本發(fā)明屬于胚胎工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地，涉及一種提高體外培養(yǎng)豬卵母細(xì)胞發(fā)育潛力的培養(yǎng)液及其培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
：哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)（invitromaturation，ivm）是胚胎工程的重要組成部分，指將卵泡內(nèi)取出的未成熟卵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外成熟培養(yǎng)，發(fā)育至減數(shù)第二次分裂中期，可以進(jìn)行體外受精并分裂成胚胎的技術(shù)。豬作為一種常用模式生物，對(duì)其卵母細(xì)胞體外成熟的研究始于20世紀(jì)80年代末，經(jīng)過(guò)多年來(lái)的發(fā)展，雖已取得了較大的進(jìn)展，但是體外成熟的豬卵母細(xì)胞，其成熟質(zhì)量和發(fā)育潛力與體內(nèi)相比仍有較大差距。因此，開(kāi)發(fā)提高卵母細(xì)胞發(fā)育潛力的培養(yǎng)液，完善體外成熟培養(yǎng)體系，仍需要我們的繼續(xù)努力。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)中豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)成熟質(zhì)量與發(fā)育潛力差的缺陷和不足，提供一種豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液及培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)液可有效地提高體外培養(yǎng)的豬卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力，且制備簡(jiǎn)單，培養(yǎng)方法簡(jiǎn)便易行，具有較大的應(yīng)用前景。本發(fā)明的目的是提供一種豬卵母細(xì)胞體外成熟促進(jìn)劑。本發(fā)明另一目的是提供添加有上述促進(jìn)劑的豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液。本發(fā)明的再一目的是提供利用上述培養(yǎng)液提高豬卵母細(xì)胞體外成熟質(zhì)量與發(fā)育潛力的培養(yǎng)方法。本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案給予實(shí)現(xiàn)的：一種豬卵母細(xì)胞體外成熟促進(jìn)劑，所述促進(jìn)劑由3～7μmol/l毛喉素與3～7μmol/lroscovitine組成。本發(fā)明的毛喉素（forskolin）是一種腺苷酸環(huán)化酶激活劑，通過(guò)刺激腺苷酸環(huán)化酶生成大量camp，camp延遲卵母細(xì)胞核成熟，使卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)得到充分生長(zhǎng)，最后達(dá)到提高卵母細(xì)胞發(fā)育潛力的效果，臨床多用于抑制腫瘤生長(zhǎng)，同時(shí)也在輔助生殖領(lǐng)域得到廣泛重視。roscovitine是一種腺嘌呤衍生物，作用于細(xì)胞周期蛋白激酶時(shí)具有高效性和特異性，可以選擇性抑制cdc2、cdk2和cdk5等細(xì)胞周期依賴(lài)性激酶活性，可以有效抑制豬、牛、馬和山羊等物種卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，豬卵母細(xì)胞體外成熟存在的一個(gè)最大問(wèn)題就是核質(zhì)成熟的不統(tǒng)一，本發(fā)明選用的兩種藥品forskolin和roscovitine，皆有抑制核成熟的效果，單一高濃度添加雖會(huì)對(duì)核成熟有一定的延遲效應(yīng)，但同時(shí)也會(huì)給卵母細(xì)胞造成不可知的影響。本發(fā)明通過(guò)將毛喉素與曲古抑菌素a分別進(jìn)行各單一藥品、組合藥品的多種濃度及添加培養(yǎng)時(shí)間嘗試后，發(fā)現(xiàn)forskolin和roscovitine組合用藥在一定的濃度及添加時(shí)間下具有顯著的協(xié)同增效，可有效提高卵母細(xì)胞的體外發(fā)育潛力，大大提升胚胎得率，避免了單一用藥帶來(lái)的缺陷。本發(fā)明的豬卵母細(xì)胞體外成熟促進(jìn)劑可提高豬卵母細(xì)胞體外成熟質(zhì)量與發(fā)育潛力，因此，所述促進(jìn)劑可被添加到豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中。