本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)基
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種培養(yǎng)肝細胞的無血清培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
：利用動物細胞培養(yǎng)技術(shù)來驗證化合物毒理學(xué)實驗測試目前為止最為高效和可行的方法。隨著生物技術(shù)在化合物毒理學(xué)安全評價應(yīng)用領(lǐng)域和市場需求量的不斷擴大，提高動物細胞培養(yǎng)和毒理學(xué)試驗、延長維持時間以獲得可靠結(jié)果，成為優(yōu)化動物細胞培養(yǎng)過程和毒理學(xué)實驗的核心。眾所周知，動物細胞培養(yǎng)及毒理學(xué)試驗的效果的經(jīng)濟性和效率起決定性作用的是培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的優(yōu)化是建立高效的動物細胞培養(yǎng)和毒理學(xué)試驗過程的核心環(huán)節(jié)。因此，根據(jù)細胞在生長、代謝和毒理學(xué)試驗表達過程中的營養(yǎng)需求，設(shè)計動物細胞培養(yǎng)基中營養(yǎng)物的成分、含量和配比是工作的重要內(nèi)容。國內(nèi)外許多商業(yè)化的培養(yǎng)基—般由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和血清或替代物組成，顯著影響細胞生長、代謝和毒理試驗現(xiàn)象表達這些培養(yǎng)基—般僅能確保細胞的穩(wěn)定傳代，并不能較好地支持細胞生長和毒理試驗效果的表達，因而阻礙了細胞毒理學(xué)實驗的普及和應(yīng)用。中國專利申請cn102311938a公開了一種用于肝細胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，其包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加組分，其中，所述添加組分包括：胰島素0.1～10μg/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白0.5～10μg/ml、亞硒酸鈉5～10μg/l、表皮生長因子1～100ng/ml、肝細胞生長因子1～100ng/ml、纖粘連蛋白0.1～1μg/ml、地塞米松0.1～10nmol/ml和胰高血糖素0.05～5μg/ml。中國專利申請cn105087465a公開了一種肝細胞無血清培養(yǎng)基，其包括以下組分：基礎(chǔ)培養(yǎng)基500ml；絲膠蛋白0.05～0.5％；地塞米松0.1～1000nmol/ml；肝細胞生長因子5～20ng/ml；表皮生長因子10～50ng/ml；青鏈霉素100u/ml，這些用于肝細胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，但是，存在價格昂貴，不利于日常應(yīng)用、廣泛推廣及肝細胞的產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)等問題。市售的商業(yè)無血清培養(yǎng)基在血清替代方面多具有良好的表現(xiàn)，但在支持細胞培養(yǎng)和高效表達毒理學(xué)效果方面仍有諸多缺陷。因此，在進行動物細胞培養(yǎng)和毒理學(xué)實驗時，多數(shù)無血清培養(yǎng)基難以充分、平衡地向細胞提供所需的營養(yǎng)物質(zhì)。培養(yǎng)基利用率很低，造成極大的浪費。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種培養(yǎng)肝細胞的無血清培養(yǎng)基它不僅能夠促進細胞的生長，還能夠促進白蛋白的合成，長時間維持細胞活力。為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)肝細胞的無血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：膽固醇2～10mg/l，煙酰胺30～100μg/l，硫酸軟骨素0.2-0.5mg/l，抗生素13-16μm，胰島素0.1～0.8mg/l，過氧化氫酶10-17mg/l，全反式維甲酸2～7μg/l，肌醇10～60μg/l，雷帕霉素3～12μg/l，氯化膽堿7.2～11.8mg/l，葉酸3～9μg/l，黃體酮0.2～1.6mg/l，微量元素5～23μg/l，細胞生長因子20-35μg/l，氨基酸1～30mg/l。優(yōu)選的，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：膽固醇5～8mg/l，煙酰胺42～81μg/l，硫酸軟骨素0.2-0.5mg/l，抗生素13-16μm，胰島素0.3～0.6mg/l，過氧化氫酶10-17mg/l，全反式維甲酸3～6μg/l，肌醇25～42μg/l，雷帕霉素5～8μg/l，氯化膽堿8.5～10.2mg/l，葉酸4～7μg/l，黃體酮0.7～1.3mg/l，微量元素5～23μg/l，細胞生長因子20-35μg/l，氨基酸5～18mg/l。