間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞株b6及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞株肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞株B6及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，此細(xì)胞株采用大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞株K3注射裸鼠脛骨骨髓腔致肺轉(zhuǎn)移，將肺轉(zhuǎn)移瘤體細(xì)胞分離原代培養(yǎng)獲得的體外細(xì)胞，經(jīng)過單克隆篩選，體外擴(kuò)增后再進(jìn)行致轉(zhuǎn)移瘤，重復(fù)進(jìn)行2輪篩選獲得體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞株K3肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞株B6。并通過一系列生物學(xué)鑒定方法鑒定體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞株K3肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞株B6建立成功，相對體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞株K3，肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞株B6具有更強(qiáng)的侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖、克隆形成能力，更具有腫瘤干細(xì)胞特性。K3體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞株肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞株B6的建立為研究腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)特性及尋找治療腫瘤新途徑提供研究基礎(chǔ)，具有重要科研價值。
【專利說明】間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞株B6及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞株B6及其應(yīng)用，更具體的，本發(fā)明涉及一種大鼠骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞株K3肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞株及其應(yīng)用，屬于細(xì)胞的體外培養(yǎng)領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002]早在半個世紀(jì)前就有學(xué)者提出了腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(cancer stem cells, CSCs)，認(rèn)為腫瘤具有異質(zhì)性，不管是白血病細(xì)胞還是實(shí)體瘤細(xì)胞中都存在著含量極少的細(xì)胞亞群，這些細(xì)胞擁有誘發(fā)腫瘤生成，維持自我更新，被認(rèn)為是腫瘤起源及腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的罪魁禍?zhǔn)?。該學(xué)說認(rèn)為CSCs起源于正常的干細(xì)胞或者祖細(xì)胞的突變，它們在腫瘤細(xì)胞中，充當(dāng)著干細(xì)胞的角色，而腫瘤中其他細(xì)胞不具有成瘤能力，不能長期存活。腫瘤干細(xì)胞最早是在血液病中發(fā)現(xiàn)的，目前，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)各種實(shí)體瘤組織存在腫瘤干細(xì)胞。隨著腫瘤研究的不斷深入，CSCs將成為較理想的腫瘤治療靶細(xì)胞。
[0003]腫瘤干細(xì)胞的分離主要是根據(jù)腫瘤細(xì)胞表面各種膜蛋白、黏附分子和受體的不同，通過免疫磁珠分選法或流式分選法分離CSCs。CSCs的鑒定方法一般包括體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)兩方面。體外實(shí)驗(yàn)多在無血清培養(yǎng)基中加入EGF、LIF等細(xì)胞因子培養(yǎng)CSCs，通過集落形成實(shí)驗(yàn)、干性相關(guān)基因表達(dá)的測定及誘導(dǎo)分化等鑒定其生物學(xué)特性，比較腫瘤干細(xì)胞與非腫瘤干細(xì)胞之間的差異。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)CSCs在免疫缺陷小鼠體內(nèi)具有強(qiáng)致瘤性，僅少量細(xì)胞即可致瘤，并且移植瘤灶與原發(fā)腫瘤形態(tài)學(xué)特征相同的特征。目前，通過體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)確定腫瘤細(xì)胞具有自我更新能力、多向分化能力和強(qiáng)致瘤能力可鑒定為腫瘤干細(xì)胞。
