本發(fā)明涉及干細胞培養(yǎng)領域，具體地說，是一種裸鼴鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的原代分離培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

裸鼴鼠是一種分布于東非部分地區(qū)的挖掘類嚙齒目動物，在分類學上屬于哺乳綱、嚙齒目。裸鼴鼠終生在黑暗的地下生活，能夠適應低氧環(huán)境，并且是嚙齒類中壽命最長的動物；對癌癥具有超級免疫力。裸鼴鼠長壽、抗衰老、耐低氧、抗腫瘤等特性引起了科學家的廣泛關(guān)注，針對這些特性的研究成果已發(fā)表在nature、pnas等著名刊物上。

骨髓間充質(zhì)干細胞(bmsc)是從骨髓中分離得到的一種具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細胞。目前雖然已從多種組織中培養(yǎng)出間充質(zhì)干細胞，但因為骨髓的取材較方便，分離培養(yǎng)簡便及含量相對較高，因此骨髓成為間充質(zhì)干細胞的主要來源。bmscs不僅可以定向分化為脂肪、軟骨、骨骼肌細胞等多種細胞；還可分泌多種促進血管生成因子、凋亡因子等多種具有生物學活性的細胞因子。分離裸鼴鼠間充質(zhì)干細胞對于裸鼴鼠生物資源的推廣應用具有重要意義。由于一些體細胞不太容易分離并體外培養(yǎng)，而成體干細胞可以在特定條件向多種細胞進行轉(zhuǎn)化，因此分離裸鼴鼠間充質(zhì)干細胞可以為研究裸鼴鼠其他不易分離培養(yǎng)的體細胞的生物學特性提供有力的工具。

目前從骨髓分離獲得間充質(zhì)干細胞的方法主要有直接貼壁法、密度梯度離心法、流式細胞術(shù)和免疫磁珠分離法。流式細胞術(shù)和免疫磁珠分離法成本較高，推廣范圍有限；密度梯度離心法在分離小型動物的骨髓間充質(zhì)干細胞時獲得的細胞活性較低；直接貼壁法獲得的細胞活性較高，但是由于紅細胞影響目標細胞的貼壁，不適用于紅細胞過多的動物。裸鼴鼠體型接近小鼠，適應低氧環(huán)境，紅細胞含量較高，目前的培養(yǎng)方法不利于獲得較高活性和數(shù)量的裸鼴鼠骨髓間充質(zhì)干細胞。因此，有必要發(fā)明一種適合分離培養(yǎng)裸鼴鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于為了推廣裸鼴鼠實驗動物資源，加強裸鼴鼠體細胞的研究，提供一種裸鼴鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的原代分離培養(yǎng)方法，包括以下步驟：1)沖洗裸鼴鼠骨髓；2)骨髓沖出物過細胞篩；3)破除紅細胞；4)直接鋪板。

本發(fā)明的第一方面，提供一種裸鼴鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的原代分離培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

a、用洗滌液沖洗成年裸鼴鼠的骨髓腔，獲得骨髓沖出液；所述洗滌液的組成為：pbs溶液，加入0.005％-0.02％(w/v)dnasei；

b、將骨髓沖出液，過細胞篩，制成單細胞懸液；

c、將步驟b得到的單細胞懸液，離心棄上清，收集細胞沉淀；

d、將步驟c得到的細胞沉淀加入1-3ml紅細胞裂解液重懸，裂解紅細胞1-2min，加等體積終止液，終止裂解，離心后棄上清；所述終止液的組成為：低糖dmem培養(yǎng)基、5％-15％(v/v)fbs、0.5％-2％(v/v)ps雙抗、0.005％-0.02％(w/v)dnasei；

e、用培養(yǎng)液將步驟d處理后的細胞沉淀重新制成細胞懸液，按照2×10⁵/cm²接種于培養(yǎng)皿中；所述培養(yǎng)液的組成為：低糖dmem培養(yǎng)基、10％-20％(v/v)fbs、0.5％-2％(v/v)ps雙抗、0.005％-0.02％(w/v)dnasei；

f、在33-37℃、10-15％o2、3-5％co2的環(huán)境中培養(yǎng)48-72h，半量換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)36-48小時，全量換培養(yǎng)液，此后隔天換液，直到細胞融合達80％，進行傳代培養(yǎng)；所述培養(yǎng)液的組成為：低糖dmem培養(yǎng)基、10％-20％(v/v)fbs、0.5％-2％(v/v)ps雙抗、0.005％-0.02％(w/v)dnasei。

