本發(fā)明公開了甜菊糖或甜葉菊浸提液在促進(jìn)小球藻生長中的應(yīng)用，屬于甜菊糖新應(yīng)用領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

小球藻屬綠藻門(chlorophyta)綠藻綱(chlorophyceae)綠球藻目(chlorococcales)卵囊藻科(oocystaceae)小球藻屬(chlorolla)的普生性單細(xì)胞藻類(曹云濤,孔瑩寶,葸玉琴,李龍囡,夏春谷.不同營養(yǎng)方式對普通小球藻生長特性和細(xì)胞組成的影響[j].食品與發(fā)酵工業(yè),2011,37(10),45-51)。含有豐富的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖、食用纖維、維生素、微量元素和活性代謝產(chǎn)物，其多糖及糖蛋白具有抗腫瘤、抗病原菌、抗病毒感染及增強(qiáng)免疫力等活性，正成為近些年來的研究熱點(diǎn)(孔維寶,李龍囡,張繼,夏春谷.小球藻的營養(yǎng)保健功能及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[j].食品科學(xué),2010,31(9),323-328)。目前小球藻已廣泛應(yīng)用于食品添加劑、動物飼料、美容以及醫(yī)藥保健等領(lǐng)域，美國和日本將其作為優(yōu)良食品和動物飼料添加劑有30多年的歷史(李師翁,李虎乾.植物單細(xì)胞蛋白資源:小球藻開發(fā)利用研究的現(xiàn)狀[j].生物技術(shù),1997,7(3):45-48)。

目前，微藻生物技術(shù)發(fā)展很快，小球藻異養(yǎng)技術(shù)為微藻繁殖提供了一條新的途徑，微藻作為新的功能食品具有重要的意義(胡月薇,史賢明.新食品資源小球藻的生理活性與保健功能[j]。中國食品學(xué)報,2002,2(2):69-72)。目前，小球藻粉已被我國農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)為新型飼料添加劑(歐陽克氙,羅曉燕,劉建平,蔡力創(chuàng),肖正強(qiáng).小球藻的營養(yǎng)價值及其在飼料工業(yè)上的應(yīng)用進(jìn)展[j].江西科學(xué),2013,31(5):590-595)。

目前，小球藻培養(yǎng)中，存在生長周期較長、生長較慢的問題，甜菊糖已在高倍甜味劑等方面應(yīng)用，其功能有著眾多的優(yōu)勢，現(xiàn)有技術(shù)中沒有將甜菊糖或甜葉菊浸提液應(yīng)用于小球藻培養(yǎng)的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明在實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上提出了甜菊糖或甜葉菊浸提液在促進(jìn)小球藻生長、提高培養(yǎng)效率等方面的應(yīng)用。

技術(shù)方案：將適量的甜菊糖或甜葉菊浸提液加到小球藻培養(yǎng)液中，促進(jìn)小球藻的生長。所述甜菊糖中的主要成分可以為甜菊糖的各單組分，也可為甜菊苷(ss)、萊苞迪苷a(ra)和萊苞迪苷c(rc)等單組分任意比例混合物。

優(yōu)選，在小球藻培養(yǎng)液中添加甜菊糖，其添加量為0.01-10mm，更優(yōu)選0.2-8mm。

優(yōu)選，在小球藻培養(yǎng)液中添加甜菊糖，其添加量為6mm。

甜葉菊浸提液的制備方法：將甜葉菊以1：(10-20)(w/v)的比例加入水中煮沸提取得甜葉菊浸提液。

在小球藻培養(yǎng)液中添加甜葉菊浸提液，添加量為0.01％-10％(w/w)，更優(yōu)選2％-8％(w/w)。

優(yōu)選：在小球藻培養(yǎng)液中添加甜葉菊浸提液，添加量為5％(w/w)。

甜葉菊(steviarebaudiana(bertoni)hemsl)為菊科多年生草本植物，原產(chǎn)美洲巴拉圭和巴西交界的阿曼山脈(趙永平，何慶祥，朱亞等.不同基因型甜葉菊產(chǎn)量和甜菊糖苷含量研究[j].中國農(nóng)學(xué)通報,2010,26(19),73-75)。甜葉菊中甜味成分—甜菊糖作為新興的天然甜味劑，具有低熱、高甜、理化性質(zhì)穩(wěn)定、安全無副作用等優(yōu)點(diǎn)，同時具有調(diào)節(jié)血糖、降脂、降壓、抗癌、抗菌、抗病毒等生物活性，因而被譽(yù)為“最有發(fā)展前途的新糖源”(徐健,李維林.甜菊糖藥理作用及產(chǎn)業(yè)工藝研究進(jìn)展[j].食品與發(fā)酵工業(yè),2013,39(10),207-214)。

