其它專利申請

本申請要求2005年6月22日提交的ussn60/693,266的優(yōu)先權(quán)。

背景

再生醫(yī)學益于關于各種類型祖細胞的分離、培養(yǎng)和使用的最新研究進展。本

技術實現(xiàn)要素：
進一步提高了人多能干細胞和其衍生物的商業(yè)開發(fā)水平。

胚胎干細胞有兩種非常特殊的特性：第一，與其它正常的哺乳動物細胞類型不同，它們可以無限地培養(yǎng)增殖，供應量基本不受限制。第二，可用它們產(chǎn)生各種感興趣的組織類型，從而用作組織治療或用于藥物篩選所用的替代細胞和組織的來源。

thomson等(美國專利5,843,780；proc.natl.acad.sci.usa92:7844，1995)首先成功分離并增殖了靈長動物的多能干細胞。他們隨后由人胚泡產(chǎn)生了人胚胎干(hes)細胞系(science282:114，1998)。gearhart和同事們由胎兒性腺組織產(chǎn)生人胚胎生殖(heg)細胞系(shamblott等，proc.natl.acad.sci.usa95:13726，1998；和美國專利6,090,622)。hes和heg細胞都具有多能干細胞的長期尋求的特征：它們可無限培養(yǎng)而不分化，它們具有正常的核型，它們能夠產(chǎn)生許多種重要的細胞類型。

將多能干細胞用于治療的主要挑戰(zhàn)是通常將它們培養(yǎng)在一層飼養(yǎng)細胞上以防止分化(美國專利5,843,780；美國專利6,090,622)。按照thomson等(science282:114，1998)，在沒有飼養(yǎng)細胞的情況下培養(yǎng)的hps細胞很快死亡，或分化成定型細胞的異源群體。白血病抑制因子(lif)能抑制小鼠es細胞的分化，但它不會代替飼養(yǎng)細胞在防止人es細胞分化中的作用。

美國專利6,800,480(杰龍公司(geroncorp.))發(fā)明名稱為“用于培養(yǎng)靈長動物衍生的原代干細胞的方法和材料”(methodsandmaterialsforthegrowthofprimate-derivedprimordialstemcells)。國際專利公開wo01/51616(杰龍公司)發(fā)明名稱為“培養(yǎng)和分化人多能干細胞的技術”(techniquesforgrowthanddifferentiationofhumanpluripotentcells)。xu等的文章(naturebiotechnology19:971，2001)題為“不用飼養(yǎng)細胞來培養(yǎng)未分化的人胚胎干細胞”(feeder-freegrowthofundifferentiatedhumanembryostemcells)。lebkowski等的文章(cancerj.7增刊2:s83，2001)題為“人胚胎干細胞：培養(yǎng)、分化和遺傳修飾以用于再生醫(yī)學應用”(humanembryonicstemcells:culture,differentiation,andgeneticmodificationforregenerativemedicineapplications)。國際專利公開wo03/020920發(fā)明名稱為“用于快速擴增人胚胎干細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)”(culturesystemforrapidexpansionofhumanembryonicstemcells)。li等的文章(biotechnologyandbioengineering，在線公開日期：2005年6月21日)題為“人胚胎干細胞的擴增”(expansionofhumanembryonicstemcells)。這些出版物報道了用于以未分化狀態(tài)增殖胚胎干細胞的示范性培養(yǎng)試劑和技術，以及它們在制備用于人類治療的細胞中的應用。

以下章節(jié)提供的信息進一步發(fā)展了hes細胞培養(yǎng)的內(nèi)容，將有助于培養(yǎng)和操作未分化的多能干細胞，并且?guī)椭鷮崿F(xiàn)胚胎細胞治療的全部商業(yè)潛能。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供了用于培養(yǎng)和增殖靈長動物多能干(hes)細胞的改進系統(tǒng)。本發(fā)明的懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)使得使用者能夠以快速和體積-有效(volume-efficient)的方式產(chǎn)生用于治療和藥物發(fā)現(xiàn)的高質(zhì)量胚胎干細胞。

本發(fā)明一方面是懸浮培養(yǎng)人胚胎干(hes)細胞，其中hes細胞基本未分化。該培養(yǎng)物可含有以下一種或多種物質(zhì)：高濃度的成纖維細胞生長因子，其它培養(yǎng)基添加劑如tgfβ、干細胞因子(scf)或flt3配體(flt3l)，一種或多種可溶性或懸浮性胞外基質(zhì)組分如層粘連蛋白和/或纖連蛋白，或者任選為多孔性或被胞外基質(zhì)包被的各種類型的固體微粒。

本發(fā)明另一方面是培養(yǎng)hes細胞的方法，所述方法包括：將所述細胞懸浮于營養(yǎng)培養(yǎng)基中；用上述系統(tǒng)培養(yǎng)時維持所述細胞為懸浮狀態(tài)；定期更換培養(yǎng)基；任選地，不時將培養(yǎng)物分瓶培養(yǎng)，以降低細胞密度；最后收獲培養(yǎng)物中的細胞。

本發(fā)明另一方面是懸浮培養(yǎng)hes細胞的系統(tǒng)或試劑盒，其包括已經(jīng)提到或以下描述的一種或多種組分。

通過以下說明可以明白本發(fā)明的這些和其它方面。

附圖

圖1顯示了用補充有生長因子的非條件培養(yǎng)基在固體表面上傳代六次之后的hes細胞集落。(a)mef條件es培養(yǎng)基(對照)+bfgf(8ng/ml)；(b)x-vivo^tm10+bfgf(40ng/ml)；(c)x-vivo^tm10+bfgf(40ng/ml)+干細胞因子(scf，青灰因子)(15ng/ml)；(d)x-vivo^tm10+bfgf(40ng/ml)+flt3配體(75ng/ml)；(e)qbsf^tm-60+bfgf(40ng/ml)。可采用所有三種基礎培養(yǎng)基(es培養(yǎng)基、x-vivo^tm10和qbsf^tm-60)以無飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)方式擴增hes細胞。在這種情況下，用(c)所示組合條件培養(yǎng)的細胞每代擴增8.2倍，而用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞擴增2.2倍。

圖2顯示了經(jīng)實時rt-pcr測定的htert和oct3/4的基因表達概況，如實施例1所述。

圖3證明，用非條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞保持了它們的多能性。用mef條件培養(yǎng)基或含有bfgf和scf的非條件x-vivo^tm10培養(yǎng)基將hes細胞傳代7次。然后，使細胞分化成胚狀體，平板培養(yǎng)，用免疫細胞化學方法分析分別代表三個胚層的表型標記物。對細胞中的甲胎蛋白(代表內(nèi)胚層)；肌動蛋白(代表中胚層)和β-微管蛋白iii(代表外胚層)進行染色。

