本發(fā)明涉及一種外周血細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

細(xì)胞培養(yǎng)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、新藥研發(fā)等各個領(lǐng)域，成為最重要的基礎(chǔ)科學(xué)之一。

人類外周血細(xì)胞培養(yǎng)廣泛用于醫(yī)療檢驗，尤其應(yīng)用在遺傳學(xué)，是重要基本檢驗技術(shù)之一。

目前普遍使用的外周血細(xì)胞的培養(yǎng)基采用傳統(tǒng)的含牛血清培養(yǎng)基，然而牛血清高成本，且存在病毒污染風(fēng)險、牛血清成分干擾實(shí)驗研究，皆可能導(dǎo)致檢驗數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確，因此無血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)是細(xì)胞培養(yǎng)的一大趨勢。

然而，采用了無血清培養(yǎng)基之后，在培養(yǎng)基中添加哪些適合外周血細(xì)胞生長的血清替代成分，是本領(lǐng)域技術(shù)人員需要解決的技術(shù)問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于相關(guān)技術(shù)的上述問題和/或其他問題，本發(fā)明一方面提供了一種外周血細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，其包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加組分，其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為rpmi1640培養(yǎng)基；所述添加組分及其濃度如下：白細(xì)胞介素-2，35-50mg/l；肝素，1-2g/l；轉(zhuǎn)鐵蛋白，25-30mg/l；人重組胰島素，20-30mg/l；m型植物血球凝集素，10-20mg/l；l-谷氨酰胺，7-10g/l；碳酸氫鈉，2-4g/l；各添加組分的濃度以所述外周血細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基的總體積為基準(zhǔn)。

優(yōu)選的，以所述外周血細(xì)胞培養(yǎng)基的總體積為基準(zhǔn)，所述rpmi1640培養(yǎng)基的干粉量為16-18g/l。

優(yōu)選的，以所述外周血細(xì)胞培養(yǎng)基的總體積為基準(zhǔn)，所述rpmi1640培養(yǎng)基的干粉量為16.8g/l。

優(yōu)選的，所述添加組分中，所述白細(xì)胞介素-2的濃度為42mg/l，所述m型植物血球凝集素的濃度為15.5mg/l。

優(yōu)選的，所述添加組分中，所述肝素的濃度為1.26g/l，所述轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為28mg/l，所述人重組胰島素的濃度為27mg/l，所述l-谷氨酰胺的濃度為8.5g/l，所述碳酸氫鈉的濃度為3.2g/l。

優(yōu)選的，所述添加組分還包括慶大霉素和鏈霉素，所述慶大霉素的濃度為2×10⁵–3.5×10⁵iu/l，所述鏈霉素的濃度為2×10⁵-4×10⁵iu/l。

優(yōu)選的，所述添加組分還包括酚紅鈉，所述酚紅鈉的濃度為6-8mg/l。

優(yōu)選的，所述無血清培養(yǎng)基的ph值為7.2～7.6。

本發(fā)明的外周血細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，采用rpmi1640培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及特定的添加組分的組合，尤其是添加了特定濃度范圍的白細(xì)胞介素-2與m型植物血球凝集素的組合，能夠滿足外周血細(xì)胞中的白細(xì)胞快速、大量的增殖的需求，特別適合用于外周血細(xì)胞的培養(yǎng)，具有較好的增殖效果和細(xì)胞存活率。

附圖說明

圖1為應(yīng)用例1的細(xì)胞分裂相檢測圖片；

圖2為對比例1的細(xì)胞分裂相檢測圖片。

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明并不限于這些具體實(shí)施方式。

在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案中，一種外周血細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，其包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加組分，其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為rpmi1640培養(yǎng)基；所述添加組分及其濃度如下：白細(xì)胞介素-2，35-50mg/l；肝素，1-2g/l；轉(zhuǎn)鐵蛋白，25-30mg/l；人重組胰島素，20-30mg/l；m型植物血球凝集素，10-20mg/l；l-谷氨酰胺，7-10g/l；碳酸氫鈉，2-4g/l；各添加組分的濃度以所述外周血細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基的總體積為基準(zhǔn)。