[0004]腫瘤轉(zhuǎn)移是由腫瘤在原發(fā)部位突破基底層直接向周圍組織擴(kuò)散或者通過血道或淋巴道轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞在遠(yuǎn)端組織存活形成新腫瘤的過程。各種來源的腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)轉(zhuǎn)移在多數(shù)情況下具有器官特異性，即這些具有轉(zhuǎn)移性的腫瘤亞細(xì)胞群在一定實(shí)驗(yàn)條件下可在特定區(qū)域內(nèi)形成腫瘤轉(zhuǎn)移灶。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個多步驟細(xì)胞生物學(xué)過程的產(chǎn)物，這個過程被稱為侵襲-轉(zhuǎn)移級聯(lián)作用，包括腫瘤細(xì)胞遷移到遠(yuǎn)距離器官中，并對新環(huán)境的適應(yīng)過程。
[0005]有研究發(fā)現(xiàn)，盡管90%的腫瘤轉(zhuǎn)移細(xì)胞可以脫離原位瘤組織，并最終到達(dá)遠(yuǎn)處器官，卻只有不到2%的細(xì)胞能夠形成微轉(zhuǎn)移灶，而最后能產(chǎn)生臨床上明顯的轉(zhuǎn)移灶的腫瘤轉(zhuǎn)移細(xì)胞僅為0.02%。這充分說明了腫瘤轉(zhuǎn)移是一個極低效率的行為，能在轉(zhuǎn)移處的微環(huán)境中維持自我生長并大量增殖的很可能就是腫瘤干細(xì)胞。
[0006]本實(shí)驗(yàn)室已建立間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞株K3 (保藏編號=CGMCC N0.9158，專利申請?zhí)?201410236304.8)，采用大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞尾靜脈反復(fù)注射體內(nèi)成瘤，將瘤體細(xì)胞分離培養(yǎng)獲得的體外細(xì)胞，再經(jīng)過單克隆篩選獲得間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞株。結(jié)合目前關(guān)于腫瘤干細(xì)胞與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究，提出間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞經(jīng)體內(nèi)傳代反復(fù)轉(zhuǎn)移后篩選出的細(xì)胞，更具高度轉(zhuǎn)移潛能，致瘤能力等腫瘤干細(xì)胞特性，因此我們本次申請K3肺部轉(zhuǎn)移細(xì)胞株B6的專利保護(hù)(F4為K3的肝轉(zhuǎn)移細(xì)胞株，為B6的應(yīng)用實(shí)例做補(bǔ)充說明)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]基于此本專利建立了一種新的間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞株B6及其應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明所述的間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞株，命名為B6，保藏編號CGMCC N0.9157。
[0009]本發(fā)明間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞株的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
(1)雄性大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞株K3的培養(yǎng):在DMEM培養(yǎng)液(含 10% FBS)的培養(yǎng)瓶中，37°C，5% C02，飽和濕度培養(yǎng)。每隔兩天傳代一次；
(2)間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移瘤模型的建立:取對數(shù)期K3細(xì)胞0.25%胰蛋白酶消化，臺盼蘭染色計(jì)數(shù)，活細(xì)胞90%以上者用于實(shí)驗(yàn)。無血清培養(yǎng)液重懸成I X 17個細(xì)胞/mL，取0.1mL細(xì)胞懸液接種于雌性BALB/C裸鼠脛骨端骨髓腔內(nèi)。23-30天后，裸鼠出現(xiàn)惡病質(zhì)，呈垂死狀，解剖探測見:骨髓腔注射組見肺轉(zhuǎn)移灶。轉(zhuǎn)移灶取出IV型膠原酶消化后原代培養(yǎng)，體外擴(kuò)增后再進(jìn)行致轉(zhuǎn)移瘤，重復(fù)進(jìn)行2輪篩選，獲得K3來源的肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞株B6。
[0010]步驟2)所述骨髓腔注射，其方法如下:將裸鼠用0.05g/mL氯胺酮按0.1 mL/只腹腔麻醉后，仰臥位固定于動物板上，消毒雙側(cè)后肢待用。切開皮膚，撥開肌肉組織露出右側(cè)后肢脛骨結(jié)節(jié)，用克氏針輕輕旋轉(zhuǎn)至有落空感停止。再用ImL注射器吸取備用的細(xì)胞懸液沿穿刺孔進(jìn)入骨髓腔緩慢注入0.lmL。左后肢同法注入0.1mL細(xì)胞重懸稀釋液(無血清DMEM)，注射結(jié)束后立即用骨蠟封閉穿刺孔，縫合皮膚。手術(shù)完畢后松開裸鼠，觀察至其恢復(fù)正常呼吸后放回飼養(yǎng)籠飼養(yǎng)。
[0011]本發(fā)明間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞株的生物學(xué)特性鑒定方法，包括幾下幾個方面:
(I)石蠟切片制作及HE染色:當(dāng)裸鼠出現(xiàn)惡病質(zhì)瀕死狀時，以斷頸法處死裸鼠，解剖探查轉(zhuǎn)移情況。取原位瘤組織及轉(zhuǎn)移瘤組織放入加有抗生素的PBS中原代培養(yǎng)。其余部分放入4%多聚甲醛固定48h，石蠟包埋，切成5Mm厚切片，經(jīng)HE染色后顯微鏡觀察。
[0012](2)免疫組織化學(xué)染色分析:間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞B6腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因ABCG2的表達(dá)；
(3)細(xì)胞單克隆化實(shí)驗(yàn)得到單克隆的間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞株
B6 ；
(4)雄性的性別決定(SRY)基因擴(kuò)增鑒定肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞的來源；
(5)Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞B6的侵襲遷移能力；
(6)總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增檢測間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞B6的CXCR4和MMP2基因表達(dá)情況；
(7)總蛋白提取、Western-blot分析:提取間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞K3、K3肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞株(Κ3-Β6)和Κ3肝轉(zhuǎn)移細(xì)胞株(K3-F4)的總蛋白，Western-blot分析ABCG2 (GENE ID:312382)，CD133 (GENE ID: 60357)，CD166 (GENE ID: 79559), Bm1-1 (GENE ID: 307151)表達(dá)情況，以GAPDH (GENE ID: 24383)基因?yàn)閮?nèi)參照。
[0013](8)裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)及小動物活體成像觀察裸鼠體內(nèi)間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞B6轉(zhuǎn)移情況；
(9)軟瓊脂克隆形成觀察間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞B6是否具有腫瘤干細(xì)胞特性克隆形成特性；
(10)裸鼠皮下致瘤實(shí)驗(yàn)觀察間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞B6生長特性，為間質(zhì)干細(xì)胞突變腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移細(xì)胞研究提供依據(jù)。
[0014]本發(fā)明所述的細(xì)胞株的生物學(xué)特性鑒定方法中，肺部轉(zhuǎn)移組織石蠟切片HE染色可見腫瘤細(xì)胞，免疫組化顯示ABCG2蛋白表達(dá)增高；通過有限稀釋獲得了單克隆來源的K3-B6, PCR擴(kuò)增SRY基因(GENE I D: 25221)顯示K3-B6的SRY基因陽性，提示其來源雄性細(xì)胞；與K3細(xì)胞相比，Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)顯示K3-B6的遷移和侵襲能力更高，qRT-PCR 分析顯示 CXCR4(GENE ID: 60628)和 MMP2 (GENE ID: 81686)基因表達(dá)增強(qiáng)，Western-blot分析顯示K3-B6的CXCR4 (GENE ID: 60628)蛋白表達(dá)增加；小動物活體成像可見K3-B6的肺轉(zhuǎn)移能力更高，軟瓊脂克隆形成能力更強(qiáng)；腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因如ABCG2(GENE ID: 312382), CD133 (GENE ID: 60357), CD166(GENE ID: 79559), Bm1-1(GENE ID:307151)等蛋白表達(dá)增高，裸鼠皮下致瘤實(shí)驗(yàn)也顯示K3-B6皮下致瘤能力增強(qiáng)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞株K3肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞株B6的腫瘤來源，干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)以及侵襲、遷移、增殖、致瘤能力相較K3都有明顯提高。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為骨髓腔注射肺部轉(zhuǎn)移大體觀結(jié)果圖。
[0016]圖2為骨髓腔注射后肺部轉(zhuǎn)移灶HE染色結(jié)果圖。
[0017]圖3為瘤組織免疫組織化學(xué)(ABCG2)染色分析結(jié)果。
[0018]圖4為肝肺轉(zhuǎn)移瘤組織細(xì)胞單克隆結(jié)果及各株細(xì)胞的培養(yǎng)圖。
