本發(fā)明涉及細(xì)胞移植
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及hdac6抑制劑在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bonemarrowmesenchymalstemcell，bmscs）易于分離培養(yǎng)且免疫排斥弱，被廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞移植治療等組織工程學(xué)研究，然而移植的外源性bmscs在體內(nèi)損傷部位存活率低、生物分布十分有限，極大地阻礙了其臨床應(yīng)用，因此提高干細(xì)胞移植效率是目前迫切需要解決的問題之一。組蛋白去乙?；福╤istonedeacetylases，hdac）通過去乙?；揎棧谌旧|(zhì)重構(gòu)，基因轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)功能調(diào)控中起重要作用。最近研究表明，組蛋白去乙酰化酶6（histonedeacetylases6，hdac6）參與腦損傷的發(fā)生發(fā)展，而hdac6抑制劑不僅參與腦損傷后抗炎抗凋亡、促進(jìn)神經(jīng)再生等保護(hù)機(jī)制，還可誘發(fā)干細(xì)胞激活并向受損區(qū)域遷移，促進(jìn)腦缺血區(qū)域神經(jīng)和血管新生。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供hdac6抑制劑在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的之二在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療的藥物。為了實現(xiàn)上述目的之一，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：提供hdac6抑制劑在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植中的應(yīng)用，hdac6抑制劑在培養(yǎng)基中的濃度為0.25μm~0.5μm時，能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖作用，提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療效率。其中，hdac6抑制劑在培養(yǎng)基中的濃度為0.3μm時，能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖作用，提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療效率。其中，hdac6抑制劑在培養(yǎng)基中的濃度為0.4μm時，能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖作用，提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療效率。為了實現(xiàn)上述目的之二，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：提供一種用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療的藥物，將上述所述的hdac6抑制劑在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植中的應(yīng)用用于制備骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療的藥物，所述藥物含有hdac6抑制劑，所述藥物中hdac6抑制劑的濃度為0.25μm~0.5μm。其中，所述藥物中hdac6抑制劑的濃度為0.3μm。其中，所述藥物中hdac6抑制劑的濃度為0.4μm。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較，有益效果在于：（1）本發(fā)明提供的hdac6抑制劑在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植中的應(yīng)用，hdac6抑制劑在培養(yǎng)基中的濃度為0.25μm~0.5μm時，能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖作用，提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療效率，能夠為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植療法提供新思路。（2）本發(fā)明提供的一種用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療的藥物，能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖作用，提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療效率。附圖說明圖1為同時期的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察圖。其中，放大倍數(shù)為40倍。其中，圖中a原代培養(yǎng)第4天，b原代培養(yǎng)第6天，c第3代細(xì)胞，d第4代細(xì)胞。圖2是hdac6抑制劑作用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的24h后的細(xì)胞存活率圖。圖3是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的二維和三維形貌圖。其中，a、d：control組；b、e：0.25μmtubacin組；c、f：0.5μmtubacin組。圖4是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的高度直徑圖。其中，a、d：control組；b、e：0.25μmtubacin組；c、f：0.5μmtubacin組。圖5是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)及膜表面粒徑分布圖。其中，a、d、g：control組；b、e、h：0.25μmtubacin組；c、f、i：0.5μmtubacin組。圖6是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的膜表面粗糙度顯示圖。其中，a表示與對照組相比，p＜0.05。圖7是楊氏模量統(tǒng)計分布圖。其中，acontrol組；b0.25μmtubacin預(yù)處理組；c0.5μmtubacin預(yù)處理組。具體實施方式為了使本發(fā)明所解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實施例1。