本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過大量的研究試驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)外周血細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基采用rpmi1640培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及上述特定的添加組分的組合，尤其是添加了特定濃度范圍的白細(xì)胞介素-2與m型植物血球凝集素的組合，能夠滿足外周血細(xì)胞中的白細(xì)胞快速、大量的增殖的需求，特別適合用于外周血細(xì)胞的培養(yǎng)，具有較好的增殖效果和細(xì)胞存活率。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述添加組分中，所述白細(xì)胞介素-2的濃度為42mg/l，所述m型植物血球凝集素的濃度為15.5mg/l。在本發(fā)明的另一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述添加組分中，所述肝素的濃度為1.26g/l，所述轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為28mg/l，所述人重組胰島素的濃度為27mg/l，所述l-谷氨酰胺的濃度為8.5g/l，所述碳酸氫鈉的濃度為3.2g/l；當(dāng)這些物質(zhì)都同時滿足上述濃度時，外周血細(xì)胞的培養(yǎng)效果更佳。

實(shí)施例1

實(shí)施例1的外周血細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基的配制過程如下：

步驟1)：在無菌條件下將合成的rpmi1640干粉在電子天平上稱取168g后置于消毒容器內(nèi)，加9l純化水稀釋后攪拌均勻獲得基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

步驟2)：將添加組分：32g碳酸氫鈉、85gl-谷氨酰胺、420mg白細(xì)胞介素-2、12.6g肝素、280mg轉(zhuǎn)鐵蛋白、270mg人重組胰島素、155mgm型植物血球凝集素、2.5g慶大霉素(相當(dāng)于2.5×10⁵iu/l)和3g鏈霉素(相當(dāng)于3×10⁵iu/l)、以及70mg酚紅鈉鹽依次加入步驟1)獲得的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，充分混勻。

步驟3)：過濾滅菌，再調(diào)節(jié)ph值至7.4±0.2，最后加入純化水將體積調(diào)節(jié)至10l；

步驟4)：培養(yǎng)基配制完成后，過濾滅菌，分裝、封口，最后冷藏(-20℃環(huán)境)備用。

應(yīng)用例1

首先采集人外周血，然后在無菌操作工作臺將0.25ml人外周血加入到裝有5ml實(shí)施例1的外周血細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶(市售的corning品牌t25型號的細(xì)胞培養(yǎng)瓶)中混勻，置37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

效果數(shù)據(jù)

對比例1：采用市售的外周血細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)過程與應(yīng)用例1相同，具體不再贅述。

分別檢測應(yīng)用例1和對比例1的細(xì)胞增殖速率以及細(xì)胞存活率。

應(yīng)用例1和對比例1，均在培養(yǎng)1、2和3天后，分別取樣培養(yǎng)液，進(jìn)行細(xì)胞濃度的檢測(每組檢測三次，取平均值)，檢測結(jié)果參見下表1。

表1

另一方面，取應(yīng)用例1和對比例1(培養(yǎng)3天后)的細(xì)胞培養(yǎng)液，檢測細(xì)胞分裂相，檢測結(jié)果分別參見圖1和圖2。

綜上結(jié)果可以看出，本發(fā)明實(shí)施例的外周血細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞增殖速度與存活率都高于市售的外周血細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，產(chǎn)生的分裂相也明顯多于市售的外周血細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基。

應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實(shí)施方式加以描述，但并非每個實(shí)施方式僅包含一個獨(dú)立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個整體，各實(shí)施方式中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實(shí)施方式。

上文所列出的一系列的詳細(xì)說明僅僅是針對本發(fā)明的可行性實(shí)施方式的具體說明，它們并非用以限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所作的等效實(shí)施方式或變更均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。