[0019]圖5為SRY基因擴(kuò)增電泳圖，圖中，M: DNA marker LC:空白對照早:雌性大鼠DNA古:雄性大鼠DNA。
[0020]圖6為Transwell實(shí)驗(yàn)K3-F4，K3-B6細(xì)胞體外遷移和侵襲潛力結(jié)果，圖中，A:下室的細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)圖。*代表有顯著性差異(P < 0.05，與K3細(xì)胞組相比，n=3) ;B:下室的細(xì)胞形態(tài)圖，上面Transwell遷移實(shí)驗(yàn),下面Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)(X200)。
[0021]圖7為K3，K3-F4，K3-B6細(xì)胞中CXCR4，MMP2的表達(dá)情況，圖中，A:熒光定量RT-PCR檢測K3，K3-F4，K3-B6細(xì)胞中CXCR4 mRNA的表達(dá)(*代表有顯著性差異(P < 0.05，與K3細(xì)胞組相比，n=3)) ;B:熒光定量PCR檢測K3，K3-F4, K3-B6細(xì)胞中MMP2 mRNA的表達(dá)*代表有顯著性差異(P < 0.05，與K3細(xì)胞組相比，n=3));C: Western-blot檢測K3，K3-F4，Κ3-Β6細(xì)胞中CXCR4的蛋白表達(dá)。
[0022]圖8為K3-F4，Κ3-Β6細(xì)胞裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力檢測，圖中，Α:紅色熒光蛋白標(biāo)記細(xì)胞，G418篩選后穩(wěn)定表達(dá)(以Κ3細(xì)胞為代表，X 100)；Β:動物成像系統(tǒng)觀察Κ3，K3-F4，Κ3-Β6細(xì)胞肺部轉(zhuǎn)移情況。
[0023]圖9為軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)，圖中，A: K3-F4，K3_B6細(xì)胞與Κ3細(xì)胞克隆形成率比較:每個條形柱代表三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值(土SD)，* P < 0.005 ；B:顯微鏡下克隆球形態(tài)(X40)，。
[0024]圖 10 為 Western blot 分析 ABCG2，CD133，CD166，BMI 基因在 K3，K3-F4，K3-B6 細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平。
[0025]圖11為K3，K3-F4，K3-B6細(xì)胞體內(nèi)致瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果，圖中，A: K3, K3-F4，K3-B6細(xì)胞所致皮下瘤生長曲線K3，K3-F4，K3-B6細(xì)胞所致皮下瘤組織，顯示K3-B6的體內(nèi)致瘤能力最強(qiáng)。
[0026]具體實(shí)施實(shí)例
實(shí)施例1:對本發(fā)明具體應(yīng)用一實(shí)施步驟描述如下:
(1)雄性大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞株K3的培養(yǎng):在DMEM培養(yǎng)液(含10%FBS)的培養(yǎng)瓶中，37°C，5% C02，飽和濕度培養(yǎng)。每隔兩天傳代一次；
(2)間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移瘤模型的建立:取對數(shù)期K3細(xì)胞0.25%胰蛋白酶消化，臺盼蘭染色計(jì)數(shù)，活細(xì)胞90%以上者用于實(shí)驗(yàn)。無血清培養(yǎng)液重懸成I X 17個細(xì)胞/ml，取0.1ml細(xì)胞懸液接種于雌性BALB/C裸鼠脛骨端骨髓腔內(nèi)。23-30天后，裸鼠出現(xiàn)惡病質(zhì)，呈垂死狀，解剖探測見:骨髓腔注射組見肺轉(zhuǎn)移灶。轉(zhuǎn)移灶取出IV型膠原酶消化后原代培養(yǎng)，體外擴(kuò)增后再進(jìn)行致轉(zhuǎn)移瘤，重復(fù)進(jìn)行2輪篩選，獲得K3來源的肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞株B6。
[0027]致肺轉(zhuǎn)移瘤方案如下:將裸鼠用0.05g/mL氯胺酮按0.1 mL/只腹腔麻醉后，仰臥位固定于動物板上，消毒雙側(cè)后肢待用。切開皮膚，撥開肌肉組織露出右側(cè)后肢脛骨結(jié)節(jié)，用克氏針輕輕旋轉(zhuǎn)至有落空感停止。再用ImL注射器吸取備用的細(xì)胞懸液沿穿刺孔進(jìn)入骨髓腔緩慢注入0.lmL。左后肢同法注入0.1mL細(xì)胞重懸稀釋液(無血清DMEM)，注射結(jié)束后立即用骨蠟封閉穿刺孔，縫合皮膚。手術(shù)完畢后松開裸鼠，觀察至其恢復(fù)正常呼吸后放回飼養(yǎng)籠飼養(yǎng)。
[0028]實(shí)施例2:對本發(fā)明具體應(yīng)用二實(shí)施步驟描述如下:
(1)雄性大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞K3及其肺轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞B6的培養(yǎng):在DMEM培養(yǎng)液(含10% FBS)的培養(yǎng)瓶中，37°C，5% C02，飽和濕度培養(yǎng)。每隔兩天傳代一次；