圖4顯示了在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶中懸浮培養(yǎng)的hes細胞的細胞計數(shù)(實施例3)。建立培養(yǎng)物后，細胞繼續(xù)以相同密度生長(上圖)。重新接種到標準表面進行培養(yǎng)時，它們恢復為未分化表型的典型形態(tài)：即具有經(jīng)典hes細胞形態(tài)的獨立細胞集落(下圖)。

圖5獲自以下實驗：使懸浮培養(yǎng)的細胞(圖4)分化成胚狀體、平板培養(yǎng)，然后通過免疫細胞化學分析具體的細胞類型(上面一列)。也顯示了完全通過標準表面培養(yǎng)方法維持的細胞(下面一列)。懸浮培養(yǎng)的細胞保持了全部多能性，這證明懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)在維持未分化hes細胞的重要特性方面的有效性。

圖6顯示了用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的另一懸浮培養(yǎng)物的細胞計數(shù)。

圖7顯示了在振蕩裝置上懸浮培養(yǎng)的不同hes細胞系的細胞。4周后，將細胞重新接種到固體表面上，顯示出經(jīng)典的未分化hes細胞形態(tài)，如圖所示。繼續(xù)以此方式進行培養(yǎng)3個月以上，顯示懸浮培養(yǎng)的細胞大量增殖。

詳述

培養(yǎng)靈長動物多能干(hes)細胞的現(xiàn)有技術包括在固體表面：即成纖維細胞飼養(yǎng)細胞(美國專利6,200,806)或胞外基質(zhì)(美國專利6,800,480)上培養(yǎng)?？蓛?yōu)化無飼養(yǎng)細胞的技術，以便快速擴增(wo03/020920)，大大降低為商業(yè)目的生產(chǎn)hes細胞的成本。

下述信息提供了進一步發(fā)展了hes細胞培養(yǎng)技術的新型系統(tǒng)。具體說，這種培養(yǎng)的生產(chǎn)能力不再受培養(yǎng)表面的二維大小的限制，能夠更充分地利用整個培養(yǎng)容器的三維空間。已經(jīng)確定了能夠?qū)es細胞懸浮培養(yǎng)三個月以上(實施例4)的培養(yǎng)條件。懸浮培養(yǎng)的hes細胞維持了未分化細胞的表型特征，并且維持了分化成代表三種胚層中任意一種的組織類型的全部潛能(實施例3)。

在三維空間中培養(yǎng)hes細胞的能力使得hes細胞的累積(bulkingup)成為一種更加節(jié)省成本的工藝，并且提供了更多的優(yōu)化hes細胞培養(yǎng)物的生產(chǎn)能力和生長速率的機會。采用懸浮培養(yǎng)物也有助于將hes細胞培養(yǎng)方法適應于封閉系統(tǒng)，其中以無菌方式將細胞和培養(yǎng)基引入該系統(tǒng)并從該系統(tǒng)中回收，但該系統(tǒng)也可在稍寬松的環(huán)境下運行。

從以下章節(jié)應能理解本發(fā)明的其它優(yōu)點。

定義

原型“靈長動物多能干細胞”(pps細胞)是衍生自受精后任何時間的胚前、胚胎或胎兒組織的多能細胞，它們具有能夠在正確條件下產(chǎn)生幾種不同細胞類型的后代的特征。按照標準技術-接受的監(jiān)測，pps細胞能夠產(chǎn)生作為三個胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)各自的衍生物的后代，如能夠在合適宿主中形成畸胎瘤，或能夠分化成具有所培養(yǎng)的所有三個胚層的組織類型的標記物的細胞。

pps細胞的定義包括各種類型的胚胎細胞如hes細胞(定義如下)；來自其它靈長動物的胚胎干細胞如獼猴或狨干細胞(thomson等，proc.natl.acad.sci.usa92:7844，1995；developmentalbiology38:133，1998)；和人胚胎生殖(heg)細胞(shamblott等，proc.natl.acad.sci.usa95:13726，1998)。該術語也包括其它類型的多能細胞。也包括能夠產(chǎn)生作為所有三個胚層的衍生物的后代的靈長動物來源的任何細胞。宜采用核型正常并且不是惡性腫瘤來源的pps細胞。

“人胚胎干細胞”(hes細胞)，除非另有明確說明，該術語包括具有hes細胞表型特征的已建立的譜系，以及該譜系仍然能夠產(chǎn)生三個胚層各自后代的衍生物。

當群體中大部分干細胞和其衍生物顯示出未分化細胞的形態(tài)學特征、能夠?qū)⑺鼈兣c胚胎或成年人來源的分化細胞明確區(qū)分開時，將hes細胞培養(yǎng)物稱為“未分化”。本領域技術人員不難辨識未分化的hes細胞，在二維的顯微鏡視野下，這種細胞一般呈現(xiàn)出高核/質(zhì)比和明顯的核仁。應理解，群體中未分化細胞的集落周圍常常環(huán)繞著已分化的鄰近細胞。然而，在合適條件下培養(yǎng)或傳代時未分化的集落持續(xù)存在，細胞群體中的大部分是單個未分化細胞。以發(fā)展的觀點看，基本未分化的培養(yǎng)物含有至少20％未分化的hes細胞，并可含有至少40％、60％或80％以提高優(yōu)選性(以未分化的基因型相同的細胞的百分數(shù)計)。

本文中稱培養(yǎng)物或細胞群體為“未分化”地增殖時，指增殖后，按照上述定義其組成為基本未分化。以與起始培養(yǎng)物相同的匯合度評價時，增殖至少四代(翻～20倍)而未分化的群體含有基本相同比例的未分化細胞(或者可能是更高比例的未分化細胞)。

“營養(yǎng)培養(yǎng)基”是含有促進增殖的營養(yǎng)物的細胞培養(yǎng)介質(zhì)。營養(yǎng)培養(yǎng)基一般含有等滲鹽水、緩沖液、蛋白質(zhì)來源(一種或多種添加的蛋白質(zhì)或氨基酸的形式)和(可能)其它外部添加的營養(yǎng)物和生長因子。

通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)第一細胞群體、然后收獲該培養(yǎng)基制備“條件培養(yǎng)基”。然后，可利用條件培養(yǎng)基(以及細胞分泌到培養(yǎng)基中的任何物質(zhì))支持第二細胞群體的生長。描述已將某具體成分或因子加入培養(yǎng)基時，指已通過有意操作將該因子(或經(jīng)工程改造能分泌該因子的細胞或顆粒)混入培養(yǎng)基中。

“新鮮培養(yǎng)基”是用于最終設計用來支持的細胞類型之前未與不同細胞類型一起培養(yǎng)而未被有目的地條件化的培養(yǎng)基。另外，不應對制備、儲存或使用方式進行任何限制。將其新鮮加入(通過交換或輸注)最終培養(yǎng)物，在培養(yǎng)物中該培養(yǎng)基被存在的細胞類型消耗或加工。