本發(fā)明應(yīng)用中，最重要的是甜菊糖或甜葉菊浸提液的添加以及用量的限定，其他培養(yǎng)條件對本發(fā)明的應(yīng)用效果不會產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性的影響，如所用小球藻培養(yǎng)液可以為現(xiàn)有技術(shù)常用的小球藻培養(yǎng)液，培養(yǎng)溫度、光照強(qiáng)度和培養(yǎng)時間等都可以根據(jù)培養(yǎng)目的進(jìn)行調(diào)整。

本發(fā)明的基礎(chǔ)小球藻培養(yǎng)液配方可以是：碳酸鈉：0.02g/l，硝酸鈉：2.0g/l，磷酸二氫鉀：0.02g/l，硫酸鎂：0.1g/l，尿素：0.8g/l，ph6.0.或其他合適的培養(yǎng)基。

技術(shù)效果：相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了甜菊糖或甜葉菊浸提液在促進(jìn)小球藻生長中的應(yīng)用，在天然培養(yǎng)池中應(yīng)用甜菊糖及甜葉菊浸提液也能促進(jìn)小球藻的生長，顯著增加小球藻的數(shù)量，從而提高培養(yǎng)效率。

附圖說明

圖1不加甜菊糖時培養(yǎng)小球藻的增長率(培養(yǎng)時間5天)；

圖2添加不同濃度甜菊糖時小球藻的增長率(培養(yǎng)時間5天)；

圖3小球藻顯微照片(40x10，培養(yǎng)5天)；

圖4甜菊糖添加量6mm時小球藻顯微照片(40x10，培養(yǎng)時間5天)；

圖5甜菊糖添加量為10mm的小球藻培養(yǎng)液hplc分析；

圖6甜菊糖添加量為10mm小球藻液培養(yǎng)液的hplc分析(培養(yǎng)時間5天)；

圖7添加5％甜葉菊浸提液初始培養(yǎng)液的hplc分析(添加量5％)；

圖8添加5％甜葉菊浸提液時小球藻培養(yǎng)液的hplc分析(培養(yǎng)時間5天)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明的各種等價形式的修改均落于本申請所附權(quán)利要求所限定的范圍。

以下所有實(shí)施例中，小球藻數(shù)量的測定均用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)或在680nm條件下測吸光度計(jì)算。甜菊糖或甜葉菊購于江蘇寶蓮生物科技股份有限公司。所有培養(yǎng)液的配方均為：碳酸鈉：0.02g/l，硝酸鈉：2.0g/l，磷酸二氫鉀：0.02g/l，硫酸鎂：0.1g/l，尿素：0.8g/l，ph6.0。

附圖1和2中增長率計(jì)算：小球藻的增長率＝[(增長后的量-增長前的量)/增長前的量]×100％.

實(shí)施例1

50ml的藻液(培養(yǎng)液)中加入2mm(0.09g)甜菊糖，另一份對照(不加甜菊糖)，在25℃，4000lux光照下培養(yǎng)5天(每天定時搖勻)，用血球板計(jì)數(shù)法和光密度測定法檢測小球藻的生長量，與空白對照相比，小球藻的數(shù)量增加了107％.

實(shí)施例2

50ml的藻液(培養(yǎng)液)中加入4mm(0.14g)甜菊糖，另一份對照(不加甜菊糖)，在25℃，4000lux光照強(qiáng)度的條件下培養(yǎng)5天(每天定時搖勻)，用血球板計(jì)數(shù)法和光密度測定法檢測小球藻的生長量，與空白對照相比，小球藻數(shù)量增加了203％.

實(shí)施例3

50ml的藻液(培養(yǎng)液)中加入6mm(0.27g)甜菊糖，另一份做對照(不加甜菊糖)，在25℃，4000lux光照強(qiáng)度的條件下培養(yǎng)5天(每天定時搖勻)，用血球板計(jì)數(shù)法和光密度測定法檢測小球藻的生長量，與空白對照相比，小球藻的數(shù)量增加了368％.

實(shí)施例4

50ml的藻液(培養(yǎng)液)中加入8mm(0.36g)甜菊糖，另一份做對照(不加甜菊糖)，在25℃，4000lux光照強(qiáng)度的條件下培養(yǎng)5天(每天定時搖勻)，用血球板計(jì)數(shù)法和光密度測定法檢測小球藻的生長量，與空白對照相比，小球藻的數(shù)量增加了313％.

實(shí)施例5

50ml的藻液(培養(yǎng)液)中加入10mm(0.45g)甜菊糖粗品，另一份做對照(不加甜菊糖)，在25℃，4000lux光照強(qiáng)度的條件下培養(yǎng)5天(每天定時搖勻)，用血球板計(jì)數(shù)法和光密度測定法檢測小球藻的生長量，與空白對照相比，小球藻的數(shù)量增加了284％.