其中，步驟a所述骨髓沖出液可通過以下方法制備：取成年裸鼴鼠，脫頸椎法安樂死，75％乙醇浸泡，移入超凈臺。無菌條件下取其兩后肢，剝離皮膚和肌肉，分離股骨和脛骨，去掉兩端軟骨組織。1ml注射器輕輕插入骨髓腔，用洗滌液沖洗骨髓腔，獲得骨髓沖出液。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，步驟a所述洗滌液的組成為：pbs溶液，加入0.01％(w/v)dnasei。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，步驟b所述細胞篩為200目細胞篩。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，步驟c所述離心為100g離心5min棄上清，收集細胞沉淀。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，步驟d所述終止液的組成為：低糖dmem培養(yǎng)基、10％(v/v)fbs、1％(v/v)ps雙抗、0.01％(w/v)dnasei。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，步驟e和步驟f所述培養(yǎng)液的組成為：低糖dmem培養(yǎng)基、15％(v/v)fbs、1％(v/v)ps雙抗、0.01％(w/v)dnasei。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，步驟f在35℃、12％o2、5％co2的環(huán)境中培養(yǎng)72h，半量換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48小時，全量換培養(yǎng)液。

在細胞分離過程中，細胞可能受損釋放出dna，與細胞外基質(zhì)形成dna蛋白復合物，聚集細胞成團。因此，本發(fā)明在細胞分離全程各種溶液都加入了dnasei，防止細胞聚團。

本發(fā)明優(yōu)點在于：

1、本發(fā)明的裸鼴鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)方法是首次建立的裸鼴鼠干細胞分離培養(yǎng)方法。貼壁法獲得的細胞能分泌生長因子和促貼壁物質(zhì)，可促進間充質(zhì)干細胞貼壁生長。紅細胞在一定程度上會干擾干細胞貼壁，因此去除紅細胞可以提高間充質(zhì)干細胞的純度，增加干細胞貼壁的機會。隨著傳代次數(shù)的增多，間充質(zhì)干細胞得以更加純化。本發(fā)明利用紅細胞裂解液破除紅細胞而后將細胞直接貼壁，獲取間充質(zhì)干細胞。此方法獲得的干細胞，損失低，純度高，細胞形態(tài)均一，細胞增殖能力強，可用于體外大量擴增培養(yǎng)。

2、本發(fā)明建立了一種裸鼴鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的原代分離培養(yǎng)方法，并對該方法培養(yǎng)的細胞進行了生物學特性的鑒定，證實該培養(yǎng)方法能夠獲得純度很高、活性很好、有分化能力的裸鼴鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，從而為進一步深入研究裸鼴鼠干細胞特性以及探討裸鼴鼠不易分離但可以由干細胞轉(zhuǎn)化的體細胞的特征提供了可能性。

附圖說明

圖1為倒置顯微鏡觀察原代培養(yǎng)的裸鼴鼠骨髓間充質(zhì)干細胞圖(5×)；

圖2為倒置顯微鏡觀察傳代培養(yǎng)的裸鼴鼠骨髓間充質(zhì)干細胞圖(5×)；

圖3為免疫熒光染色法在熒光顯微鏡下鑒定裸鼴鼠骨髓間充質(zhì)干細胞圖；

圖4為流式鑒定裸鼴鼠骨髓間充質(zhì)干細胞圖；

圖5為倒置顯微鏡觀察成骨誘導的裸鼴鼠骨髓間充質(zhì)干細胞圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的具體實施方式作詳細說明。

以下實施例所使用的主要材料及來源分別如下：

裸鼴鼠(第二軍醫(yī)大學實驗動物中心)；

dmem低糖培養(yǎng)基(gibco)；fbs(gibco)；dnasei(solarbio)；雙抗(gibco)；紅細胞裂解液(生工)；細胞核染料dapi(sigma)；cd73抗體(proteintech)，熒光二抗(jackson)；谷氨酰胺、茜素紅染液、β-磷酸甘油、地塞米松、抗壞血酸(cyagen)；流式抗體apc-cd45、fitc-cd90(biolegend)；

洗滌液(pbs、0.01％(w/v)dnasei)

終止液(低糖dmem培養(yǎng)基、10％(v/v)fbs、1％(v/v)ps雙抗、0.01％(w/v)dnasei)

培養(yǎng)液(低糖dmem培養(yǎng)基、15％(v/v)fbs、1％(v/v)ps雙抗、0.01％(w/v)dnasei)

以下結(jié)合附圖和具體實施例來詳細說明本發(fā)明。

實施例1裸鼴鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)方法

(1)取一只成年裸鼴鼠，脫頸椎法安樂死，75％乙醇浸泡，移入超凈臺。無菌條件下取其兩后肢，剝離皮膚和肌肉，分離股骨和脛骨，去掉兩端軟骨組織。1ml注射器輕輕插入骨髓腔，用洗滌液沖洗骨髓腔，獲得骨髓沖出液。

