)果可見，pd-l1蛋白在正常扁桃體組織中的淋巴細(xì)胞上呈特異性細(xì)胞膜表達(dá)，如圖箭頭所示淋巴細(xì)胞。

結(jié)果表明本發(fā)明umab228產(chǎn)生的單克隆抗體能夠特異性識(shí)別肺癌、淋巴瘤組織、食管癌、乳腺癌和扁桃體組織中的pd-l1蛋白。

實(shí)施例5：umab228分泌產(chǎn)生的單克隆抗體的特異性蛋白芯片檢測(cè)

origene高密度蛋白芯片上包含10000個(gè)hek293t細(xì)胞蛋白過表達(dá)裂解物，每種蛋白裂解液在芯片上具有兩個(gè)拷貝的重復(fù)。蛋白裂解液被印跡在硝酸纖維素膜上。每一鐘蛋白裂解液的定位可以通過excel文件進(jìn)行準(zhǔn)確定位。蛋白芯片上蛋白分為40個(gè)亞矩陣，每個(gè)亞矩陣上有一些參照，通過參照，可以定量每個(gè)芯片點(diǎn)上蛋白的含量，監(jiān)控每次免疫反應(yīng)數(shù)據(jù)的重復(fù)性，以及定位陽(yáng)性信號(hào)的方向。以下為使用origene蛋白(origenecatpa100001)芯片進(jìn)行umab228分泌產(chǎn)生的單克隆抗體鑒定實(shí)驗(yàn)的方法：

1、將一張蛋白芯片放在50ml離心管中，使用40ml去離子水浸潤(rùn)芯片，置于搖床上，室溫混合30分鐘。棄掉去離子水，使用10mlpbst平衡芯片。室溫處理10分鐘。

2、向50ml離心管中加入40ml5％脫脂牛奶(用pbst進(jìn)行稀釋)置于搖床上，室溫封閉30分鐘。

3、使用封閉液(5％脫脂牛奶)稀釋一抗umab228，稀釋比列為1：100。

4、將潔凈的封口膜粘貼到實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，滴加250-300μl一抗在封口膜上。

5、將蛋白芯片從封閉液中抽出，將蛋白芯片nc膜的一面朝下，從芯片的一邊接觸抗體，慢慢滑下，依靠液體表面張力，抗體將慢慢浸潤(rùn)芯片nc膜，直至整張nc膜浸潤(rùn)在一抗溶液中。整個(gè)操作過程避免產(chǎn)生氣泡。將芯片移到4℃環(huán)境下，靜置，一抗孵育過夜。在芯片上加蓋培養(yǎng)皿蓋，其上黏附一張濕紙巾，以防止長(zhǎng)時(shí)間孵育導(dǎo)致抗體蒸發(fā)。

6、第二天將芯片移至50ml離心管中，使用pbst漂洗芯片兩次，去除多余的抗體。使用40mlpbst(0.1％tween-20)洗滌芯片，置于搖床上混合均勻，洗滌三次，每次洗滌5min。

7、使用封閉液(5％脫脂牛奶)稀釋二抗alexa647-標(biāo)記的驢抗鼠igg，稀釋比例為1：500。

8、按照上述步驟4，步驟5進(jìn)行二抗孵育操作。室溫孵育1小時(shí)。在芯片上方用鋁箔紙遮蓋，以防止發(fā)生信號(hào)漂白。

9、按照上述步驟6，使用pbst洗滌芯片。

10、使用去離子水沖洗芯片，以去除殘余的鹽分和變性劑。

11、室溫干燥芯片，確保芯片完全干燥。

12、使用芯片掃描儀讀取熒光信號(hào)。

13、根據(jù)bsa-cy3以及bsa-cy5確定芯片方向以及陽(yáng)性信號(hào)的位點(diǎn)。

14、根據(jù)陽(yáng)性信號(hào)位點(diǎn)找出對(duì)應(yīng)蛋白裂解液id，根據(jù)裂解液數(shù)據(jù)庫(kù)信息，查找到對(duì)應(yīng)蛋白名稱，ncbi錄入號(hào)(accessionnumber)，蛋白id，蛋白大小等信息。結(jié)果見圖8。

由于該蛋白芯片上不含有pd-l1蛋白，因此umab288抗體在該芯片上不應(yīng)該有任何結(jié)合信號(hào)。圖8結(jié)果顯示，在蛋白芯片上的所有蛋白與umab228分泌產(chǎn)生的單克隆抗體無(wú)結(jié)合信號(hào)，表明本發(fā)明所述單抗與其他近10000種蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

<110>無(wú)錫傲銳東源生物科技有限公司

<120>抗ido1蛋白單克隆抗體及其用途

<210>1

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<213>人工序列

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