普通技術

分子遺傳學和遺傳工程中的普通方法參見當前版本的《分子克?。簩嶒炇沂謨浴?molecularcloning：alaboratorymanual)(sambrook等，冷泉港(coldspringharbor))；《哺乳動物細胞的基因轉(zhuǎn)移載體》(genetransfervectorsformammaliancells)(miller和calos編)；和《新編分子生物學實驗指南》(currentprotocolsinmolecularbiology)(f.m.ausubel等編，威利公司(wiley&sons))。細胞生物學、蛋白質(zhì)化學和抗體技術可參見《新編蛋白質(zhì)科學實驗指南》(currentprotocolsinproteinscience)(j.e.colligan等編，威利公司)；《新編細胞生物學實驗指南》(currentprotocolsincellbiology)(j.s.bonifacino等，威利公司)和《新編免疫學實驗指南》(currentprotocolsinimmunology)(j.e.colligan等編，威利公司)。本發(fā)明中提到的用于遺傳操作的試劑、克隆載體和試劑盒可購自生產(chǎn)商如伯樂公司(biorad)、司查塔基公司(stratagene)、英杰公司(invitrogen)、克隆泰克公司(clontech)和西格馬-奧德里奇公司(sigma-aldrichco.)。

細胞培養(yǎng)方法通常參見當前版本的《動物細胞培養(yǎng)：基本技術手冊》(cultureofanimalcells：amanualofbasictechnique)(r.i.freshney編，威利公司)；《普通細胞培養(yǎng)技術》(generaltechniquesofcellculture)(m.a.harrison和i.f.rae，劍橋大學出版社(cambridgeuniv.press))和《胚胎干細胞：方法和實驗方案》(embryonicstemcells：methodsandprotocols)(k.turksen編，休曼出版社(humanapress))。其它感興趣的參考文獻包括《我們做培養(yǎng)》(cultureisourbusiness)(m.mcluhan，巴拉汀書局(ballantinebooks)，1970)；和《理解培養(yǎng)基》(understandingmedia)(m.mcluhan，signet，1970)。組織培養(yǎng)用品和試劑可購自生產(chǎn)商如吉布科/brl(gibco/brl)、納耳-囊克國際公司(nalgene-nuncinternational)、西格馬化學品公司(sigmachemicalco.)和icn生物醫(yī)藥公司(icnbiomedicals)。

干細胞來源

實施例部分的內(nèi)容是用hes細胞產(chǎn)生的。然而，除非另有要求，可采用滿足靈長動物多能干細胞定義的其它細胞實施本發(fā)明。

實施本發(fā)明決不需要分解人胚泡以產(chǎn)生用于實施本發(fā)明的hes或胚胎干細胞。hes細胞可由可獲自公共保藏單位(例如美國威斯康星州麥迪遜的wicell研究所(wicellresearchinstitute)或美國弗吉尼亞州馬納薩斯的美國典型培養(yǎng)物保藏中心)的已建立譜系獲得。可由原始生殖細胞制備人胚胎生殖(heg)細胞，如shamblott等，proc.natl.acad.sci.u.s.a.95:13726，1998和美國專利6,090,622所述。美國專利公開2003/0113910a1報道了不用胚胎或胎兒組織獲得的多能干細胞。也可采用誘導多能表型的因子使其它祖細胞再程序化為hes細胞(chambers等，cell113:643，2003；mitsui等，cell113:631，2003)。在適當條件下，具有合適的增殖和分化能力的任何細胞均可用于產(chǎn)生用于本發(fā)明的分化組織。

hes細胞的增殖

最初，本領域的大多數(shù)科學家偏愛在一層飼養(yǎng)細胞上培養(yǎng)hes細胞，以防止分化，如thomson(美國專利5,843,780；美國專利6,090,622)所述。

早期，杰龍公司的科學家發(fā)現(xiàn)了可以另一種形式提供飼養(yǎng)細胞所產(chǎn)生的促進未分化表型增殖的成分的培養(yǎng)系統(tǒng)。美國專利6,800,480、wo01/51616(杰龍公司)和xu等(naturebiotechnology19:971，2001)描述了能支持在不分化的情況下增殖的無飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)環(huán)境。

無飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)法一方面是通過在胞外基質(zhì)上培養(yǎng)支持hes細胞?？赏ㄟ^預培養(yǎng)和裂解基質(zhì)-形成細胞系(美國專利6,800,480)，如sto小鼠成纖維細胞系(atcc登錄號crl-1503)或人胎盤成纖維細胞沉積基質(zhì)。也可將基質(zhì)直接包被到含有分離基質(zhì)組分的培養(yǎng)容器中。是由engelbreth-holm-swarm腫瘤細胞制備的可溶性制劑，它在室溫下形成凝膠，以形成重建的基底膜。其它合適的胞外基質(zhì)組分可包括單獨或以各種方式組合的層粘連蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖、玻連蛋白、巢蛋白、硫酸類肝素等。基質(zhì)組分可以是人的，和/或由重組表達產(chǎn)生?？捎帽疚乃鰧嶒灧椒z測的底物不僅包括其它胞外基質(zhì)組分，還包括聚胺、水凝膠和其它市售包被物。

無飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的另一方面是營養(yǎng)培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基通常含有能提高細胞存活率的普通組分，包括等滲緩沖液(即調(diào)節(jié)至工作濃度時等滲的緩沖液)、必需礦物質(zhì)和血清或某種血清替代物。

直接引入hes支持因子的方式是用原代小鼠胚胎成纖維細胞(mef)預調(diào)節(jié)培養(yǎng)基，所述原代小鼠胚胎成纖維細胞可按照美國專利6,200,806或wo01/51616所述的方法制備。適合用作飼養(yǎng)細胞的還有端?；毎?，以及獲自正在分化的es細胞(美國專利6,642,048)或其它原始細胞類型的人細胞系。可通過培養(yǎng)飼養(yǎng)細胞(一般通過輻射或其它方式滅活)調(diào)節(jié)hes細胞培養(yǎng)基。通過37℃培養(yǎng)1-2小時調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基含有能支持hes細胞培養(yǎng)物約1-2天的濃度的因子。然而，可上調(diào)或下調(diào)調(diào)節(jié)時間，憑經(jīng)驗確定足夠的調(diào)節(jié)時間。

作為條件培養(yǎng)基的替代方法，用含有引發(fā)未分化細胞中合適信號轉(zhuǎn)導通路的添加因子的新鮮(非條件)培養(yǎng)基培養(yǎng)hes細胞?？蓱{經(jīng)驗鑒定無需調(diào)節(jié)即可使用的合適的基本培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基一般含有等滲溶液形式的中性緩沖液(如磷酸鹽和/或高濃度碳酸氫鹽)；蛋白質(zhì)營養(yǎng)物(如血清如fbs、血清替代物、白蛋白或必需和非必需氨基酸如谷胺酰胺)。它一般還含有脂質(zhì)(脂肪酸、膽固醇、血清的hdl或ldl提取物)和大多數(shù)此類培養(yǎng)基母液中發(fā)現(xiàn)的其它成分(如胰島素或轉(zhuǎn)鐵蛋白、核苷或核苷酸、丙酮酸、糖源如葡萄糖、任何離子化形式或鹽形式的硒、糖皮質(zhì)激素如氫化可的松和/或還原劑如β-巰基乙醇)。

