本發(fā)明涉及細(xì)胞工程領(lǐng)域，尤其是涉及一種適用于貼壁型cho細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

細(xì)胞培養(yǎng)基既是培養(yǎng)細(xì)胞中供給細(xì)胞營養(yǎng)和促使細(xì)胞生殖增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是培養(yǎng)細(xì)胞生長和繁殖的生存環(huán)境，是生物醫(yī)藥工程中最重要的組成部分。細(xì)胞培養(yǎng)基從使用方式分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基?；A(chǔ)培養(yǎng)基主要成分有：無機(jī)鹽、氨基酸、碳源、維生素、緩沖體系以及其他類微量營養(yǎng)物質(zhì)，成分明確清晰?；A(chǔ)培養(yǎng)基不能促進(jìn)細(xì)胞的生長、增殖，需要配合血清使用。血清的主要作用在于給細(xì)胞提供生長增殖所需物質(zhì)，但由于血清中所含的成分復(fù)雜，不同產(chǎn)地、批次之間存在質(zhì)量差異，給動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝造成了諸多不利影響。同時(shí)，通過細(xì)胞培養(yǎng)獲得產(chǎn)物的過程，血清的存在是純化的主要障礙，甚至使產(chǎn)物難以成為醫(yī)藥產(chǎn)品。

工業(yè)大規(guī)模化生產(chǎn)中，常用的細(xì)胞系包括cho細(xì)胞(chinesehamsterovary，中國倉鼠卵巢細(xì)胞)、vero細(xì)胞、sp2/0細(xì)胞、ns0細(xì)胞、小鼠雜交瘤細(xì)胞等，其中最常見的是cho細(xì)胞。截止目前，美國fda批準(zhǔn)的63個(gè)已上市的抗體藥物表達(dá)體系中，使用cho細(xì)胞的有33個(gè)，占據(jù)52％。目前針對cho細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基開發(fā)主要集中在懸浮培養(yǎng)上，鮮有適用于貼壁的無血清培養(yǎng)基。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的能支持cho細(xì)胞貼壁生長的無血清培養(yǎng)基。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于此，有必要提供一種適用于貼壁型cho細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。

一種適用于貼壁型cho細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基及添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的脂類物質(zhì)、激素類物質(zhì)、生長因子及貼壁因子；其中，所述脂類物質(zhì)包含濃度之和大于零的如下各組分：

所述激素類物質(zhì)包括濃度之和大于零的如下各組分：

所述生長因子包括濃度之和大于零的如下各組分：

所述貼壁因子包括濃度之和大于零的如下各組分：

玻連蛋白0-10mg/l

層粘連蛋白0-10mg/l

纖維連接蛋白0-10mg/l。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述脂類物質(zhì)包括濃度之和大于零的如下各組分：

所述激素類物質(zhì)包括濃度之和大于零的如下各組分：

所述生長因子包括濃度之和大于零的如下各組分：

所述貼壁因子包括濃度之和大于零的如下各組分：

玻連蛋白0-2mg/l

層粘連蛋白0-2mg/l

纖維連接蛋白0-2mg/l。

本文所述的濃度之和大于零指可以選自多個(gè)相應(yīng)組分中的至少一種，當(dāng)某種組分被選擇使用時(shí)，其濃度不為零，如貼壁因子可以是玻連蛋白、層粘連蛋白與纖維連接蛋白中一種或多種的混合物，當(dāng)為混合物時(shí)，其中相應(yīng)組分的濃度比如不為零。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中具有如下濃度的各微量元素組分：

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中還具有如下濃度的各維生素組分：

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中還具有如下濃度的各氨基酸組分：

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中還具有如下濃度的各基礎(chǔ)組分：

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述無血清培養(yǎng)基用nacl調(diào)節(jié)滲透壓至270-310mosm/kgh2o，用hcl或naoh調(diào)節(jié)酸堿度至ph為7.2-7.5。

一種適用于貼壁型cho細(xì)胞的培養(yǎng)方法，使用上述任一實(shí)施例所述的適用于貼壁型cho細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基對cho細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，是將cho細(xì)胞直接使用所述適用于貼壁型cho細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，是使用連續(xù)適應(yīng)方法對所述cho細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，具體是：先使用含胎牛血清的培養(yǎng)基與所述適用于貼壁型cho細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基的混合培養(yǎng)基對所述cho細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，且每次傳代后的混合培養(yǎng)基中所述適用于貼壁型cho細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基的比例均較前一次增加，直至最后只使用所述適用于貼壁型cho細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