(2)將骨髓沖出液，過200目細胞篩，制成單細胞懸液；

(3)將上述細胞懸液，100g離心5min棄上清，收集細胞沉淀；

(4)將細胞沉淀加入2ml紅細胞裂解液重懸，裂解紅細胞1-2min，加等體積終止液，終止裂解，離心后棄上清；

(5)用培養(yǎng)液將細胞沉淀重新制成細胞懸液，按照2×10⁵/cm²接種于培養(yǎng)皿中；

(6)在35℃、12％o2、5％co2的環(huán)境中培養(yǎng)72h，半量換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48小時，全量換培養(yǎng)液，此后隔天換液，直到細胞融合達80％，進行傳代培養(yǎng)。

倒置顯微鏡觀察原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)的裸鼴鼠骨髓間充質(zhì)干細胞見圖1和圖2。

實施例2實施例1的裸鼴鼠骨髓間充質(zhì)干細胞鑒定及純度與活力評估

1、細胞免疫熒光鑒定

將細胞接種蓋玻片，待骨髓間充質(zhì)干細胞爬片達理想密度，4％(w/v)多聚甲醛固定樣本10min；pbs洗5min，0.1％(v/v)tritonx-100處理10min，增加細胞膜的通透性；山羊血清封閉1h；孵育一抗(cd73用含0.1％(v/v)tritonx-100的pbs1：1000稀釋)稀釋，4℃過夜；另外用pbs代替一抗作陰性對照；pbs洗3遍，每次10min，孵育二抗(goatanti-rabbitigg(h+l))(用含0.1％tritonx-100的pbs1：200稀釋)4℃過夜或37℃避光1h；加入dapi(4，6-二脒基-2-苯基吲哚)室溫3min-5min染核pbs洗3次，10min/次。抗淬滅劑封片。-20℃避光保存，直到熒光顯微鏡觀察成像。

免疫熒光細胞化學染色可見裸鼴鼠骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)熒光二抗顯色后，呈紅色顆粒狀分布于胞漿中，細胞核被dapi染成藍色細胞表面標志物cd73為陽性，符合骨髓間充質(zhì)干細胞表面標志特征(圖3)。

2、裸鼴鼠骨髓間充干細胞純度評估

將分離培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞，棄上清；pbs洗滌后，用胰酶消化細胞，l-dmem終止消化，離心棄上清；pbs洗滌后，室溫避光同時孵育apc-cd45和fitc-cd90，30min后，pbs洗滌，并重懸細胞，上機進行流式細胞術(shù)檢測。

將第2代骨髓間充質(zhì)干細胞，利用流式細胞儀檢測細胞表面標志物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)cd90為98.36％，呈陽性高表達；而cd45為0.74％，呈陰性表達。符合骨髓間充質(zhì)干細胞表面標志特征，且純度很高(圖4)。

3、裸鼴鼠骨髓間充質(zhì)干細胞活力評估

臺盼藍染色評估細胞的活力：取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞密度為10⁴/ml.接種于96孔培養(yǎng)板，每孔180μl，培養(yǎng)24h后加0.4％(w/v)臺盼藍，每孔20μl。用細胞全自動計數(shù)儀計數(shù)，拒染的為活細胞，計算活細胞的百分比，以判斷細胞存活狀況。

4、分離培養(yǎng)的裸鼴鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨誘導

將傳第二代的裸鼴鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，接種到六孔板，每孔1×10⁵，24h后加入誘導培養(yǎng)基。成骨誘導培養(yǎng)基成分為低糖dmem培養(yǎng)基，含10％(v/v)胎牛血清、10mmol/lβ-磷酸甘油、100nmol/l地塞米松和0.2mmol/l抗壞血酸。每周換液2次。誘導結(jié)束后，吸走成骨誘導分化培養(yǎng)基，用pbs沖洗1-2次。每孔加入2ml4％(w/v)中性甲醛溶液，固定30min。吸走中性甲醛溶液，用pbs沖洗2次。每孔中加入1ml茜素紅染液染3-5min。吸走茜素紅染液，用pbs沖洗2-3次。將培養(yǎng)板置于顯微鏡下觀察成骨染色效果。

由圖5可以看出，本實施例分離培養(yǎng)的裸鼴鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，在成骨分化誘導實驗中，呈現(xiàn)良好的分化能力。在成骨誘導實驗中，成骨誘導培養(yǎng)1天，細胞體積增大，呈短梭形；誘導第3天，細胞呈多角形，胞質(zhì)內(nèi)細胞顆粒增多；第5天，胞質(zhì)內(nèi)充滿顆粒，細胞呈集落樣生長，細胞間鈣質(zhì)沉積；第7天，細胞結(jié)節(jié)中心的細胞逐漸融合失去細胞結(jié)構(gòu)，鈣結(jié)節(jié)形成明顯，經(jīng)茜素紅染色呈紅色結(jié)節(jié)。骨髓間充質(zhì)干細胞在茜紅染色后出現(xiàn)明顯的骨質(zhì)結(jié)構(gòu)；這說明了本發(fā)明所獲取的骨髓間充質(zhì)干細胞維持著良好的干性。

以上已對本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實施例進行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實施例，熟悉本領域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可做出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。