本發(fā)明涉及一種精子洗滌液及其制備方法，屬于人類輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
精子洗滌技術(shù)是輔助生殖技術(shù)中經(jīng)常使用的一項，主要目的是為了將精液中不利于受精的因素排除掉，從而提高試管嬰兒的成功率。
該項技術(shù)主要根據(jù)精液不液化、抗體分布程度或因精子其他的原因而導(dǎo)致的不孕不育癥，對其進行輔助治療。其操作步驟是：首先，將取得的精子盡快用洗滌液稀釋，去除盡可能多的不利成分，包括精漿、死掉的精子、炎癥細胞、精子抗體和細菌、支原體等；然后，將稀釋的精液以1000-2000轉(zhuǎn)每分鐘的速度離心10分鐘，使精子沉淀于試管底部，移去上清液，剩余0.5-1ml；最后，加入精子洗滌液將精子濃度調(diào)至一定比例，即可作授精之用。
然而，現(xiàn)有技術(shù)中臨床常規(guī)使用的精子洗滌液僅為以hepes或者mops為緩沖的鹽溶液，不能有效地改善精子的活力，尤其對冷凍的精子無法提高人工授精(iui)的成功率。
肝素鈉是粘多糖硫酸酯類抗凝血藥，為白色或類白色的粉末，有引濕性，在水中易溶。其功能包括：1、治療各種疾病并發(fā)的播散性血管內(nèi)凝血早期；2、預(yù)防動、靜脈血栓和肺栓塞；3、治療動、靜脈血栓和肺栓塞，缺血性腦卒中，不穩(wěn)定型心絞痛(減輕癥狀、預(yù)防心肌梗塞)，急性心肌梗塞(防止早期再梗塞和梗塞區(qū)延展，降低病死率)；4、人工心肺、腹膜透析或血液透析時作為抗凝血藥物；5、作為溶血栓療法的維持治療；6、用于輸血時預(yù)防血液凝固及血庫保存鮮血等體外抗凝劑。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于，提供一種各項質(zhì)控指標達標的精子洗滌液，不僅可以有效地改善精子的活力，提高人工授精(iui)的成功率，而且也為輔助生殖技術(shù)的安全性提供了有力保證。
為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
一種精子洗滌液，其特征在于：將肝素鈉干粉或者肝素鈉鹽溶液溶解于含有抗菌素、指示劑的鹽溶液中配制而成。
優(yōu)選的：將肝素鈉干粉或者肝素鈉鹽溶液按照10-50usp/ml的濃度溶解于含有抗菌素、指示劑的鹽溶液中配制而成。
優(yōu)選的：所述抗菌素為慶大霉素，濃度為5-11μg/ml。
優(yōu)選的：所述指示劑為酚紅，濃度9-10μg/ml。
優(yōu)選的：所述鹽溶液是以hepes或者mops為緩沖劑，以鈉、鉀、鎂、鈣離子為基礎(chǔ)，并以葡萄糖、丙酮酸鈉、乳酸鈉、白蛋白為能量物質(zhì)的化合物培養(yǎng)溶液；其中包含：氯化鈉98.11-102.00mmol/l、氯化鉀4.55-4.70mmol/l、硫酸鎂0.18-0.22mmol/l、氯化鈣1.92-2.12mmol/l、碳酸氫鈉3.90-4.10mmol/l、hepes或者mops19.99-22.00mmol/l、葡萄糖2.68-2.88mmol/l、丙酮酸鈉0.31-0.33mmol/l、乳酸鈉21.11-21.66mmol/l、磷酸二氫鉀0.36-0.39mmol/l；
所述白蛋白為重組人血清白蛋白，是采用醫(yī)療級的重組人血清白蛋白干粉溶解于在鹽水溶液中制備而成，終濃度為5mg/ml。
所述精子洗滌液的制備方法，包括以下步驟：
1、稱量好各種組分，備用；
2、配制鹽溶液：稱量好的組分中，先將除了抗菌素、指示劑、碳酸氫鈉以外的各組分溶于超純注射級用水中，溶解過程中遵循先固體后液體的原則；所述超純注射級用水經(jīng)0.1-0.3μm濾膜過濾，內(nèi)毒素＜0.5eu/ml；然后，依次加入稱量好的抗菌素、指示劑、碳酸氫鈉，制得鹽溶液；
3、檢測步驟2所得鹽溶液的滲透壓和ph值，并記錄最終滲透壓和ph值；所述滲透壓保持為250-275mosm/kg，所述ph值保持為7.0-7.4；
4、按照預(yù)配置的容量，將終濃度為5mg/ml的重組人血清白蛋白補充到鹽溶液中；
5、將肝素鈉干粉或者肝素鈉鹽溶液按照10-50usp/ml的濃度溶解于步驟4制得的鹽溶液中，到充分溶解止；
6、將步驟5所得溶液經(jīng)過0.2μm濾膜過濾滅菌后，取樣測試；測試參數(shù)：
a、30-37℃條件下ph值：7.1-7.4；
b、滲透壓：270-290mosm/kg；
c、內(nèi)毒素：＜1.0eu/ml；
d、一細胞鼠胚培養(yǎng)到96小時：≥80％的囊胚形成率；
7、將配置好的溶液在百級gmp車間進行無菌分裝和標簽。
有益效果：本發(fā)明所述的精子洗滌液中添加了肝素鈉，而肝素可以通過結(jié)合精子表面的受體激活受體偶聯(lián)的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，溫和有效地提升精子線粒體的產(chǎn)能功能和鈣離子內(nèi)流，進而改善精子的活力，不僅可以提高人工授精(iui)的成功率，而且，也為輔助生殖技術(shù)的安全性提供了有力保證。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施實施方式對本發(fā)明做進一步說明。