本實施例的hdac6抑制劑在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植中的應(yīng)用，hdac6抑制劑在培養(yǎng)基中的濃度為0.25μm~0.5μm時，能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖作用，提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療效率。其中，hdac6抑制劑在培養(yǎng)基中的濃度可為0.3μm，hdac6抑制劑在培養(yǎng)基中的濃度也可為0.4μm。實施例2。本實施例的一種用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療的藥物，將實施例1的hdac6抑制劑在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植中的應(yīng)用用于制備骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療的藥物，該藥物含有hdac6抑制劑，該藥物中hdac6抑制劑的濃度為0.25μm~0.5μm。其中，該藥物中hdac6抑制劑的濃度可為0.3μm，該藥物中hdac6抑制劑的濃度也可為0.4μm。本實施例的一種用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療的藥物，能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖作用，提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療效率。實驗：1材料與方法1.1實驗動物幼年雄性清潔級sd大鼠2只，體重約80-100g，用于bmscs原代培養(yǎng)（由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供）。p4代細(xì)胞用于實驗。1.2主要試劑及儀器原子力顯微鏡（nanoscope-v，veecoinstruments，美國），倒置熒光顯微鏡（olympus，日本），細(xì)胞培養(yǎng)箱（thermoscientific，美國），dmem/f12液體培養(yǎng)基，胎牛血清，胰蛋白酶（gibco，美國），tubacin（sigma，美國），戊二醛（南京森貝伽生物科技有限公司）。1.3bmscs的分離及培養(yǎng)大鼠頸椎脫臼處死，浸泡于75%酒精消毒20min。無菌操作原則下迅速剝離雙側(cè)脛骨及股骨，清除殘余肌肉和結(jié)締組織，保持骨膜及干骺端完整。無菌pbs沖洗3遍后剪去雙側(cè)干骺端，用5ml一次性注射器抽取dmem培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，盡量將骨髓組織全部沖出。隨后將骨髓組織沖洗液移入15ml離心管，1000r/min離心10min，棄上清。加入含10%胎牛血清的dmem/f12培養(yǎng)液5ml，輕輕吹打混勻后接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37℃、5%co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48h后首次全量換液，保留貼壁細(xì)胞，之后隔天換液，當(dāng)貼壁細(xì)胞達(dá)到80%至90%融合時，用0.25%胰酶消化，1000r/min離心5min后按1:2比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。1.4mtt法檢測tubacin對bmscs活力的影響取指數(shù)生長期的bmscs，0.25%胰酶消化離心收集細(xì)胞，用含10%胎牛血清的dmem/f12培養(yǎng)基稀釋成2×104/ml的細(xì)胞懸液，96孔培養(yǎng)板內(nèi)每孔加入100μl細(xì)胞懸液，計數(shù)每孔約含細(xì)胞2000個，設(shè)置調(diào)零組，對照組，不同濃度藥物處理組，每組各設(shè)5個復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后吸出培養(yǎng)基，各組添加含不同濃度tubacin的培養(yǎng)基200μl，陰性對照組添加相同體積的無血清培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h后，每孔加入20μl濃度5g/l的mtt溶液繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸去上清，每孔加200μldmso，結(jié)晶溶解后在波長490nm的酶標(biāo)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值。按照公式計算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=[(as-ab)/(ac-ab)]×100%，as：實驗孔吸光度值；ac：對照孔吸光度值；ab：空白孔吸光度值。1.5afm樣品制備與成像收集生長良好的p4代bmscs，調(diào)整密度至2×105/ml接種于35mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿，待細(xì)胞貼壁后各組分別加入含不同濃度tubacin的培養(yǎng)基，24h后棄去培養(yǎng)基，pbs洗兩次后用1%戊二醛固定細(xì)胞10min，隨后pbs洗三次，最后三蒸水洗滌兩次，室溫自然晾干。原子力顯微鏡在空氣中采用接觸模式對樣品進(jìn)行觀察，scanasyst成像，scanasyst-air型探針，設(shè)置256個采樣點，掃描速率為0.7hz。afm圖像全部經(jīng)過自帶軟件（nanoscopeanalysis）平滑處理，以消除掃描方向上的低頻背景噪音。afm力譜用于分析力曲線計算楊氏模量，所有力曲線都在同一加載速率測得。1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用spss19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用表示，組間比較采用單因素方程分析，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2實驗結(jié)果2.1bmscs的原代培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察骨髓細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶后，細(xì)胞呈圓形，大小不一，胞體透亮懸浮于培養(yǎng)液中，首次換液后觀察到部分細(xì)胞開始貼壁，呈圓形、梭形或多角形，以后貼壁細(xì)胞逐漸增多，6d左右細(xì)胞融合80%-90%，見圖1b。