已經(jīng)開發(fā)了許多適用于培養(yǎng)增殖性細胞類型如造血細胞的市售基礎培養(yǎng)基。例如x-vivo^tm10擴增培養(yǎng)基(拜惠特克公司(biowhittaker))和qbsf^tm-60(質(zhì)量生物公司(qualitybiologicalinc.))(實施例1)。也參見wo98/30679(生命技術公司(lifetechnologiesinc.))和美國專利5,405,772(阿姆基公司(amgen))。x-vivo^tm10配方含有藥物級人白蛋白、重組人胰島素和巴氏殺菌的人轉(zhuǎn)鐵蛋白。x-vivo^tm10培養(yǎng)基中不包含外源性生長因子、細胞增殖的人工刺激物或不確定的補充物。它們也不含任何蛋白激酶c刺激物。qbsf^tm-60是含有重組或巴氏殺菌的人蛋白質(zhì)的無血清配方。其它可能的替代物是jrh生物科學公司(jrhbiosciences)生產(chǎn)的ex-cellvpro^tm培養(yǎng)基和?？寺」?hyclone)生產(chǎn)的hyqcdm4^tm。

基礎培養(yǎng)基補充有能促進未分化表型增殖并且抑制分化的添加劑。高濃度的成纖維細胞生長因子能特別有效地促進hes細胞在不分化的情況下增殖。例如堿性fgf(fgf-2)、和fgf-4，但也可采用該家族的其它成員。等同形式是種類同源物、人工類似物、各fgf受體的抗體和其它受體活化分子。已由基因表達分析證明，未分化的hes細胞表達酸性fgf(fgf-1)的受體。在高濃度下，單獨fgf就足以促進hes細胞以未分化狀態(tài)生長(實施例1和2)。能有效促進未分化的hes細胞生長的fgf濃度的下限通常約為20、30或40ng/ml，實際的下限約為200、500或1000ng/ml。至少為60、80或100ng/mlbfgf的濃度既可靠又節(jié)省成本?？赏ㄟ^將培養(yǎng)物中的bfgf換成擬定的替代物，并按照下述標記物系統(tǒng)監(jiān)測該培養(yǎng)物的分化情況，從而憑經(jīng)驗確定fgf的其它形式和類似物的等同濃度。

懸浮培養(yǎng)hes細胞

現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，可懸浮培養(yǎng)hes細胞，而不一定要讓所述細胞生長在固體基片上。

將用另一種培養(yǎng)方法擴增(或獲自原代來源)的hes細胞接種到適合保持該細胞呈懸浮狀態(tài)的容器中。該容器壁一般對未分化hes細胞的粘附是惰性或有抗性。也有防止細胞沉淀下來的裝置，例如，攪拌機械裝置如磁力或機械驅(qū)動的攪拌板或攪拌槳、振蕩機械裝置(一般連接于該容器的外側(cè))或倒轉(zhuǎn)機械裝置(即旋轉(zhuǎn)該容器以改變重力作用于細胞的方向的裝置)。

工藝開發(fā)中適用于懸浮培養(yǎng)的容器包括普通范圍的市售旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶或振蕩培養(yǎng)瓶。適用于商業(yè)生產(chǎn)的發(fā)酵罐是celligenplus^tm(新布倫茲維克科學公司(newbrunswickscientificco.))和stirred-tankreactor^tm(艾普利康公司(applikoninc.))。這些生物反應器可連續(xù)灌注培養(yǎng)基或以批量給料模式運行，大小可以不同。

按需更換幫助維持未分化表型和支持生長的營養(yǎng)培養(yǎng)基(例如，使細胞沉淀、更換培養(yǎng)基、然后重懸細胞)。監(jiān)測生長情況，需要為進一步生長騰出空間時將培養(yǎng)物分瓶。合適的培養(yǎng)時間后，收獲細胞，并用于所需目的。

設計用于在固體表面上沒有飼養(yǎng)細胞的情況下培養(yǎng)hes細胞的培養(yǎng)基和其它組分也可用于懸浮培養(yǎng)?？刹捎脳l件培養(yǎng)基或新鮮培養(yǎng)基(實施例4)。然而，懸浮培養(yǎng)的動力學為使用者提供了另一個優(yōu)化培養(yǎng)系統(tǒng)各個組分的機會。不受限于理論，本發(fā)明假設：如果允許hes細胞形成可能被部分分化成基質(zhì)細胞的細胞圍繞的小的未分化細胞簇(固體表面上未分化集落的三維等同物)—或者如果分散了hes細胞，但避免了可能引起分化的動態(tài)流體力，則會增加懸浮培養(yǎng)物。

可通過經(jīng)驗式檢測優(yōu)化懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)。將來自之前的表面或懸浮培養(yǎng)物的未分化細胞傳代至測試條件下，培養(yǎng)1周或更長時間?？刹捎?例如)下一章節(jié)所述和實施例1說明的標記物系統(tǒng)定期檢測細胞的hes細胞特征。也可將細胞傳代回已很好建立的培養(yǎng)系統(tǒng)中，評價未分化細胞的經(jīng)典形態(tài)學特征(實施例3)。如果想要使hes細胞最終分化為具體組織類型，那么最終測試目標可能不是未分化培養(yǎng)物的標記物概況，而是細胞按需分化的能力。可通過采樣細胞，然后在scid小鼠中產(chǎn)生畸胎瘤或?qū)b衍生細胞上代表所有三個胚層的標記物進行染色(實施例3)驗證hes懸浮培養(yǎng)物的多能性。使用者可由此優(yōu)化系統(tǒng)，以獲得高生長速率并保持該細胞的完整潛能(或者至少保持該細胞分化成所需的感興趣組織的能力)。

可能獲益于進一步優(yōu)化的培養(yǎng)系統(tǒng)的方面包括營養(yǎng)培養(yǎng)基。前一章節(jié)中列出了替代的基礎培養(yǎng)基和替代的fgf添加劑。采樣如下所述的一種或多種額外添加劑也可能是有利的：

·干細胞因子(scf、青灰因子)、使c-kit二聚化的其它配體或抗體、以及同一信號轉(zhuǎn)導途徑的其它激活物

·其它酪氨酸激酶相關受體，如血小板衍生生長因子(pdgf)、巨噬細胞集落刺激因子、flt-3配體和血管內(nèi)皮生長因子(vegf)的受體的配體

·提高環(huán)化amp水平的因子，如毛喉素

·gp130誘導因子，如lif或制瘤素-m；

·造血生長因子，如血小板生成素(tpo)