上述適用于貼壁型cho細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基通過在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加特定濃度范圍的脂類物質(zhì)、激素類物質(zhì)、生長因子及貼壁因子，可以取代傳統(tǒng)的含血清培養(yǎng)基直接用于cho細(xì)胞的貼壁生長，并可連續(xù)傳代，培養(yǎng)時(shí)cho細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定。

另外，進(jìn)一步通過對基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的各組分的含量進(jìn)行調(diào)整，并添加了一些微量元素組分等，使得該適用于貼壁型cho細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基更加適用于cho細(xì)胞的貼壁生長，進(jìn)一步保證cho細(xì)胞貼壁生長的穩(wěn)定性和生長速率。

附圖說明

圖1為貼壁因子實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)24小時(shí)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長形態(tài)照片，其中a為單獨(dú)添加纖維連接蛋白組，b為單獨(dú)添加玻連蛋白組培養(yǎng)，c為玻連蛋白和纖維連接蛋白聯(lián)用，d為不添加貼壁因子。

圖2為貼壁因子實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)培養(yǎng)60小時(shí)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長形態(tài)照片，其中a為單獨(dú)添加纖維連接蛋白，b為單獨(dú)添加玻連蛋白組組，c為玻連蛋白和纖維連接蛋白聯(lián)用。

圖3為貼壁因子實(shí)驗(yàn)中各實(shí)驗(yàn)組不同培養(yǎng)時(shí)期細(xì)胞活力變化。

圖4為生長因子實(shí)驗(yàn)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力。

圖5為使用本發(fā)明無血清培養(yǎng)基傳代至第4代的cho細(xì)胞形態(tài)圖，此圖中細(xì)胞培養(yǎng)60h，其中a為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，b為5％fbsdmem/f12培養(yǎng)細(xì)胞。

圖6為使用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)傳代的cho細(xì)胞密度，每一代的細(xì)胞數(shù)目為培養(yǎng)至60h測量的數(shù)據(jù)。

具體實(shí)施方式

為了便于理解本發(fā)明，下面將參照相關(guān)附圖對本發(fā)明進(jìn)行更全面的描述。附圖中給出了本發(fā)明的較佳實(shí)施例。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式來實(shí)現(xiàn)，并不限于本文所描述的實(shí)施例。相反地，提供這些實(shí)施例的目的是使對本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。

實(shí)施例1適用于貼壁型cho細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基配制

適用于cho細(xì)胞貼壁生長的基礎(chǔ)培養(yǎng)基更改了dmem/f12培養(yǎng)基的微量元素、維生素和氨基酸等，其余組分基本與dmem/f12培養(yǎng)基一致，配制所得培養(yǎng)基稱為“基礎(chǔ)培養(yǎng)基”。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基在配制時(shí)首先將各微量元素組分配制成1000倍濃縮液，組成及含量如下：

將各維生素組分配制成1000倍濃縮液，其中肌醇在使用時(shí)為單獨(dú)添加，濃度為13.8mg/l，其他具體組成及含量如下：

將各氨基酸組分配成100倍濃縮液，具體組成及含量如下：

將各基礎(chǔ)組分的無機(jī)鹽溶液配制成50倍母液，具體組成及含量如下：

葡萄糖和gsh配制培養(yǎng)基時(shí)直接添加，含量如下：

葡萄糖3151mg/l

gsh1mg/l。

將上述濃縮液、母液等加入到1l燒杯中，配制成1倍的液體培養(yǎng)基，使用1mol/lnacl調(diào)節(jié)滲透壓至270-310mosm/kgh2o(若調(diào)節(jié)之前滲透壓在此范圍內(nèi)，則無需調(diào)節(jié))，并使用1mol/lhcl或者naoh調(diào)節(jié)ph至7.2-7.5(若調(diào)節(jié)之前ph在此范圍內(nèi)，則無需調(diào)節(jié))，然后用0.22μm濾膜過濾除菌，即得基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