本發(fā)明所述的精子洗滌液，是將肝素鈉干粉或者肝素鈉鹽溶液按照功能可行的濃度(優(yōu)選濃度為10-50usp/ml)溶解于含有抗菌素、指示劑的鹽溶液中配制而成。所述抗菌素為慶大霉素，濃度為5-11μg/ml。所述指示劑為酚紅，濃度9-10μg/ml。
所述鹽溶液是以hepes或者mops為緩沖劑，以鈉、鉀、鎂、鈣離子為基礎(chǔ)，并以葡萄糖、丙酮酸鈉、乳酸鈉、白蛋白為能量物質(zhì)的化合物培養(yǎng)溶液；其中包含：氯化鈉98.11-102.00mmol/l、氯化鉀4.55-4.70mmol/l、硫酸鎂0.18-0.22mmol/l、氯化鈣1.92-2.12mmol/l、碳酸氫鈉3.90-4.10mmol/l、hepes或者mops19.99-22.00mmol/l、葡萄糖2.68-2.88mmol/l、丙酮酸鈉0.31-0.33mmol/l、乳酸鈉21.11-21.66mmol/l、磷酸二氫鉀0.36-0.39mmol/l；
所述白蛋白為重組人血清白蛋白，是采用醫(yī)療級的重組人血清白蛋白干粉溶解于在鹽水溶液中制備而成，終濃度為5mg/ml。
所述精子洗滌液的制備方法，包括以下步驟：
1、稱量好各種組分，備用；
2、配制鹽溶液：稱量好的組分中，先將除了抗菌素、指示劑、碳酸氫鈉以外的各組分溶于超純注射級用水中，溶解過程中遵循先固體后液體的原則；所述超純注射級用水經(jīng)0.1-0.3μm濾膜過濾，內(nèi)毒素＜0.5eu/ml；然后，依次加入稱量好的抗菌素、指示劑、碳酸氫鈉，制得鹽溶液；
3、檢測步驟2所得鹽溶液的滲透壓和ph值，并記錄最終滲透壓和ph值；所述滲透壓保持為250-275mosm/kg，所述ph值保持為7.0-7.4；
4、按照預(yù)配置的容量，將終濃度為5mg/ml的重組人血清白蛋白補充到鹽溶液中；
5、將肝素鈉干粉或者肝素鈉鹽溶液按照10-50usp/ml的濃度溶解于步驟4制得的鹽溶液中，到充分溶解止；
6、將步驟5所得溶液經(jīng)過0.2μm濾膜過濾滅菌后，取樣測試；測試參數(shù)：
a、30-37℃條件下ph值：7.1-7.4；
b、滲透壓：270-290mosm/kg；
c、內(nèi)毒素：＜1.0eu/ml；
d、一細胞鼠胚培養(yǎng)到96小時：≥80％的囊胚形成率；
7、將配置好的溶液在百級gmp車間進行無菌分裝和標簽。
【存儲說明和穩(wěn)定性】
存儲：將分裝好的精子洗滌液存放于2℃-8℃，使用前，溫?zé)嶂僚囵B(yǎng)箱(37℃)溫度。應(yīng)盡可能減少液體暴露于co2和空氣，以避免7.0或更低的ph水平。不要暴露在高于39℃的溫度下。
穩(wěn)定性：可以直到標簽上顯示的到期日期。使用無菌程序除去所需體積的產(chǎn)品，一旦移除，不要將任何量的產(chǎn)品返回原始容器；如果產(chǎn)品變色、渾濁或有微生物污染跡象，請勿使用。
為避免污染問題，使用無菌技術(shù)進行處理，并在完成操作后丟棄瓶子或小瓶中剩余的任何多余產(chǎn)品。
【具體使用方法】
一、使用上游法
1、用一支無菌無毒的移液管，吸取1ml精液到已標記了患者身份的試管中；
2、用2.0ml精子洗滌液覆蓋精液，將試管置于+37℃，無二氧化碳培養(yǎng)箱中(或者加熱至+37℃)，恒溫培養(yǎng)30-60分鐘；
3、吸取上層液體并轉(zhuǎn)移到一支干凈試管中，再加入5.0ml精子洗滌液，混勻并在≤1000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心10分鐘；
4、棄去上清液，向沉淀中加入5.0ml的精子洗滌液(宮內(nèi)人工授精)或者平衡授精液(體外授精)使其重懸，然后后再離心1次；
5、棄去上清液，向沉淀中加入0.5-1.0ml的精子洗滌液(宮內(nèi)人工授精)或者平衡授精液(體外授精)制成懸浮液待用。
二、使用梯度分離法
1、精子洗滌液與精子梯度液混合分別獲得90％和45％的梯度分離液(或者僅制備90％的梯度分離液)；
2、用無菌無毒的吸管移取1.5ml90％的梯度分離液到圓錐形的離心管中，再移取1.5ml45％的梯度分離液慢慢置于其上層(或者只有90％梯度分離液層)；
3、將精液慢慢地置于液面頂層，1500-2000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心20分鐘；棄去殘余精液和兩層上清液，注意不要讓殘余精液遺留在試管壁上；
4、向精子沉淀物中加入盡可能少的90％梯度分離液，再將其轉(zhuǎn)移至盛有5ml精子洗滌液的圓錐形無菌試管中；1500-2000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心10分鐘；
5、棄去上清液，用精子洗滌液再洗一次；
6、第二次清洗后，向沉淀中加入0.5-1.0ml的精子洗滌液(宮內(nèi)人工授精)或者平衡授精液(體外授精)制成懸浮液待用。