·轉(zhuǎn)化生長因子，如tgfβ1

·其它生長因子，如表皮生長因子(egf)

·神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，如cntf

考慮到防止細胞互相粘附、粘附于容器壁或形成過大的細胞簇，含有抗聚集劑如英杰公司(invitrogen)(目錄號0010057ae)出售的試劑可能有利。

雖然細胞能形成有限程度的自身胞外基質(zhì)，但包含溶解或懸浮于培養(yǎng)基的一種或多種胞外基質(zhì)組分也可能有利。使層粘連蛋白保持懸浮狀態(tài)的合適工作范圍是約10-33μg/ml。用于懸浮培養(yǎng)物的其它候選基質(zhì)組分包括前述一些物質(zhì)，具體是纖連蛋白、蛋白聚糖、玻連蛋白和其人工等同物。胞外基質(zhì)可能幫助細胞形成合適大小的小聚集體。

或者或此外，該懸浮培養(yǎng)物可含有在懸液中建立表面的顆粒載體，但仍提供在三維空間中培養(yǎng)細胞的益處。以相同方式培養(yǎng)和傳代細胞，除了在更換培養(yǎng)基時使顆粒保留在容器中，分瓶時加入更多顆粒。

一種類型的微載體是由玻璃、塑料、帶有正電荷以增強細胞粘附的右旋糖苷(賽陶代公司(cytodex))等制成的固體球狀或半球狀顆粒。另一種類型是圓盤形培養(yǎng)塑料，如新布倫茲維克科學公司出售的fibra-celdisks^tm。1克這種圓盤基料提供的表面積為1200cm²。任選地用hes細胞友好型胞外基質(zhì)如層粘連蛋白包被固體載體，以使粘附的細胞與接種到固體表面上的細胞的微環(huán)境相同。

另一種類型的微載體是具有能使細胞滯留在內(nèi)部和外部、以潛在地提高保護效果的不同孔徑的大孔隙顆粒。為了在破壞性最小的情況下回收hes細胞，宜采用通過溫和的機械或酶學作用可容易地溶解或分散、從而釋放細胞用于收獲或進一步培養(yǎng)的材料(如瓊脂糖)制成的顆粒。

未分化hes細胞的特征

按照本發(fā)明培養(yǎng)的人es細胞具有未分化干細胞的特征性形態(tài)特征。在標準二維顯微照片中，hes細胞在圖像平面中具有高核/質(zhì)比、明顯的核仁并形成很難辨別的細胞連接的致密集落。可采用標準的g-顯帶技術對細胞系進行核型分型(可由提供常規(guī)核型分型服務的許多臨床診斷實驗室，如加利福尼亞州奧克蘭的細胞遺傳學實驗室(cytogeneticslab)進行)并與公開的人核型作比較。有利的是，獲得具有“正常核型”(指細胞是整倍體)的細胞，其中所有人染色體都存在并且沒有發(fā)生顯著改變。

可通過用可用抗體(流式細胞術或免疫細胞化學方法)或用逆轉(zhuǎn)錄酶pcr檢測的細胞表達標記物表征hes細胞。hes細胞一般具有抗體-可檢測的ssea-4、tra-1-60和tra-1-81，但鮮見ssea-1，該細胞具有堿性磷酸酶活性?？梢栽趍rna水平檢測的合適標記物參見美國申請2003/0224411a1(杰龍公司)。例子是畸胎癌生長因子(cripto)、胃泌素-釋放肽(grp)受體、足萼蛋白(podocalyxin)-樣蛋白(podxl)、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(htert)和pou轉(zhuǎn)錄因子oct3/4。

如前所述，增殖的hes細胞的重要特征是分化成內(nèi)胚層、中胚層和外胚層三個胚層的細胞的潛能?？赏ㄟ^在scid小鼠中形成畸胎瘤以及檢測它們形成三個胚層的代表性組織來驗證hes細胞的潛能?；蛘撸筯es細胞非特異性分化(例如通過形成胚狀體)、然后用免疫細胞化學方法測定培養(yǎng)物中代表的細胞類型，從而測定潛能(實施例3)?？砂凑障乱徽鹿?jié)所述的方法確定hes細胞分化成具體細胞系的潛能。

增殖的hes細胞的應用

本發(fā)明提供了可以商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)大量多能細胞的方法。該細胞可以未分化形式用于多種研究和商業(yè)目的，或者可定向分化成具體細胞類型。

未分化的hes細胞可用于篩選能影響培養(yǎng)的hes細胞的特征的因子(如小分子藥物、肽、多核苷酸等)或條件(如培養(yǎng)條件或操作條件)。hes培養(yǎng)物也可用于藥物研究以檢測藥物化合物。候選藥物化合物活性的評價通常包括將本發(fā)明分化細胞與候選化合物混合，確定得到的改變，然后將化合物作用與觀察到的改變關聯(lián)起來?？赏ㄟ^細胞活力、形態(tài)學、某些標記物、受體或酶的表達或釋放、dna合成或修復等等來確定細胞毒性或代謝作用。

按照本發(fā)明培養(yǎng)的hes細胞可用于制備各種商業(yè)上和治療上重要的組織類型的分化細胞。

肝細胞

可采用組蛋白脫乙酰酶抑制劑由hes細胞分化肝細胞，如美國專利6,458,589和pct公開wo01/81549(杰龍公司)所述。在組蛋白脫乙酰酶抑制劑的存在下培養(yǎng)未分化的hes細胞。

使hes細胞分化成肝細胞的分階段方法參見us2005/0037493a1(杰龍公司)。依次采用分化和成熟劑的幾種組合培養(yǎng)細胞，使hes細胞首先分化成早期內(nèi)胚層或肝細胞前體，然后分化成成熟的肝細胞樣細胞。簡言之，可采用丁酸鹽、dmso或胎牛血清(任選與成纖維細胞生長因子連用)啟動向內(nèi)胚層樣細胞的分化。然后，可采用市售肝細胞培養(yǎng)基繼續(xù)分化，所述培養(yǎng)基包含諸如肝細胞生長因子(hgf)、表皮生長因子(egf)和/或骨形態(tài)發(fā)生蛋白(如mp-2、4或7)等因子的各種組合?？赏ㄟ^藥物如地塞米松或制瘤素m的存在提高最終成熟度。獲得具有脫唾液酸糖蛋白表達、糖原儲存、細胞色素p450酶表達；葡萄糖-6-磷酸酶活性和肝細胞的形態(tài)特征的細胞。