(2)間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移瘤模型的建立:取對數(shù)期K3細(xì)胞0.25%胰蛋白酶消化，臺盼蘭染色計(jì)數(shù)，活細(xì)胞90%以上者用于實(shí)驗(yàn)。用無血清培養(yǎng)液重懸成IXlO7個細(xì)胞/ml，取0.1ml細(xì)胞懸液接種于雌性BALB /C裸鼠脾臟內(nèi)。30天后，裸鼠出現(xiàn)惡病質(zhì)，呈垂死狀，解剖探測見:脾臟組見肝轉(zhuǎn)移灶，其他部位未見轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移灶取出IV型膠原酶消化后原代培養(yǎng)，體外擴(kuò)增后再進(jìn)行致轉(zhuǎn)移瘤，重復(fù)進(jìn)行2輪篩選，將肝轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞單克隆化實(shí)驗(yàn)得到單克隆的間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞株F4 ；
將得到的間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞株F4與肺轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞株B6進(jìn)行研究對比，為闡明腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供實(shí)驗(yàn)細(xì)胞材料。
[0029]( I)石蠟切片制作及HE染色:
當(dāng)裸鼠出現(xiàn)惡病質(zhì)瀕死狀時，以斷頸法處死裸鼠，解剖探查轉(zhuǎn)移情況，結(jié)果見圖1，可見局部明顯瘤組織。取原位瘤組織及轉(zhuǎn)移瘤組織放入加有抗生素的PBS中備原代培養(yǎng)。其余部分放入4%多聚甲醛固定48h，石蠟包埋，切成5Mm厚切片，經(jīng)HE染色后顯微鏡觀察，結(jié)果見圖2，右圖是左圖的局部放大圖，可見明顯瘤細(xì)胞。
[0030](2)免疫組織化學(xué)染色分析間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞B6和肝轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞F4腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因ABCG2的表達(dá):
石蠟切片脫蠟入水，加3%H202 5min,封閉內(nèi)源性過氧化物酶，TBS洗滌；水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液(PH6.0)至95°C，放入組織片加熱1min修復(fù)抗原。5%牛血清白蛋白(BSA)封閉20min，棄去BSA。加一抗ABCG2 (小鼠抗大鼠，1:50，) 37°C孵育lh，棄一抗，TBS洗滌;加生物化二抗(山羊抗小鼠)37°C孵育20min，棄去，TBS洗滌；加SABC 37 °C孵育20min，洗滌；DAB顯色，蘇木素復(fù)染。中性樹膠封固，平置涼干后鏡下觀察。結(jié)果見圖3，圖中可見轉(zhuǎn)移瘤的ABCG2表達(dá)較高，特別是肺部轉(zhuǎn)移瘤。
[0031](3)細(xì)胞單克隆化實(shí)驗(yàn)得到單克隆的間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞株B6和肝轉(zhuǎn)移細(xì)胞株F4:經(jīng)5-6次傳代瘤細(xì)胞純化，取對數(shù)期生長的原代培養(yǎng)的肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后制成單個細(xì)胞懸液，取少量細(xì)胞懸液，用臺盼藍(lán)染色并計(jì)數(shù)活細(xì)胞。將細(xì)胞懸液移至刻度離心管中連續(xù)倍數(shù)稀釋，稀釋到1000個細(xì)胞/mL，混勻后加入96孔板，使每孔細(xì)胞懸液調(diào)到0-3個細(xì)胞，再加0.1ml含10%FBS的DMEM，放入37°C，5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)，在飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。鏡下觀察記錄含一個細(xì)胞的孔，6 d后倒置顯微鏡下觀察有單細(xì)胞克隆生長，補(bǔ)充培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待長滿孔底后消化移至24孔板、6孔板，最后移至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，得到單克隆的細(xì)胞株B6 ;在轉(zhuǎn)移瘤模型制備中，有些骨髓腔注射后發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，同樣方法獲得單克隆的肝轉(zhuǎn)移細(xì)胞株F4 (F4為為B6的應(yīng)用實(shí)例做補(bǔ)充說明)。結(jié)果見圖4。
[0032](4)雄性的性別決定(SRY)基因擴(kuò)增鑒定肝轉(zhuǎn)移細(xì)胞F4和肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞B6的來源:以雌性大鼠基因組DNA為陰性對照，雄性大鼠基因組DNA為陽性對照，PCR擴(kuò)增肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞株(K3-B6)，肝轉(zhuǎn)移細(xì)胞株(K3-F4)的SRY基因(GENE ID: 25221)，結(jié)果見圖5，顯示K3，K3-F4，Κ3-Β6的SRY陽性，提示其來源雄性細(xì)胞。