本發(fā)明提供的培養(yǎng)肝細胞的無血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，基礎(chǔ)培養(yǎng)基能夠提供肝細胞的生存和最低的生理活動。膽固醇作為一種脂類，參與形成細胞膜，過氧化氫酶能夠清除自由基，保護肝細胞免受超氧自由基損害等，胰島素可通過作用于肝細胞表面的胰島素受體，增強肝細胞對能源的攝入和利用，同時促進肝細胞內(nèi)的rna、蛋白質(zhì)和脂肪酸的合成，抑制細胞凋亡，從而增強肝細胞的活力與功能。硫酸軟骨素能增加細胞的信使核糖核酸和脫氧核糖核酸的生物合成以及具有促進細胞代謝的作用，與其他原料配合使用，能夠達到更好的提高肝細胞的增殖倍數(shù)和細胞活率的效果。本發(fā)明對基礎(chǔ)培養(yǎng)基的種類沒有特殊的要求，可以為本領(lǐng)域技術(shù)人員所常知，例如，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為f12或rmpi1640培養(yǎng)基。細胞生長因子能夠促進肝細胞的增殖，以及調(diào)節(jié)肝細胞的功能。優(yōu)選的，所述細胞生長因子由表皮生長因子和肝細胞生長因子組成，所述細胞生長因子由表皮生長因子和肝細胞生長因子的重量比為1:(1.2～3.6)。優(yōu)選的，本發(fā)明的培養(yǎng)基中還含有微量元素，所述微量元素為微量金屬元素和/或維生素，所述微量金屬元素為鐵、銅、鋅、鈷、錳、鉻、硒、碘、鎳、氟、鉬、釩、錫、硅、鍶、硼、銣中的至少一種。優(yōu)選的，所述維生素為維生素a、維生素d、維生素e、維生素k、維生素b1、維生素b2、維生素b5、維生素b6、維生素b12、維生素b13、維生素b15、對氨基苯甲酸中的至少一種。氨基酸是維持細胞生長的營養(yǎng)元素之一，優(yōu)選的，本發(fā)明的培養(yǎng)肝細胞的無血清培養(yǎng)基中還含有氨基酸，所述所述氨基酸為甘氨酸、l-丙氨酸、l-谷氨酸、l-谷氨酰胺、l-精氨酸、l-組氨酸、l-亮氨酸、l-異亮氨酸、l-絲氨酸、l-蘇氨酸、l-酪氨酸、l-賴氨酸、l-蛋氨酸、l-苯丙氨酸、l-脯氨酸、l-色氨酸、l-纈氨酸、l-天冬氨酸和l-天冬酰胺中的至少一種優(yōu)選的，所述抗生素為鏈霉素和/或青霉素。一種培養(yǎng)肝細胞的無血清培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：(1)向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入膽固醇，煙酰胺，硫酸軟骨素，抗生素，胰島素，過氧化氫酶，全反式維甲酸，肌醇，雷帕霉素，氯化膽堿，葉酸，黃體酮，微量元素，細胞生長因子，氨基酸，混合均勻，得到混合體系1；(2)將步驟(1)的混合體系調(diào)節(jié)ph至6.7-7.3，在3～8℃下攪拌2～5h；(3)將步驟(2)的產(chǎn)物用微米濾膜過濾，除菌后，即得。優(yōu)選的，所述微米膜為孔徑為0.1～0.3微米的濾膜。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下技術(shù)效果：本發(fā)明的培養(yǎng)肝細胞的無血清培養(yǎng)基化學(xué)成分明確，在本發(fā)明的培養(yǎng)基中，干細胞生長良好，細胞形態(tài)、密度與含有血清的培養(yǎng)基相當(dāng)，且細胞功能和活力明顯優(yōu)于含血清培養(yǎng)基，克服了傳統(tǒng)含血清培養(yǎng)基的缺陷；本發(fā)明培養(yǎng)肝細胞的無血清培養(yǎng)基搭配合理，各成分間協(xié)同作用，能提供細胞生長增殖所需的充足營養(yǎng)與良好環(huán)境，能夠促進細胞的生長，還能夠促進白蛋白的合成，長時間維持細胞活力。具體實施方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實施例1本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)肝細胞的無血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基f12培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：膽固醇7mg/l，煙酰胺63μg/l，硫酸軟骨素0.3mg/l，抗生素鏈霉素14μm，胰島素0.4mg/l，過氧化氫酶13mg/l，全反式維甲酸4μg/l，肌醇32μg/l，雷帕霉素6μg/l，氯化膽堿9.2mg/l，葉酸5μg/l，黃體酮0.9mg/l，微量元素15μg/l，細胞生長因子28μg/l，氨基酸12mg/l；所述細胞生長因子