神經(jīng)細胞

可按照美國專利6,833,269；carpenter等，expneurol.2001；172(2):383-97；和wo03/000868(杰龍公司)所述的方法由hes細胞產(chǎn)生神經(jīng)細胞。用含有一種或多種神經(jīng)營養(yǎng)蛋白和一種或多種促分裂原的培養(yǎng)基培養(yǎng)未分化的hes細胞或胚狀體細胞，產(chǎn)生至少～60％細胞表達a2b5、聚唾液酸化ncam或干蛋白(nestin)并能夠在培養(yǎng)過程中翻至少20倍的細胞群體。示范性促分裂原是egf、堿性fgf、pdgf和igf-1。示范性神經(jīng)營養(yǎng)蛋白是nt-3和bdnf。tgf-β超家族拮抗劑或者camp和抗壞血酸的組合可用于提高酪氨酸羥化酶呈陽性(多巴胺能神經(jīng)元的特征)的神經(jīng)元細胞的比例。然后，可通過在沒有促分裂原的情況下用神經(jīng)營養(yǎng)蛋白培養(yǎng)使增殖細胞發(fā)生終末分化。

將hes細胞培養(yǎng)成細胞聚集體，并懸浮于含有促分裂原如fgf和少突膠質(zhì)細胞分化因子如三碘甲腺原氨酸、硒和視黃酸的培養(yǎng)基中，從而由hes細胞產(chǎn)生少突膠質(zhì)細胞。然后，將細胞接種到固體表面上，消除視黃酸，擴增該群體?？赏ㄟ^接種于聚-l-賴氨酸上并去除所有生長因子實現(xiàn)終末分化。獲得的細胞群體中超過80％的細胞的少突膠質(zhì)細胞標記物ng2蛋白聚糖、a2b5和pdgfrα呈陽性，而神經(jīng)元標記物neun呈陰性。參見pct公開wo04/007696和keirstead等，jneurosci.2005；25(19):4694-705。

心臟細胞

可按照wo03/006950提供的方法由hes細胞產(chǎn)生心肌細胞或心肌細胞前體。在含有胎牛血清或血清替代物和任選的影響dna-甲基化的心臟營養(yǎng)因子如5-氮胞苷的懸浮液中培養(yǎng)所述細胞?；蛘撸刹捎没罨豠和骨形態(tài)發(fā)生蛋白4的組合在固體基片上直接分化心肌細胞簇：然后，可通過密度離心將自發(fā)收縮細胞與細胞群體中的其它細胞分離。

進一步的工藝步驟可包括培養(yǎng)所述細胞，以便形成稱為心臟體^tm(cardiacbodies^tm)的細胞簇，取出單個細胞，然后分散并再形成心臟體^tm，連續(xù)重復這一過程。獲得的細胞群體中ctni、ctnt、心臟特異性肌球蛋白重鏈(mhc)和轉(zhuǎn)錄因子nkx2.5染色陽性細胞的比例高。參見wo03/006950，xu等，circres.2002；91(6):501-8；和pct/us2005/009081(杰龍公司)。

其它細胞類型

hes細胞通過在含有選自下組的幾種因子組合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，啟動hes細胞的分化，從而由hes細胞分化島細胞：活化素a、組蛋白脫乙酰酶抑制劑(如丁酸鹽)、促分裂原(如bfgf)；和tgf-β超家族拮抗劑(如頭蛋白)。然后，可通過與煙酰胺一起培養(yǎng)使該細胞成熟，產(chǎn)生其中至少5％的細胞表達pdx1、胰島素、胰高血糖素、促生長素抑制素和胰多肽的細胞群體。參見wo03/050249(杰龍公司)。

可通過共同培養(yǎng)hes細胞與鼠骨髓細胞或卵黃囊內(nèi)皮細胞制備造血細胞，以產(chǎn)生具有造血細胞標記物的細胞(美國專利6,280,718)。也可通過用造血細胞因子和骨形態(tài)發(fā)生蛋白培養(yǎng)hes細胞來制備造血細胞，如us2003/0153082a1和wo03/050251(珞巴茨研究所(robartsinstitute))所述。

可按照wo03/004605所述的方法由hes細胞產(chǎn)生間充質(zhì)祖細胞。然后，在含有成骨因子如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(具體是bmp-4)、人tgf-β受體的配體、人維生素d受體的配體的培養(yǎng)基中使hes-衍生的間充質(zhì)細胞進一步分化為成骨細胞譜系細胞(wo03/004605；sotile等，cloningstemcells2003；5(2):149-55)?？刹捎脀o03/050250所列分化因子(杰龍公司)的有效組合培養(yǎng)微聚集體狀態(tài)的hes細胞，從而產(chǎn)生軟骨細胞或其祖細胞。

本領域已知和隨后開發(fā)的其它分化方法可應用于按照本發(fā)明培養(yǎng)的hes細胞。hes衍生細胞可用于藥物篩選、制備藥物組合物、研究和許多其它值得的目的。

商業(yè)流通

本發(fā)明培養(yǎng)系統(tǒng)的組分可經(jīng)許諾銷售、出售或其它分銷途徑由產(chǎn)地供給另一實體進行任何目的的應用。也可以各種有用組合的形式出售或分銷組分，如以下兩種或多種物質(zhì)：

·適合用懸浮因子培養(yǎng)hes細胞的培養(yǎng)基

·培養(yǎng)基中存在或準備加入培養(yǎng)基的胞外基質(zhì)組分或增稠劑

·培養(yǎng)基中存在或準備加入培養(yǎng)基的微載體

·適應懸浮培養(yǎng)的容器

·hes細胞本身，在培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)，或以另一種形式儲存，但準備用于該培養(yǎng)系統(tǒng)

將產(chǎn)物和產(chǎn)物組合包裝到合適的容器中，任選為試劑盒形式，并可附有關于按照本發(fā)明使用材料—如維持或擴增hes細胞的書面信息。該信息可以任何語言書寫在目標使用者可獲得和理解的任何通信媒體上。它可以是容器或試劑盒上的標簽的形式，或者是與容器一起包裝和分銷的產(chǎn)品插頁。等同形式有使用者或目標使用者可獲得的硬拷貝或電子形式書寫的說明、說明書或解釋書，作為商業(yè)分銷產(chǎn)品相關的參考文獻或資源。

以下實施例為說明性，不限制本發(fā)明的權(quán)利要求范圍。

實施例

實施例1：用快速擴增培養(yǎng)基培養(yǎng)多能干細胞

獲得最初在小鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)細胞上生長的hes細胞系，然后按照美國專利6,800,480和xu等，stemcells2005；23(3):315-23所述在含有胞外基質(zhì)的無飼養(yǎng)細胞環(huán)境和條件培養(yǎng)基中擴增20代。

