本發(fā)明涉及組織工程領(lǐng)域。更具體地，涉及一種可體外保持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多能性的方法。

背景技術(shù)：

針對(duì)臨床器官移植面對(duì)的可移植器官匱乏和異體移植排異反應(yīng)大的問(wèn)題，研究者們致力于人工組織和器官的研究。由于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemesenchymalmarrowstemcells,bmmscs)可以向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等多種細(xì)胞分化而受到了研究者們的廣泛關(guān)注。但是bmmscs用于臨床治療首先需要解決的一個(gè)問(wèn)題就是如何獲得足夠數(shù)量的bmmscs。人體骨髓中bmmscs數(shù)量只占0.001％-0.01％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于臨床治療所需的干細(xì)胞數(shù)量，所以要想將bmmscs用于臨床治療方面，必須要經(jīng)過(guò)體外增殖這一過(guò)程。最初的臨床研究是通過(guò)收集患者的自體干細(xì)胞，體外擴(kuò)增培養(yǎng)數(shù)周達(dá)一定數(shù)量后再使用，然而自體干細(xì)胞在應(yīng)用過(guò)程中逐漸暴露了諸多不便，例如擴(kuò)增能力個(gè)體差異大、潛在的腫瘤細(xì)胞污染風(fēng)險(xiǎn)、不能及時(shí)適應(yīng)病情的需要等，從而嚴(yán)重制約了自體干細(xì)胞的使用，并且由于生長(zhǎng)環(huán)境的改變，體外培養(yǎng)過(guò)程中干細(xì)胞很容易老化，即出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)改變、內(nèi)穩(wěn)態(tài)破壞以及多能性降低的情況，以致最終失去干細(xì)胞多能性，失去臨床應(yīng)用的價(jià)值，所以在bmmscs體外增殖培養(yǎng)過(guò)程中保持其良好生長(zhǎng)狀態(tài)尤其是多向分化潛能就變得非常重要。

bmmscs體外培養(yǎng)過(guò)程中主要受到相鄰細(xì)胞和所接觸培養(yǎng)基底的直接作用，而培養(yǎng)基底由于其化學(xué)組成、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、機(jī)械性能、表面生物活性分子等因素的復(fù)雜性而受到了研究者們的廣泛關(guān)注與深入研究。從形態(tài)學(xué)上分析原代提取的bmmscs貼壁生長(zhǎng)，呈長(zhǎng)梭形，形態(tài)均一，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞較為立體。隨著培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)、傳代次數(shù)增加，bmmscs會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞尺寸變大、變寬、細(xì)胞核增大、偽足增多、形態(tài)多樣化，光學(xué)顯微鏡下也較難觀察出其立體結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)的變化對(duì)于細(xì)胞是否老化是具有一定參考價(jià)值的，所以有研究者利用拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)反應(yīng)(topographicreaction)的概念，通過(guò)控制培養(yǎng)基底表面微結(jié)構(gòu)從而調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)和多能性，且取得了一些初步研究結(jié)果(mcmurrayrj,gadegaardn,tsimbouripm,etal.nanoscalesurfacesforthelong-termmaintenanceofmesenchymalstemcellphenotypeandmultipotency[j].naturematerials,2011,10(8):637-644.)。

現(xiàn)已報(bào)道的研究較多的制備表面微結(jié)構(gòu)的方法主要包括傳統(tǒng)光刻技術(shù)、微接觸印刷、噴墨印刷、自組裝方法和靜電紡絲技術(shù)等，但這些技術(shù)雖然在基礎(chǔ)研究中應(yīng)用較多，應(yīng)用于臨床研究仍然有很多問(wèn)題需要解決。傳統(tǒng)光刻技術(shù)與其他幾種方法相比，雖然對(duì)儀器設(shè)備要求低，但其分辨率較低；微接觸印刷等方法制備的微結(jié)構(gòu)雖然分辨率較光刻法有所提高，但實(shí)現(xiàn)大面積制備較為困難；而靜電紡絲技術(shù)不僅需要高壓電源設(shè)備，對(duì)材料及環(huán)境要求較高而且制備所得表面微結(jié)構(gòu)可控性較差；自組裝方法制備的表面微結(jié)構(gòu)雖然分辨率可調(diào)范圍大，但通常穩(wěn)定性較差、難以大面積制備。所以要想通過(guò)控制培養(yǎng)基底表面微結(jié)構(gòu)從而達(dá)到體外促進(jìn)bmmscs保持多能性的目的，并且這種培養(yǎng)基底可以實(shí)現(xiàn)低成本、大批量制備從而滿足臨床應(yīng)用需求，還需要探索新的方法。