一種豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液，其特征在于，所述培養(yǎng)液包括以下組分：毛喉素3～7μmol/l，roscovitine3～7μmol/l，tcm-1998～12g/l，nahco31～4g/l，d-葡萄糖0.4～0.7g/l，丙酮酸鈉0.05～0.15g/l，青霉素鈉鹽0.05～0.1g/l，鏈霉素硫酸鹽0.03～0.07g/l，聚乙烯醇1～4g/l，促黃體素0.3～0.7μg/ml，促卵泡素0.3～0.7μg/ml，表皮生長(zhǎng)因子8～12ng/ml，l-半胱氨酸0.3～0.7mmol/l，卵泡液8～12%優(yōu)選地，所述培養(yǎng)液包括以下組分：毛喉素4～6μmol/l，roscovitine4～6μmol/l，tcm-1999～11g/l，nahco32～3g/l，d-葡萄糖0.5～0.6g/l，丙酮酸鈉0.08～0.12g/l，青霉素鈉鹽0.06～0.09g/l，鏈霉素硫酸鹽0.04～0.06g/l，聚乙烯醇1～3g/l，促黃體素0.4～0.6μg/ml，促卵泡素0.4～0.6μg/ml，表皮生長(zhǎng)因子9～11ng/ml，l-半胱氨酸0.4～0.6mmol/l，卵泡液9～11%。再優(yōu)選地，所述培養(yǎng)液包括以下組分：毛喉素5μmol/l，roscovitine5μmol/l，tcm-1999.87g/l，nahco32.2g/l，d-葡萄糖0.5496g/l，丙酮酸鈉0.1g/l，青霉素鈉鹽0.075g/l，鏈霉素硫酸鹽0.05g/l，聚乙烯醇1g/l，促黃體素0.5μg/ml，促卵泡素0.5μg/ml，表皮生長(zhǎng)因子10ng/ml，l-半胱氨酸0.57mmol/l，卵泡液10%。上述豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液在提高豬卵母細(xì)胞體外成熟質(zhì)量與發(fā)育潛力中的應(yīng)用亦在本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)。一種提高豬卵母細(xì)胞體外成熟質(zhì)量與發(fā)育潛力的方法，將上述任一培養(yǎng)液作為培養(yǎng)液a，將豬卵母細(xì)胞在培養(yǎng)液a中培養(yǎng)22～24h后轉(zhuǎn)入到培養(yǎng)液b中繼續(xù)培養(yǎng)22～24h；所述培養(yǎng)液b括以下組分：tcm-1998～12g/l，nahco31～4g/l，d-葡萄糖0.4～0.7g/l，丙酮酸鈉0.05～0.15g/l，青霉素鈉鹽0.05～0.1g/l，鏈霉素硫酸鹽0.03～0.07g/l，聚乙烯醇1～4g/l，表皮生長(zhǎng)因子9～11ng/ml，卵泡液9～11%。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)液a或/和培養(yǎng)液b配制好后需置于co2培養(yǎng)箱平衡過(guò)夜。優(yōu)選地，所述co2培養(yǎng)箱中的條件為38.6°c，5%co2，相對(duì)濕度100%。上述培養(yǎng)方法可有效提高體外培養(yǎng)的豬卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力，而體外培養(yǎng)的豬卵母細(xì)胞是豬克隆胚胎的重要原材料，因此上述培養(yǎng)方法在豬克隆胚胎培養(yǎng)中的應(yīng)用也在本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：（1）本發(fā)明提供了一種豬卵母細(xì)胞體外成熟促進(jìn)劑。（2）本發(fā)明提供了一種可提高豬卵母細(xì)胞體外成熟質(zhì)量與發(fā)育潛力的培養(yǎng)液。（3）本發(fā)明提供了一種可提高豬卵母細(xì)胞體外成熟質(zhì)量與發(fā)育潛力的培養(yǎng)方法。（4）本發(fā)明的促進(jìn)劑、培養(yǎng)液以及培養(yǎng)方法可提高豬卵母細(xì)胞的卵裂率、囊胚數(shù)及囊胚細(xì)胞數(shù)，有效地提高體外培養(yǎng)的豬卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力，且制備簡(jiǎn)單，操作方便，具有較大的應(yīng)用前景。具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本
技術(shù)領(lǐng)域：