然后將hes細胞轉(zhuǎn)移到拜惠特克公司的x-vivo^tm10擴增培養(yǎng)基或質(zhì)量生物學公司(qualitybiologicalinc)的qbsf^tm-60上。為了用于這些實驗，x-vivo^tm10培養(yǎng)基中補充有普通物質(zhì)(goodies)：即2mml-谷胺酰胺、1％非必需氨基酸(吉布科公司(gibco))、0.1mmβ-巰基乙醇和8ng/mlbfgf。該培養(yǎng)基還補充有8ng/ml或40ng/ml的bfgf(吉布科公司)；40ng/ml的bfgf和15ng/ml的scf(r&d系統(tǒng)公司(r&dsystem))；或40ng/mlbfgf和75ng/mlflt3配體(r&d系統(tǒng)公司)。qbsf^tm-60培養(yǎng)基補充有0.1mmβ-巰基乙醇、1％非必需氨基酸(吉布科公司)和40ng/ml的bfgf。在mef條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的hes細胞用作這些實驗的對照。

首先用膠原酶iv將hes細胞傳代到包被的培養(yǎng)板上，用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)2天。第2天，用80％非條件es培養(yǎng)基加20％擴增培養(yǎng)基替代條件培養(yǎng)基。每天更換新鮮培養(yǎng)基，每周傳代一次。每2天將擴增培養(yǎng)基所占比例提高約20％，直到細胞完全適應擴增培養(yǎng)基，然后培養(yǎng)到再傳代6次為止。

圖1顯示了用以下培養(yǎng)基傳代6次(足以完全適應)結(jié)束時的hes細胞集落：(a)mef條件培養(yǎng)基+bfgf(8ng/ml)；(b)x-vivo^tm10+bfgf(40ng/ml)；(c)x-vivo^tm10+bfgf(40ng/ml)+干細胞因子(scf，青灰因子)(15ng/ml)；(d)x-vivo^tm10+bfgf(40ng/ml)+flt3配體(75ng/ml)；(e)qbsf^tm-60+bfgf(40ng/ml)。

下表顯示了在用mef條件培養(yǎng)基培養(yǎng)4代或者用x-vivo^tm10或qbsf^tm-60培養(yǎng)7代的未分化hes細胞中，平均每代擴增細胞的總倍數(shù)。

在x-vivo^tm10和qbsf^tm-60中平均每代擴增細胞的倍數(shù)大于用mef條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞。mef條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞平均每7天傳代一次，而用x-vivo^tm10和qbsf^tm-60培養(yǎng)的細胞平均每5天傳代一次。因此，非條件x-vivo^tm10或qbsf^tm-60中的擴增速率比mef條件es培養(yǎng)基中的擴增速率高～3.2-5.2倍。

圖2顯示了htert和oct3/4的基因表達概況。用高純rna分離試劑盒(highpurernaisolationkit)(羅氏診斷公司(rochediagnostics))分離細胞的rna，并用taqman^tm實驗(實時rt-pcr)進行評估。相對于對照培養(yǎng)物中的表達情況對各測試條件下的基因表達情況作圖?？紤]到儀器誤差和實驗變異性，如果測試和對照樣品之間的表達差異大于兩倍才能認為該差異有顯著性。該分析顯示，適應非條件x-vivo^tm10或qbsf^tm-60培養(yǎng)基后，htert和oct-3/4的表達略有降低(各組的前四個柱)，但當細胞回到mef條件培養(yǎng)基中時回復到標準水平(各組的后三個柱)。

為了驗證非條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞能保持其潛能，形成胚狀體，用免疫細胞化學方法分析代表三個胚層的各個表型標記物。用擴增培養(yǎng)基傳代7次后，用200u/ml膠原酶iv于37℃孵育10分鐘，從而將細胞解離成小塊，放入分化培養(yǎng)基(dmem+10％fbs)中分化培養(yǎng)4天，然后轉(zhuǎn)移到聚-l-鳥氨酸氫溴酸鹽包被的平板上孵育10天。用4％多聚甲醛固定，通透，并用免疫細胞化學方法標記。

圖3顯示結(jié)果。對用非條件x-vivo^tm10培養(yǎng)基傳代7次的hes細胞上的甲胎蛋白(代表內(nèi)胚層)、肌動蛋白(代表中胚層)和β-微管蛋白iii(代表外胚層)進行染色。

因此，可以在無飼養(yǎng)細胞的環(huán)境中用新鮮(非條件)培養(yǎng)基以適合商業(yè)生產(chǎn)的速度快速擴增hes細胞，其擴增速度比在條件培養(yǎng)基中或飼養(yǎng)細胞上的生長速率快2-5倍或更高。該細胞保持了未分化hes細胞的形態(tài)，并可分化成代表所有三個胚層的衍生細胞。

實施例2：在無動物基產(chǎn)品的確定系統(tǒng)中培養(yǎng)hes細胞

將上mef-cm中培養(yǎng)的hes細胞傳代到上補充有谷胺酰胺、非必需氨基酸和β-巰基乙醇和80ng/ml人堿性fgf的新鮮(非條件)無血清培養(yǎng)基x-vivo^tm10中進行培養(yǎng)，然后使其適應于用人層粘連蛋白包被的表面。或者，將冷藏細胞直接融化到含有80ng/mlhbfgf的相同培養(yǎng)基中。該細胞每5-6天用膠原酶iv傳代一次。

在這些條件下生長的培養(yǎng)物類似于或優(yōu)于上的培養(yǎng)物。(a)用mef條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞的形態(tài)；(b)在層粘連蛋白上確定培養(yǎng)基中的形態(tài)；(c)在mef-cm(h1p62)或確定培養(yǎng)基(h1p34+28)中表面標記物ssea-4的表達；(d)在mef-cm或確定培養(yǎng)基中表面標記物tra-1-60的表達。在層粘連蛋白上確定培養(yǎng)基的培養(yǎng)性能優(yōu)異：觀察到非常大的es細胞集落，集落代表約80％的培養(yǎng)物。標記物表達水平如下：

*3次rt-pcr測定的平均值±sd

作為未分化hes細胞的特征的其它標記物的表達也相當：經(jīng)實時pcr檢測，確定培養(yǎng)基中的htert和畸胎癌生長因子的水平與mef-cm的相比相同或大于mef-cm中的水平，而oct3/4的表達低約28％(三次實驗的平均值)。trap分析顯示，細胞保持了端粒酶活性。

收獲用完全確定的培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)p34+11(75天)的細胞，用該細胞在scid小鼠中產(chǎn)生畸胎瘤以評估潛能?；チ鲲@示出色素上皮(內(nèi)胚層)；腎組織(中胚層)；間充質(zhì)組織(中胚層)；和神經(jīng)管(外胚層)的證據(jù)。這證明該細胞保持了它們的潛能。

實施例3：懸浮培養(yǎng)hes細胞

為了提高單位培養(yǎng)體積的hes細胞產(chǎn)率，懸浮培養(yǎng)該細胞，然后評估其形態(tài)和形成代表所有三個胚層的分化細胞的能力。

從6孔板中收獲上培養(yǎng)的h9hes細胞，接種到旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶中，條件如下：