因此，需要提供一種通過(guò)控制基底表面的取向微結(jié)構(gòu)在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)過(guò)程中保持其多向分化潛能的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種可以在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖培養(yǎng)的過(guò)程中保持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多能性的方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

本發(fā)明一種可體外保持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多能性的方法，包括以下步驟：

1)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取、原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)；

2)制備表面具有取向微結(jié)構(gòu)的復(fù)合膜培養(yǎng)基底；

3)在步驟2)制備的復(fù)合膜培養(yǎng)基底上培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

進(jìn)一步地，所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以來(lái)源于鼠、兔、人及其他各類動(dòng)物骨髓。

進(jìn)一步地，所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取可以采用全骨髓培養(yǎng)法，也可采用梯度離心法等方法提取。

進(jìn)一步地，所述原代培養(yǎng)是在35-40℃、5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24-48小時(shí)內(nèi)首次半換液，36-72小時(shí)內(nèi)首次全換液，之后每24-48小時(shí)換液一次。

所述傳代培養(yǎng)是待細(xì)胞融合比例達(dá)80％及以上，用胰蛋白酶按每10⁵-10⁶個(gè)細(xì)胞0.5ml-1ml胰蛋白酶比例25-40℃消化1-2分鐘至細(xì)胞收縮變圓，之后用培養(yǎng)基中和，吹打下細(xì)胞，于750-1000rpm室溫離心3-10分鐘，按1:2至1:4比例傳代，后放于35-40℃、5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每36-48小時(shí)換液。

進(jìn)一步地，所述傳代培養(yǎng)是傳代培養(yǎng)至第2-5代。

進(jìn)一步地，所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取、原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為α-mem，dmem或dmem/f12，所述培養(yǎng)基中含有5-15％胎牛血清(fbs)，0.5-2％青霉素-鏈霉素雙抗(p/s)。

進(jìn)一步地，所述2)步驟是利用摩擦取向與附生結(jié)晶相結(jié)合的方法：首先，在溫度低于聚合物熔點(diǎn)的熱臺(tái)上在基底上以恒速恒力摩擦聚合物棒；之后降至室溫，于生物高分子溶液中提拉負(fù)載聚合物的基底，得到生物高分子/聚合物復(fù)合膜；最后在低于生物高分子材料熔點(diǎn)溫度5-15℃加熱制備的復(fù)合膜基底實(shí)現(xiàn)附生結(jié)晶，得到大面積表面具有取向微結(jié)構(gòu)的復(fù)合膜培養(yǎng)基底。通過(guò)本方法制備得到的復(fù)合膜基底表面微結(jié)構(gòu)的凹槽深度可達(dá)50nm及以上，可以誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞大面積取向生長(zhǎng)。

其中，所述基底可為載玻片、蓋玻片等玻璃材質(zhì)材料，且使用前應(yīng)用食人魚洗液等浸泡清洗。

所述聚合物可以為聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯等，且摩擦過(guò)程中熱臺(tái)加熱溫度低于聚合物熔點(diǎn)，具體視聚合物種類而定。

所述生物高分子為聚己內(nèi)酯、聚乳酸等生物相容性好的高分子材料，且提拉成膜過(guò)程中高分子溶液濃度和所用溶劑視聚合物種類而定；所述聚己內(nèi)酯濃度為0.1-0.01g/ml，溶劑為三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、二甲基亞砜；聚乳酸濃度為0.2-0.01g/ml，溶劑為三氯甲烷、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、四氫呋喃；后處理加熱過(guò)程中熱臺(tái)溫度低于高分子材料熔點(diǎn)溫度5-15℃，具體視高分子材料種類而定。

進(jìn)一步地，步驟3)所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的接種密度為2000-10,000個(gè)/平方厘米；培養(yǎng)條件為35-40℃，5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每36-48小時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基一次。

本發(fā)明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在復(fù)合取向膜基底上培養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)程中，由于復(fù)合膜基底的表面取向微結(jié)構(gòu)和機(jī)械硬度等因素共同作用，使得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)4周時(shí)在形態(tài)上仍然保持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞典型形態(tài)，功能上仍然保持其多向分化潛能，且細(xì)胞增殖活力較好。

本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，原料價(jià)廉易得，且不需要大型設(shè)備，經(jīng)濟(jì)投入小，可以實(shí)現(xiàn)獲得大面積具有良好增殖活力的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的目的。

本發(fā)明可以為組織工程研究和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞研究提供更多的依據(jù)，也為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供了更多可能性。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。

圖1示出實(shí)施例1中表面具有取向微結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)基底的制備過(guò)程與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的示意圖。

圖2a示出實(shí)施例1制備的表面具有取向微結(jié)構(gòu)的復(fù)合培養(yǎng)基底的偏光顯微鏡圖像(右上角為摩擦誘導(dǎo)取向部分)；2b示出實(shí)施例1制備得到表面具有取向微結(jié)構(gòu)的復(fù)合培養(yǎng)基底的原子力顯微鏡高度圖像。