[0033](5) Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞F4和肺轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞Β6的侵襲遷移能力:
Transwell侵襲實(shí)驗(yàn):基質(zhì)膠(Matrigel)放4°C過夜融化,冰上，Matrigel用無血清DMEM稀釋(1:3),稀釋好的Matrigel輕輕加入Boyden Charmber小室上層,避免氣泡產(chǎn)生，37°C放置111，細(xì)胞重懸于無血清01^1(1父105/20(^1^，每個小室上層加入200 μ L上述細(xì)胞懸液，下層小室加入500 μ L含10%FBS的DMEM，每組設(shè)三個復(fù)孔。37°C，5%C02標(biāo)準(zhǔn)濕度下培養(yǎng)6h。棉簽輕柔拭去上層小室之細(xì)胞，PBS洗，4%多聚甲醛固定30min，PBS洗；結(jié)晶紫染色15min，PBS洗。倒置顯微鏡下鏡檢，6個視野拍照。
[0034]Transwell遷移實(shí)驗(yàn):方法同transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，只是小室不鋪Matrigel。
[0035]結(jié)果見圖6，結(jié)果顯示K3-B6的體外遷移和侵襲潛力較K3明顯增強(qiáng)。
[0036](6)總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR擴(kuò)增檢測間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞B6和肝轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞F4中的CXCR4和MMP2基因表達(dá)情況:
提取間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞、肝轉(zhuǎn)移細(xì)胞株(K3-F4)、肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞株(K3-B6)的總 RNA，qRT-PCR 檢測 CXCR4 (GENE ID: 60628)和 MMP2 (GENE ID: 81686)基因表達(dá)情況，以β-actin (GENE ID: 81822)基因?yàn)閮?nèi)參照。結(jié)果見圖7，顯示K3-B6的CXCR4和MMP2基因表達(dá)增高。
[0037]表1.擴(kuò)增SRY，CXCR4, MMP2, β -actin基因組DNA的引物序列

【權(quán)利要求】
1.一種間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞株，命名為B6，保藏編號CGMCCN0.9157。
2.如權(quán)利要求1所述的一種間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞株，其特征在于，所述細(xì)胞株來源于大鼠骨髓的間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞株K3。
3.如權(quán)利要求1所述的一種間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞株，其特征在于，所述細(xì)胞株的構(gòu)建方法，包括以下步驟: (1)雄性大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞株K3的培養(yǎng):在DMEM培養(yǎng)液，含 I0%FBS的培養(yǎng)瓶中，飽和濕度培養(yǎng)；每隔兩天傳代一次； (2)間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移瘤模型的建立:取對數(shù)期K3細(xì)胞胰蛋白酶消化，臺盼蘭染色計(jì)數(shù)，活細(xì)胞90%以上者用于實(shí)驗(yàn)；無血清培養(yǎng)液重懸，取細(xì)胞懸液接種于雌性BALB/C裸鼠脛骨端骨髓腔內(nèi)；23-30天后，裸鼠出現(xiàn)惡病質(zhì)，呈垂死狀，解剖探測見:骨髓腔注射組見肺轉(zhuǎn)移灶；轉(zhuǎn)移灶取出IV型膠原酶消化后原代培養(yǎng)，體外擴(kuò)增后再進(jìn)行致轉(zhuǎn)移瘤，重復(fù)進(jìn)行2輪篩選，獲得K3來源的肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞株B6。
4.權(quán)利要求1所述間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞株B6在腫瘤轉(zhuǎn)移及在腫瘤干細(xì)胞的相關(guān)研究中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N5/09GK104164406SQ201410394011
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年8月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月12日
【發(fā)明者】錢暉, 張斌, 丁小青, 許文榮, 嚴(yán)永敏, 王梅, 朱偉, 毛飛, 張徐, 葉惠慧 申請人:江蘇大學(xué)