脂類物質(zhì)配制成濃縮液，稱取10mg硬脂酸、10mg十四酸、10mg亞麻酸、10mg亞油酸、5mg花生四烯酸、1g膽固醇溶解于1mldmso中，待完全溶解后加入至1l0.2％吐溫溶液，并加入0.2％bsa，37℃水浴加熱30分鐘。使用時(shí)每升基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入5ml該濃縮液。

激素類物質(zhì)組成成分及含量為：每升基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加10μg地塞米松，3mg乙醇胺，0.5mg腐胺，10mg胰島素。

生長因子組成及含量具體為每升基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加0.5mgegf、0.5mgigf。

為保證細(xì)胞貼壁，加入貼壁因子，具體是每升基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加1mg玻連蛋白、0.33mg纖維連接蛋白。

實(shí)施例2

適用于cho細(xì)胞貼壁生長的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其“基礎(chǔ)培養(yǎng)基”如實(shí)施例1所述。

脂類物質(zhì)配制成濃縮液，10mg硬脂酸、10mg十四酸、10mg棕櫚酸、10mg亞麻酸、10mg亞油酸、10mg油酸、10mg軟脂酸、5mg花生四烯酸，待完全溶解后加入至1l0.2％吐溫溶液，并加入0.2％bsa，37℃水浴加熱30分鐘。使用時(shí)每升基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入0.5ml該濃縮液。

激素類物質(zhì)組成成分及含量為：每升基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加5μg地塞米松，15μg氫化可的松，3mg乙醇胺，0.5mg腐胺，10mg胰島素，0.5mg孕酮，1mg甲狀腺素。

生長因子組成及含量具體為：每升基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加0.5mgegf、1mg/lfgf、1mg/lcsf。

貼壁因子組成及含量具體為：每升基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加1mg玻連蛋白、0.5mg層粘連蛋白，0.5mg/l纖維連接蛋白。

實(shí)施例3

適用于cho細(xì)胞貼壁生長的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其“基礎(chǔ)培養(yǎng)基”配制如實(shí)施例1所述。

脂類物質(zhì)配制成濃縮液，10mg硬脂酸、10mg十四酸、10mg棕櫚酸、10mg亞麻酸、10mg亞油酸、10mg油酸、10mg軟脂酸、5mg花生四烯酸，待完全溶解后加入至1l0.2％吐溫溶液，并加入0.2％bsa，37℃水浴加熱30分鐘。使用時(shí)每升基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入1ml該濃縮液。

激素類物質(zhì)組成成分及含量為：每升基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加20μg氫化可的松，6mg乙醇胺，1.5mg腐胺，10mg胰島素，1mg孕酮，0.2mg甲狀腺素，0.2mg腎上腺素。

生長因子組成及含量具體為每升基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加1mgegf、1mgigf，0.2mg/lfgf、0.2mg/lcsf。

實(shí)施例4

細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)基的方法可分為直接適應(yīng)和連續(xù)適應(yīng)兩種。直接適應(yīng)法將細(xì)胞直接從含血清培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。連續(xù)適應(yīng)法指的是逐步將細(xì)胞從有血清培養(yǎng)轉(zhuǎn)換到無血清培養(yǎng)狀態(tài)。與直接適應(yīng)法相比，連續(xù)適應(yīng)法相對溫和，轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基后細(xì)胞生長要優(yōu)于直接適應(yīng)法。本實(shí)施例采用連續(xù)適應(yīng)法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，操作過程如下：

1.以2倍正常接種密度接種生長活躍的cho細(xì)胞培養(yǎng)物到含10％fbs的dmem/f12培養(yǎng)基:無血清培養(yǎng)基體積比為75:25的混合培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)。

2.當(dāng)細(xì)胞生長穩(wěn)定后，細(xì)胞密度達(dá)到2×10⁵-3×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml時(shí)，在含10％fbs的dmem/f12培養(yǎng)基:無血清培養(yǎng)基體積比為50:50的混合培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。

3.以2×10⁵-3×10⁵cell/ml個(gè)細(xì)胞密度，在含10％fbs的dmem/f12培養(yǎng)基:無血清培養(yǎng)基體積比為25:75的混合培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。

4.當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×10⁵-3×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml時(shí)，在100％無血清培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。

5.每隔3到5天，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×10⁵-3×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml時(shí)，細(xì)胞活率在90％時(shí)，貯備的適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基的cho細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)該次傳代培養(yǎng)。