圖3a示出實(shí)施例1中在表面具有取向微結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)基底上生長(zhǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞熒光共聚焦圖像，3b為表面沒(méi)有取向微結(jié)構(gòu)培養(yǎng)基底上干細(xì)胞(對(duì)照組)，(藍(lán)色：細(xì)胞核；綠色：肌動(dòng)蛋白)。

圖4示出實(shí)施例1中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在表面具有取向微結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)基底上培養(yǎng)4周后qrt-pcr數(shù)據(jù)，以在表面沒(méi)有取向微結(jié)構(gòu)的基底上培養(yǎng)4周的干細(xì)胞作為對(duì)照(nanog，sox-2，pou5f1為干細(xì)胞多能性標(biāo)志基因，以管家基因gapdh為參照)。

圖5a-b示出實(shí)施例1中第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨與成脂誘導(dǎo)光學(xué)圖像(a.成骨，b.成脂)；圖5c-d示出實(shí)施例1中在表面具有取向微結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)基底上培養(yǎng)4周的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨與成脂誘導(dǎo)光學(xué)圖像(c.成骨，d.成脂)。

具體實(shí)施方式

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。附圖中相似的部件以相同的附圖標(biāo)記進(jìn)行表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說(shuō)明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1一種可體外保持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多能性的方法

一種可以體外保持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多能性的方法，主要包括以下內(nèi)容：

1)利用3周sd大鼠，斷頸分離出股骨和脛骨，在無(wú)菌操作臺(tái)中于pbs(ph7.4)中進(jìn)一步除去附著的肌肉組織；除去骨兩端，用5毫升注射器吸取足量α-mem(含10％fbs，1％p/s)培養(yǎng)基將全骨髓吹出，直至骨髓腔發(fā)白，將全骨髓用2毫升注射器吹散；轉(zhuǎn)移入37℃、5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48小時(shí)后首次半換液，72小時(shí)后首次全量換液，之后每48小時(shí)換液一次；待細(xì)胞融合至80-90％，用胰蛋白酶按照每10⁶細(xì)胞1ml胰蛋白酶比例37℃消化1分鐘，之后用α-mem(含10％fbs，1％p/s)培養(yǎng)基中和，吹打下細(xì)胞，于800rpm室溫離心5分鐘，按1:3比例傳代，后放于37℃、5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48小時(shí)換液，待融合達(dá)80％-90％，重復(fù)傳代操作，至骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞第三代。

2)在280℃熱臺(tái)上于食人魚洗液處理過(guò)的干凈載玻片上摩擦聚四氟乙烯(ptfe)棒，得到負(fù)載有取向ptfe層的載玻片基底；在數(shù)均分子量為80,000、濃度為0.02g/ml的聚己內(nèi)酯(pcl)的三氯甲烷溶液中快速提拉負(fù)載有取向ptfe層的載玻片基底，得到了pcl/ptfe取向復(fù)合膜；待溶劑蒸發(fā)后，于45℃上加熱2小時(shí)，促進(jìn)高分子聚合物進(jìn)一步結(jié)晶，最終得到了pcl/ptfe取向復(fù)合培養(yǎng)基底(具體步驟如圖1所示)；作為對(duì)比，未取向基底則直接在同濃度pcl的三氯甲烷溶液中提拉經(jīng)食人魚洗液處理的干凈載玻片，待溶劑揮發(fā)后，于45℃熱臺(tái)上處理2h，最終得到表面沒(méi)有取向微結(jié)構(gòu)的pcl薄膜基底。

比較表面具有取向微結(jié)構(gòu)的復(fù)合培養(yǎng)基底和表面沒(méi)有取向微結(jié)構(gòu)培養(yǎng)基底的結(jié)構(gòu)，如圖2所示，從圖2a的偏光顯微鏡圖像中可以看出，與pcl本身的球晶結(jié)構(gòu)相比，在取向聚四氟乙烯分子誘導(dǎo)下pcl沿著ptfe取向方向形成片晶，結(jié)晶較均勻，高分子材料成膜性好；從圖2b的表面具有取向微結(jié)構(gòu)的復(fù)合培養(yǎng)基底的原子力顯微鏡高度圖像可以看出，制備得到的復(fù)合膜基底表面取向微結(jié)構(gòu)的凹槽深度可達(dá)50nm，完全可以誘導(dǎo)細(xì)胞沿凹槽方向取向。