·容器：100ml旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶

·接種密度：3.6x10⁵個細胞/ml；

·培養(yǎng)基體積：每個旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶中50ml

·采用的培養(yǎng)基：含有bfgf(8ng/ml)的mef條件培養(yǎng)基

·攪拌速率：20rpm(貝爾科載體磁力攪拌器(bellcocarriermagneticstirrer))

·氣氛：37℃co2培養(yǎng)箱

·更換培養(yǎng)基：每隔一天(通過使細胞沉淀和更換上清液完成更換)

在這些條件下用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)h9hes細胞6天。

圖4(上圖)顯示結(jié)果。最初下降(在這期間建立培養(yǎng)物)后，從第2-6天起細胞數(shù)開始增加。

此時，將細胞接種回用包被的6孔板，以確定它們是否仍有未分化細胞的表型。培養(yǎng)物用含有bfgf(8ng/ml)的mef-cm培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

圖4(下圖)顯示結(jié)果。傳代1次后，細胞生長并顯示出未分化細胞的形態(tài)。

通過形成胚狀體評估細胞潛能。用膠原酶iv收獲匯合培養(yǎng)物中的細胞，并轉(zhuǎn)移到含有dmem+20％fbs的低粘附6-孔板中。eb形成并維持4天。然后，再將eb接種到聚鳥氨酸-包被的培養(yǎng)玻片(chamberslide)上。再培養(yǎng)11天后，對eb生長暈中的甲胎蛋白(內(nèi)胚層)、肌動蛋白(中胚層)和具有神經(jīng)元形態(tài)的β-微管蛋白(外胚層)進行染色。

圖5顯示結(jié)果。上面一排顯示了懸浮培養(yǎng)后在標準條件下接種回層粘連蛋白上的hes細胞分化而來的細胞。下面一排顯示了完全作為平板培養(yǎng)細胞培養(yǎng)的同一hes細胞系分化而來的細胞。如圖所示，懸浮培養(yǎng)的hes細胞完全保持了它們分化成所有三個胚層的衍生物的能力。

在另一實驗中，在以下條件下培養(yǎng)h9hes細胞：

·容器：100ml旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶

·接種密度：3.5x10⁵個細胞/ml

·培養(yǎng)基體積：每個旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶中50ml

·采用的培養(yǎng)基：mef-cm+bfgf(8ng/ml)

·攪拌速率：20rpm(同前)

·更換培養(yǎng)基：每3天更換一次

圖6顯示結(jié)果。一旦培養(yǎng)物建立后，細胞能恰當?shù)鼐S持全部12天的時間。

實施例4：長期懸浮培養(yǎng)

用另一hes細胞系完成此實驗。用搖瓶代替旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶在幾種不同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)過程持續(xù)兩個月以上。

·由6孔板收獲h1hes細胞(在上mef條件培養(yǎng)基中生長)，在以下條件下接種到搖瓶中：

·容器：100ml搖瓶

·接種密度：5.0x10⁵個細胞/ml

·培養(yǎng)基體積：每個搖瓶中15ml

·攪拌速率：80rpm(來不林尼公司(labline)轉(zhuǎn)頭/振蕩器，在37℃的co2培養(yǎng)箱中)

·更換培養(yǎng)基：最初每隔一天，隨后每2-3天更換一次

所用培養(yǎng)基和培養(yǎng)時間如下：

a：mef-cm+bfgf(8ng/ml)。維持98天。

b：mef-cm+bfgf(8ng/ml)+層粘連蛋白(開始為33μg/ml，隨后在其余培養(yǎng)過程中為～10μg/ml)。維持49天。

c：x-vivo^tm10+fgf(40ng/ml)+flt-3(75ng/ml)。維持11天。

d：x-vivo^tm10+fgf(40ng/ml)+flt-3(75ng/ml)+層粘連蛋白(開始為33μg/ml，隨后在其余培養(yǎng)過程中為～10μg/ml)。維持11天。

培養(yǎng)期間的細胞數(shù)見下表。

為了測定細胞是否保持未分化表型，將用培養(yǎng)基a培養(yǎng)4周的細胞接種回上含有bfgf的mef條件培養(yǎng)基中。

圖7顯示結(jié)果。傳代后，衍生自懸浮培養(yǎng)物的細胞顯示出生長并具有未分化hes細胞集落的特征。

這些數(shù)據(jù)表明，可懸浮培養(yǎng)hes細胞至少3個月，在培養(yǎng)物完全建立后可能擴增了3-40倍。

實施例5：采用新鮮培養(yǎng)基的懸浮培養(yǎng)物

下一個實驗評估了用于新鮮(非條件)培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)的另一種添加劑。在標準條件(來自西格馬公司(sigma)的人層粘連蛋白的基材，以2μg/cm²包被到6-孔板上；含有80ng/mlbfgf和0.5ng/mltgfβ1的x-vivo10^tm培養(yǎng)基)下由新鮮培養(yǎng)基中的表面培養(yǎng)物收獲hes細胞。將收獲的細胞傳代到100ml旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶中的懸浮培養(yǎng)物中，每個培養(yǎng)瓶中采用50ml培養(yǎng)物，起始密度為～5x10⁵個細胞/ml。評估以下培養(yǎng)基替代物：

1)x-vivo^tm10+bfgf(80ng/ml)

2)x-vivo^tm10+bfgf(80ng/ml)+tgfβ1(0.5ng/ml)

3)x-vivo^tm10+bfgf(40ng/ml)+tgfβ1(0.5ng/ml)

4)x-vivo^tm10+bfgf(80ng/ml)+tgfβ1(0.5ng/ml)+10μg/ml人層粘連蛋白

5)x-vivo^tm10+bfgf(80ng/ml)+tgfβ1(0.5ng/ml)+50μg/ml人血清白蛋白

將各旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶放在37℃co2培養(yǎng)箱中的貝爾科載體磁力攪拌器(新澤西州瓦恩蘭的貝爾科生物技術公司(bellcobiotechnology，vineland，nj))上，初始攪拌速率為20rpm。調(diào)節(jié)攪拌速率以保持細胞為懸浮狀態(tài)并提供足夠的空氣，同時要最大程度降低剪切力。每2-3天更換一次培養(yǎng)基(同前)，監(jiān)測細胞數(shù)，按需分瓶培養(yǎng)。

以固定間隔由各培養(yǎng)瓶取出細胞樣品，接種回層粘連蛋白包被的表面以評估形態(tài)。通過對eb衍生細胞進行免疫細胞化學染色，來監(jiān)測回復到表面培養(yǎng)狀態(tài)的細胞和直接從懸浮培養(yǎng)物中取出的細胞的多能性，如實施例3所述。

可在不背離本發(fā)明權(quán)利要求書和其等同范圍的情況下對上述組合物和方法進行有效修改。