由表皮生長因子和肝細胞生長因子組成，所述細胞生長因子由表皮生長因子和肝細胞生長因子的重量比為1:2；所述微量元素為鐵、銅、鋅；所述氨基酸為甘氨酸、l-丙氨酸；本發(fā)明還提供了該培養(yǎng)肝細胞的無血清培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：(1)向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入膽固醇，煙酰胺，硫酸軟骨素，抗生素鏈霉素，胰島素，過氧化氫酶，全反式維甲酸，肌醇，雷帕霉素，氯化膽堿，葉酸，黃體酮，微量元素，細胞生長因子，氨基酸，混合均勻，得到混合體系1；(2)將步驟(1)的混合體系調(diào)節(jié)ph至7.0，在5℃下攪拌4h；(3)將步驟(2)的產(chǎn)物用孔徑為0.2微米的濾膜過濾，除菌后，即得。實施例2本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)肝細胞的無血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基f12培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：膽固醇5mg/l，煙酰胺42μg/l，硫酸軟骨素0.2mg/l，抗生素青霉素13μm，胰島素0.3mg/l，過氧化氫酶10mg/l，全反式維甲酸3μg/l，肌醇25μg/l，雷帕霉素5μg/l，氯化膽堿8.5mg/l，葉酸4μg/l，黃體酮0.7mg/l，微量元素5μg/l，細胞生長因子20μg/l，氨基酸5mg/l；所述細胞生長因子由表皮生長因子和肝細胞生長因子組成，所述細胞生長因子由表皮生長因子和肝細胞生長因子的重量比為1:1.2；所述微量元素為微量金屬元素，所述微量金屬元素為鐵、銅、鋅、鈷、錳、鉻；所述氨基酸為l-精氨酸、l-組氨酸、l-亮氨酸；本發(fā)明還提供了該培養(yǎng)肝細胞的無血清培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：(1)向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入膽固醇，煙酰胺，硫酸軟骨素，抗生素青霉素，胰島素，過氧化氫酶，全反式維甲酸，肌醇，雷帕霉素，氯化膽堿，葉酸，黃體酮，微量元素，細胞生長因子，氨基酸，混合均勻，得到混合體系1；(2)將步驟(1)的混合體系調(diào)節(jié)ph至6.7，在3℃下攪拌2h；(3)將步驟(2)的產(chǎn)物用孔徑為0.1微米的濾膜過濾，除菌后，即得。實施例3本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)肝細胞的無血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基rmpi1640培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：膽固醇8mg/l，煙酰胺81μg/l，硫酸軟骨素0.5mg/l，抗生素鏈霉素16μm，胰島素0.6mg/l，過氧化氫酶17mg/l，全反式維甲酸6μg/l，肌醇42μg/l，雷帕霉素8μg/l，氯化膽堿10.2mg/l，葉酸7μg/l，黃體酮1.3mg/l，微量元素23μg/l，細胞生長因子35μg/l，氨基酸18mg/l；所述細胞生長因子由表皮生長因子和肝細胞生長因子組成，所述細胞生長因子由表皮生長因子和肝細胞生長因子的重量比為1:3.6；所述微量元素為維生素a、維生素d、維生素e；所述氨基酸為甘氨酸、l-丙氨酸、l-谷氨酸、l-谷氨酰胺；本發(fā)明還提供了該培養(yǎng)肝細胞的無血清培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：(1)向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入膽固醇，煙酰胺，硫酸軟骨素，抗生素鏈霉素，胰島素，過氧化氫酶，全反式維甲酸，肌醇，雷帕霉素，氯化膽堿，葉酸，黃體酮，微量元素，細胞生長因子，氨基酸，混合均勻，得到混合體系1；(2)將步驟(1)的混合體系調(diào)節(jié)ph至7.3，在8℃下攪拌5h；(3)將步驟(2)的產(chǎn)物用孔徑為0.3微米的濾膜過濾，除菌后，即得。實施例4本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)肝細胞的無血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基f12培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：膽固醇2mg/l，煙酰胺30μg/l，硫酸軟骨素0.2mg/l，抗生素青霉素13μm，胰島素0.1mg/l，過氧化氫酶10mg/l，全反式維甲酸2μg/l，肌醇10μg/l，雷帕霉素3μg/l，氯化膽堿7.2mg/l，葉酸3μg/l，黃體酮0.2mg/l，微量元素5μg/l，細胞生長因子20μg/l，氨基酸1mg/l；所述細胞生長因子由表皮生長因子和肝細胞生長因子組成，所述細胞生長因子由表皮生長因子和肝細胞生長因子的重量比為1:1.2；所述微量元素為硒、碘、鎳、氟、鉬、釩、錫、硅、鍶、硼、銣、甘氨酸、l-丙氨酸、l-谷氨酸、l-谷氨酰胺、l-精氨酸、l-組氨酸、l-亮氨酸、l-異亮氨酸、l-絲氨酸；。