3)將得到的表面取向或未取向培養(yǎng)基底于紫外燈下紫外照射滅菌24h；將滅菌后的培養(yǎng)基底分別用pbs(ph7.4)和α-mem(含10％fbs，1％p/s)浸泡24h；將提取的第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以4000個(gè)/平方厘米的密度接種于表面取向或未取向培養(yǎng)基底上，于37℃，5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48小時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基一次。

4)培養(yǎng)四周后提取取向復(fù)合膜基底上培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的總rna，然后反轉(zhuǎn)錄為cdna，之后用qrt-pcr對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中nanog、sox-2和pou5f1多能性標(biāo)志基因的表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量(以管家基因gapdh為參照)，同時(shí)以沒(méi)有表面取向微結(jié)構(gòu)基底上培養(yǎng)4周的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為對(duì)比；進(jìn)一步，將在pcl/ptfe基底培養(yǎng)達(dá)4周的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞利用胰蛋白酶消化，按5000個(gè)/平方厘米密度種于12孔板中，待細(xì)胞融合比例達(dá)80％，利用成骨或成脂誘導(dǎo)劑進(jìn)行成骨或成脂誘導(dǎo)，再利用茜素紅s或油紅o進(jìn)行染色，以第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為對(duì)比，定性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是否具有多能性。

圖3給出了骨髓間充干細(xì)胞在pcl/ptfe或pcl上生長(zhǎng)5天的熒光共聚焦圖像，從圖中可知骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞沿著pcl/ptfe復(fù)合膜表面取向微結(jié)構(gòu)的凹槽方向?qū)崿F(xiàn)大面積取向。圖4給出了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在pcl/ptfe或pcl基底上培養(yǎng)4周后qrt-pcr數(shù)據(jù)(nanog，sox-2，pou5f1為干細(xì)胞多能性標(biāo)志基因，以管家基因gapdh為參照)；圖5a-b給出了第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨與成脂誘導(dǎo)光學(xué)圖像(a.成骨，b.成脂)；圖5c-d給出了在表面具有取向結(jié)構(gòu)的基底上培養(yǎng)4周的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨與成脂誘導(dǎo)光學(xué)圖像(c.成骨，d.成脂)；由圖4-5可知，采用本發(fā)明的方法可以使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)四周后仍然保持其多能性。

實(shí)施例2一種可體外保持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多能性的方法

步驟與實(shí)施例1相同，區(qū)別在于步驟2)中利用摩擦取向方法得到負(fù)載取向聚四氟乙烯載玻片，紫外滅菌后直接用于細(xì)胞培養(yǎng)，不進(jìn)行聚己內(nèi)酯提拉成膜步驟，以紫外滅菌的干凈載玻片為對(duì)照。

結(jié)果表明聚己內(nèi)酯提拉成膜得到的取向復(fù)合培養(yǎng)基底更利于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多能性的保持。

實(shí)施例3一種可體外保持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多能性的方法

步驟與實(shí)施例1相同，區(qū)別在于步驟1)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源由3周sd大鼠替換為2周sd大鼠、3周km小鼠、12周新西蘭兔，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞選用第3代至第5代。

實(shí)施例4一種可體外保持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多能性的方法

步驟與實(shí)施例1相同，區(qū)別在于步驟1)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取采取梯度離心法，得到第2代至第5代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用于培養(yǎng)。

實(shí)施例5一種可體外保持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多能性的方法

步驟與實(shí)施例1相同，區(qū)別在于將α-mem(含10％fbs，1％p/s)培養(yǎng)基替換為dmem/f12(含8％fbs，1％p/s)培養(yǎng)基或dmem(含15％fbs，2％p/s)培養(yǎng)基。

實(shí)施例6一種可體外保持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多能性的方法

步驟與實(shí)施例1相同，區(qū)別在于聚四氟乙烯替換為聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚偏氟乙烯或聚碳酸酯；步驟2)摩擦取向過(guò)程中熱臺(tái)溫度分別為聚乙烯(75℃)、聚丙烯(140℃)、聚苯乙烯(200℃)、聚偏氟乙烯(130℃)、聚碳酸酯(190℃)。

實(shí)施例7一種可體外保持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多能性的方法

步驟與實(shí)施例1相同，區(qū)別在于將濃度為0.02g/ml的聚己內(nèi)酯(pcl)的三氯甲烷溶液替換為濃度為0.01g/ml-0.02g/ml的聚己內(nèi)酯的二氯甲烷溶液。

實(shí)施例8一種可體外保持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多能性的方法

步驟與實(shí)施例1相同，區(qū)別在于生物高分子由聚己內(nèi)酯替換為聚乳酸，步驟2)提拉成膜后熱處理過(guò)程中熱臺(tái)溫度為90℃。

實(shí)施例3-8的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與實(shí)施例1相同均可以使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)四周后仍然保持其多能性。

顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定，對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)，這里無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。