實(shí)施例5

為了使細(xì)胞更好的貼壁生長，需加入貼壁因子。常用的貼壁因子有玻連蛋白、層粘連蛋白、纖維連接蛋白。本實(shí)施例通過玻連蛋白、纖維連接蛋白對其作用及添加量做一闡述。

實(shí)驗(yàn)設(shè)為四組，分別為在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中單獨(dú)添加1mg/l玻連蛋白，單獨(dú)添加1mg/l纖維連接蛋白，同時(shí)添加1mg/l玻連蛋白和1mg/l纖維連接蛋白，不添加貼壁因子作為對照。由圖1a、1b、1c和1d可看出，在培養(yǎng)至24小時(shí)觀察，細(xì)胞在單獨(dú)添加1mg/l玻連蛋白或者纖維連接蛋白的無血清培養(yǎng)基中均能很好的貼壁生長，而不添加貼壁因子的對照組細(xì)胞則開始漂浮凋亡(圖1d)。

培養(yǎng)至48小時(shí)觀察，單獨(dú)添加纖維連接蛋白細(xì)胞開始飄起，培養(yǎng)至60小時(shí)，單獨(dú)添加粘連蛋白細(xì)胞則不能維持貼壁(圖2a)。而單獨(dú)添加玻連蛋白及玻連蛋白和粘連蛋白聯(lián)用的細(xì)胞則繼續(xù)保持良好的貼壁狀態(tài)(圖2b，2c)。

使用mtt法檢測檢測細(xì)胞活力，結(jié)果見圖3。在初期(48小時(shí)數(shù)據(jù))單獨(dú)添加粘連蛋白的細(xì)胞維持較高的細(xì)胞活力，生長速率明顯高于單獨(dú)添加玻連蛋白，到后期由于大量細(xì)胞失去貼壁能力而凋亡造成細(xì)胞活力下降。單獨(dú)添加玻連蛋白及兩種蛋白聯(lián)用則一直保持較快的生長速率，其中兩種蛋白聯(lián)合使用培養(yǎng)至60h時(shí)細(xì)胞活力最高。

該實(shí)驗(yàn)表明，纖維連接蛋白可維持細(xì)胞較好的增殖，玻連蛋白則能維持細(xì)胞保持持久的貼壁能力。在使用時(shí)應(yīng)同時(shí)玻連蛋白和纖維連接蛋白則可保持較高的細(xì)胞增殖和持久的貼壁能力。

實(shí)施例6

生長因子添加試驗(yàn)：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加0.5mg/ligf、0.5mg/legf，培養(yǎng)至60h，從顯微鏡中觀察不到差異。mtt實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力結(jié)果見圖4，單獨(dú)添加igf、egf或者同時(shí)加入igf、egf均可提高細(xì)胞活力。

實(shí)施例7

傳代穩(wěn)定性測試：將馴化至1％血清培養(yǎng)的cho-k1細(xì)胞經(jīng)過胰蛋白酶消化制成細(xì)胞懸液。取5ml實(shí)施例1配制的無血清培養(yǎng)基置于培養(yǎng)瓶中，將細(xì)胞按照1.5×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度進(jìn)行接種，5％co2，37℃培養(yǎng)。細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶，使用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行傳代。以檢測其傳代穩(wěn)定性，共進(jìn)行5次傳代。同步使用添加5％fbsdmem/f12培養(yǎng)基進(jìn)行傳代的cho-k1細(xì)胞進(jìn)行對照。

通過顯微鏡觀察，連續(xù)傳代過程中，細(xì)胞貼壁良好，培養(yǎng)至60小時(shí)可以鋪滿細(xì)胞瓶(圖5a、5b)，因此每次均在60小時(shí)進(jìn)行傳代。從圖5可看出無血清培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)和5％血清培養(yǎng)的細(xì)胞略有差別，培養(yǎng)至60小時(shí)，從顯微鏡中觀察細(xì)胞量稍低于5％血清培養(yǎng)的細(xì)胞。使用mtt檢測細(xì)胞活力，結(jié)果見圖6，連續(xù)傳代過程中，細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定，未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長速率下降或者上升。

該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明所提供的無血清培養(yǎng)基可支持cho細(xì)胞貼壁生長以及連續(xù)傳代。

以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。