消化傳代12h后大部分細(xì)胞貼壁，鏡下觀察bmscs多呈長梭形或星形，胞漿豐富，核大而清晰，折光性好。細(xì)胞生長旺盛，每5天可傳代1次，經(jīng)過一二次傳代后，細(xì)胞呈放射狀或漩渦狀同向排列，形態(tài)趨于一致，見圖1c、d。2.2mtt實驗結(jié)果與對照組相比，tubacin處理24h后細(xì)胞存活率顯著提高，以0.5μm實驗組作用最為明顯，存活率高達(dá)180%，當(dāng)tubacin濃度提高到1μm以上時，細(xì)胞存活率下降，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05），見圖2。mtt結(jié)果表明，低濃度tubacin具有促bmsc增殖作用，因此，本實驗選擇0.25μm和0.5μm的tubacin作下一步細(xì)胞預(yù)處理。2.3bmsc的afm觀察原子力顯微鏡不僅有納米級的高分辨率，而且能在高分辨率基礎(chǔ)上觀察樣品的三維結(jié)構(gòu)。應(yīng)用afm獲得低濃度tubacin預(yù)處理細(xì)胞的二維和三維圖像，見圖3。根據(jù)隆起的邊緣可清楚辨別細(xì)胞位置和胞漿界限，bmsc以梭形為主，胞核大而清晰，絲狀偽足形成毗鄰細(xì)胞之間的網(wǎng)狀連接。圖4顯示control組細(xì)胞長徑為43.7μm，高度在20-100nm之間，0.25μmtubacin處理組細(xì)胞長徑為70.4μm，高度在50-200nm之間，0.5μmtubacin處理組細(xì)胞長徑為81.4μm，高度在80-200nm之間。結(jié)果顯示,隨著tubacin濃度的增加，細(xì)胞變得更狹長，擁有更長而豐富的偽足。圖5a-f為bmsc膜表面5μm×5μm的超微結(jié)構(gòu)圖，可明顯看到control組細(xì)胞膜表面粗糙不平整，有明顯孔洞和凹陷，表面顆粒分布不均，堆積松散，高度多集中在50-200nm，見圖5g。隨著tubacin濃度的增加，細(xì)胞表面更為光滑，顆粒分布均勻，大小在10-600nm，見圖5h、i，表面顆粒連接緊密，或成團(tuán)聚集，圖5b，或呈條索狀排列，圖5c。各實驗組分別隨機(jī)選取10個1μm×1μm的膜表面超微結(jié)構(gòu)區(qū)域，用nanoscopeanalysis軟件進(jìn)行測量，得到各組細(xì)胞膜表面粗糙度，結(jié)果顯示tubacin處理組的細(xì)胞膜表面均方根粗糙度（rq）及平均粗糙度（ra）較control組明顯降低，見表1、圖6。afm可測量力-距離曲線用于分析各實驗組細(xì)胞膜的機(jī)械性能，本實驗測量的區(qū)域為1μm×1μm，每個區(qū)域測量256條力曲線，每個細(xì)胞測量5個不同區(qū)域，各組分別測量10個細(xì)胞并進(jìn)行統(tǒng)計。楊氏模量反映細(xì)胞膜表面的剛性，楊氏模量越大，細(xì)胞越不易發(fā)生形變。圖6為各組細(xì)胞楊氏模量對比，隨著tubacin濃度的增加，楊氏模量逐漸增大，說明與control組相比，tubacin處理后細(xì)胞骨架排列更為緊密，抗形變能力增強(qiáng)，可承受更多的機(jī)械應(yīng)力。表1各組bmsc膜表面均方根粗糙度(rq)及平均粗糙度(ra)統(tǒng)計組別rq（nm）ra（nm）control16.28±4.1013.12±3.310.25μm14.80±3.8310.89±2.800.5μm8.34±2.20a6.94±1.89aa表示與對照組相比，p＜0.05。3討論近年來，大量研究證實hdac在細(xì)胞增殖分化中發(fā)揮重要作用，hdac6是hdacs家族中最獨(dú)特的成員，擁有2個鋅指結(jié)構(gòu)域，可特異性催化非組蛋白底物,參與調(diào)節(jié)眾多生理病理進(jìn)程。在胞內(nèi)，hdac6通過與α-tubulin、cortactin、hsp90等底物蛋白相互作用，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動。細(xì)胞的形貌結(jié)構(gòu)與其生理狀態(tài)和功能密切相關(guān)，細(xì)胞膜上分布的糖類、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等各類生物大分子，不僅保持著細(xì)胞膜的完整性，還負(fù)責(zé)傳遞細(xì)胞信號，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及細(xì)胞間相互作用，膜結(jié)構(gòu)的改變被認(rèn)為與細(xì)胞遷移、黏附密切相關(guān)。本研究中，經(jīng)tubacin處理的bmsc呈長梭形延伸鋪展，擁有更豐富的偽足，這既有利于細(xì)胞間的信息傳遞，又能增加細(xì)胞與基底接觸面積，從而增強(qiáng)細(xì)胞的運(yùn)動能力。膜表面粗糙度也是細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的重要參數(shù)，它被證實與細(xì)胞骨架的完整性有關(guān)。本研究中，tubacin處理后的細(xì)胞膜表面顆粒高度增加，粗糙度下降，這可能是細(xì)胞膜表面蛋白質(zhì)等大分子增加和細(xì)胞內(nèi)部骨架重新排列共同作用的結(jié)果。細(xì)胞遷移是一個高度復(fù)雜的過程，首先細(xì)胞運(yùn)動前端向遷移方向伸出偽足，與基質(zhì)黏附并向前移動，同時細(xì)胞后緣回縮，與基質(zhì)分離，這幾個步驟循環(huán)重復(fù)，同時細(xì)胞內(nèi)部不斷進(jìn)行骨架重排，結(jié)構(gòu)不斷發(fā)生變化。細(xì)胞硬度可直接反應(yīng)細(xì)胞骨架的構(gòu)成，硬度高的細(xì)胞內(nèi)部骨架排列更為緊密，在遷移過程中可承受更大外力并保持細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的有序性。此外，增加硬度還能為細(xì)胞運(yùn)動時的伸展、回縮提供更強(qiáng)大驅(qū)動力，幫助維持運(yùn)動方向，增強(qiáng)細(xì)胞遷移能力。afm力學(xué)檢測結(jié)果表明tubacin處理組細(xì)胞楊氏模量更大，硬度增加，機(jī)械性能增強(qiáng)，有助于提升細(xì)胞遷移效率。本實驗結(jié)果提示，低濃度tubacin可促進(jìn)bmsc增殖，引起細(xì)胞形貌及膜表面超微結(jié)構(gòu)改變，增強(qiáng)細(xì)胞機(jī)械性能，有助于提高細(xì)胞移植治療效率。本課題組將進(jìn)一步檢測低濃度tubacin對bmsc遷移、粘附能力的影響及其潛在作用機(jī)制，為干細(xì)胞移植療法提供新思路。最后應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細(xì)地說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。當(dāng)前第1頁12