實(shí)施例6

50ml的藻液(培養(yǎng)液)中加入0.2mm(0.009g)甜菊糖粗品，另一份做對照(不加甜菊糖)，在25℃，4000lux光照強(qiáng)度的條件下培養(yǎng)5天(每天定時搖勻)，用血球板計(jì)數(shù)法和光密度測定法檢測小球藻的生長量，與空白對照相比，小球藻的數(shù)量增加了296％.

實(shí)施例7

甜葉菊以1:15(w/v)的比例加入水中煮沸5min，將甜葉菊浸提液添加到小球藻的培養(yǎng)液中，添加量為5％(w/w)；另一份不添加甜葉菊浸提液作對照，在25℃，4000lux光照強(qiáng)度的條件下培養(yǎng)5天(每天定時搖勻)，用血球板計(jì)數(shù)法和光密度測定法檢測小球藻的生長量，與對照相比，小球藻的數(shù)量增加了209％.

實(shí)施例8

甜葉菊以1:10(w/v)的比例加入水中煮沸8min，將甜葉菊浸提液添加到小球藻的培養(yǎng)液中，添加量為2％(w/w)；另一份不添加甜葉菊浸提液作對照，在25℃，4000lux光照強(qiáng)度的條件下培養(yǎng)5天(每天定時搖勻)，用血球板計(jì)數(shù)法和光密度測定法檢測小球藻的生長量，與對照相比，小球藻的數(shù)量增加了172％.

實(shí)施例9

甜葉菊以1:20(w/v)的比例加入水中煮沸4min，將甜葉菊浸提液添加到小球藻的培養(yǎng)液中，添加量為10％(w/w)；另一份不添加甜葉菊浸提液作對照，在25℃，4000lux光照強(qiáng)度的條件下培養(yǎng)5天(每天定時搖勻)，用血球板計(jì)數(shù)法和光密度測定法檢測小球藻的生長量，與對照相比，小球藻的數(shù)量增加了195％.

實(shí)施例10

甜葉菊以1:12(w/v)的比例加入水中煮沸5min，將甜葉菊浸提液添加到小球藻的培養(yǎng)液中，添加量為8％(w/w)；另一份不添加甜葉菊浸提液作對照，在25℃，4000lux光照強(qiáng)度的條件下培養(yǎng)5天(每天定時搖勻)，用血球板計(jì)數(shù)法和光密度測定法檢測小球藻的生長量，與對照相比，小球藻的數(shù)量增加了187％.

實(shí)施例11

甜葉菊以1:18(w/v)的比例加入水中煮沸7min，將甜葉菊浸提液添加到小球藻的培養(yǎng)液中，添加量為4％(w/w)；另一份不添加甜葉菊浸提液作對照，在25℃，4000lux光照強(qiáng)度的條件下培養(yǎng)5天(每天定時搖勻)，用血球板計(jì)數(shù)法和光密度測定法檢測小球藻的生長量，與對照相比，小球藻的數(shù)量增加了179％.

結(jié)果分析：

1、附圖1為小球藻在5天培養(yǎng)時間的增長率，附圖2為添加不同濃度甜菊糖時小球藻的增長率(培養(yǎng)時間為5天)，由圖2可見，適量添加甜菊糖可以顯著提高培養(yǎng)小球藻的數(shù)量。

2、圖3為小球藻的顯微照片(40x10，培養(yǎng)5天)；圖4為甜菊糖添加量6mm時小球藻的顯微照片(40x10，培養(yǎng)時間為5天)；由圖3和圖4的比較可見，與不加甜菊糖時的小球藻培養(yǎng)液相比，添加甜菊糖后的小球藻培養(yǎng)液中的藻體數(shù)量增多，說明一定條件下，添加適量的甜菊糖可以顯著提高小球藻的數(shù)量。

3、由圖5和圖6的比較可見，甜菊糖的添加量為10mm的小球藻培養(yǎng)液中甜菊糖中不同糖苷的量在同步減少，分析小球藻將甜菊糖中各糖苷作為養(yǎng)份來源之一。原料中甜菊糖苷成份甜菊苷(ss)的量為27.41mg，培養(yǎng)了5天后，甜菊苷(ss)的量降為18.61mg，在此時間段甜菊苷(ss)的利用率為32.11％[利用率％＝(甜菊糖的減少量/甜菊糖量)x100％].

4、由圖7和圖8比較可見，在小球藻培養(yǎng)基中添加適量的甜葉菊浸提液，經(jīng)培養(yǎng)后其中甜菊苷的量也有一定程度的變化，說明與加入甜菊糖的情況相似，其中所含的甜菊糖苷也會為小球藻所利用。