本發(fā)明還提供了該培養(yǎng)肝細胞的無血清培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：(1)向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入膽固醇，煙酰胺，硫酸軟骨素，抗生素青霉素，胰島素，過氧化氫酶，全反式維甲酸，肌醇，雷帕霉素，氯化膽堿，葉酸，黃體酮，微量元素，細胞生長因子，氨基酸，混合均勻，得到混合體系1；(2)將步驟(1)的混合體系調(diào)節(jié)ph至7，在5℃下攪拌3h；(3)將步驟(2)的產(chǎn)物用孔徑為0.2微米的濾膜過濾，除菌后，即得。實施例5本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)肝細胞的無血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基f12培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：膽固醇10mg/l，煙酰胺100μg/l，硫酸軟骨素0.5mg/l，抗生素青霉素16μm，胰島素0.8mg/l，過氧化氫酶17mg/l，全反式維甲酸7μg/l，肌醇60μg/l，雷帕霉素12μg/l，氯化膽堿11.8mg/l，葉酸9μg/l，黃體酮1.6mg/l，微量元素23μg/l，細胞生長因子35μg/l，氨基酸30mg/l；所述細胞生長因子由表皮生長因子和肝細胞生長因子組成，所述細胞生長因子由表皮生長因子和肝細胞生長因子的重量比為1:2.4；所述微量元素為鐵、銅、鋅、鈷、錳、維生素a、維生素d、維生素e；所述氨基酸為甘氨酸、l-丙氨酸、l-谷氨酸、l-谷氨酰胺、l-精氨酸、l-組氨酸、l-亮氨酸；本發(fā)明還提供了該培養(yǎng)肝細胞的無血清培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：(1)向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入膽固醇，煙酰胺，硫酸軟骨素，抗生素青霉素，胰島素，過氧化氫酶，全反式維甲酸，肌醇，雷帕霉素，氯化膽堿，葉酸，黃體酮，微量元素，細胞生長因子，氨基酸，混合均勻，得到混合體系1；(2)將步驟(1)的混合體系調(diào)節(jié)ph至7，在3℃下攪拌2h；(3)將步驟(2)的產(chǎn)物用孔徑為0.1微米的濾膜過濾，除菌后，即得。1、實驗方法(1)將新鮮分離的大鼠肝細胞，分別用實施例1～5的無血清培養(yǎng)基和含10％(v/v)胎牛血清(fbs)的william’s-e培養(yǎng)基將細胞重懸，調(diào)整細胞濃度到1×106cells/ml，然后加入20ml細胞懸液到40ml搖動培養(yǎng)玻璃皿中，置于搖動搖床上，速度為10cpm，在培養(yǎng)24小時，48小時和72小時取樣，分析大鼠肝細胞功能，實驗結(jié)果如表1。表1：原代大鼠細胞成干細胞球比例(細胞濃度5×106cells/ml)成球率％(直徑>60微米)24h48h72h實施例174.5±2.679±3.387.5±0.2實施例269.2±1.177±3.486.4±0.2實施例368.2±3.069.5±1.284.5±0.6實施例468.5±2.169.2±0.279.3±0.2實施例567.5±3.568±0.377.3±0.6含血清53.2±3.969.4±0.265.2±0.6本發(fā)明無血清培養(yǎng)基可以支持肝細胞高密度懸浮培養(yǎng)，密度在5×106cells/ml×107cells/ml之間時，成球率高于60％，與含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)效果相當(dāng)。綜上，本發(fā)明提供的無血清培養(yǎng)基化學(xué)成分明確且成本低廉，不含動物來源成分，能夠支持肝細胞高密度懸浮培養(yǎng)生長，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)含血清培養(yǎng)基和現(xiàn)有文獻報道的無血清培養(yǎng)基，可用于細胞移植、組織工程肝臟和生物人工肝支持系統(tǒng)治療，具有良好的市場應(yīng)用前景。上述描述僅是對本發(fā)明部分實施例的描述，并非對本發(fā)明范圍的任何限定，本行業(yè)的普通技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明對上述實施例做出改進或修改，但均屬于本發(fā)明保護范圍。當(dāng)前第1頁12