常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。除非特別說(shuō)明，以下實(shí)施例所用試劑和材料均為市購(gòu)。實(shí)施例1豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)1、配制溶液及培養(yǎng)液（1）毛喉素（forskolin）：用2.44mldmso溶解1mgforskolin，得終濃度為1mm的儲(chǔ)備液，置于-20℃保存；再用ddh2o稀釋為10μm的工作液，4℃保存?zhèn)溆?。?）核抑制劑roscovitine：用2.83mldmso溶解1mgroscovitin，得終濃度為1mm的儲(chǔ)備液，置于-20℃保存；再用ddh2o稀釋為10μm的工作液，4℃保存?zhèn)溆?。?）0～22h培養(yǎng)液：取9.87gtcm-199，2.2gnahco3，0.5496gd-葡萄糖，0.1g丙酮酸鈉，0.075g青霉素鈉鹽，0.05g鏈霉素硫酸鹽，1g聚乙烯醇溶于1lddh2o中，充分混勻后，加入0.5μg/mllh，0.5μg/mlfsh，10ng/mlegf，0.57mml-半胱氨酸，10%pff；再充分混勻，抽濾除菌，置于co2培養(yǎng)箱平衡過(guò)夜。（4）22～44h培養(yǎng)液：取9.87gtcm-199，2.2gnahco3，0.5496gd-葡萄糖，0.1g丙酮酸鈉，0.075g青霉素鈉鹽，0.05g鏈霉素硫酸鹽，1g聚乙烯醇，溶于1lddh2o中，充分混勻后，加入10ng/mlegf和10%pff，抽濾除菌，置于co2培養(yǎng)箱平衡。（5）卵母細(xì)胞操作液：將9.5gtcm-199，0.05gnahco3，1.755gnacl，3.0gbsa，0.75ghepes，0.06g鏈霉素，0.05g青霉素溶于1lddh2o中，充分混勻后，測(cè)量ph，抽濾除菌，分裝，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。?）融合液：取0.0203gmgcl2-6h2o，0.147gcacl2-2h2o，54.66g甘露醇，0.119ghepes溶于1lddh2o中，抽濾除菌，分裝，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。?）胚胎培養(yǎng)液：取6.312gnacl，0.746gkcl，0.048gkh2po4，0.098gmgso4-7h2o，2.106gnahco3，3.0gbsa，0.1460gl-谷氨酰胺，0.546g亞牛磺酸，0.05g慶大霉素，0.022g丙酮酸鈉，20ml必需氨基酸，10ml非必需氨基酸依次加入ddh2o中，待藥物完全溶解后，測(cè)量ph，抽濾除菌，分裝，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?、豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)（1）單獨(dú)添加forskolin：將毛喉素（forskolin）添加至0～22h培養(yǎng)液中，使其終濃度為5μm；將豬卵母細(xì)胞在上述添加有forskolin的0～22h培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h后，轉(zhuǎn)入到22～44h培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)24h，進(jìn)行后續(xù)孤雌激活實(shí)驗(yàn)。（2）單獨(dú)添加roscovitine：將核抑制劑roscovitine添加至0～22h培養(yǎng)液中，使其終濃度為5μm；將豬卵母細(xì)胞在上述添加有roscovitine的0～22h培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h后，轉(zhuǎn)入到22～44h培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)24h，進(jìn)行后續(xù)孤雌激活實(shí)驗(yàn)。（3）同時(shí)添加forskolin+roscovitine：將毛喉素（forskolin）和核抑制劑roscovitine分別添加至0～22h培養(yǎng)液中，使forskolin與roscovitine終濃度均為5μm；將豬卵母細(xì)胞在上述添加有forskolin和roscovitine的0～22h培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h后，轉(zhuǎn)入到22～44h培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)24h，進(jìn)行后續(xù)孤雌激活實(shí)驗(yàn)。（4）陽(yáng)性對(duì)照組：將豬卵母細(xì)胞培養(yǎng)在含有100nm左右dmso的0～22h培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h后，轉(zhuǎn)入到無(wú)dmso的22～44h培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)24h，進(jìn)行后續(xù)孤雌激活實(shí)驗(yàn)。（5）陰性對(duì)照組：將豬卵母細(xì)胞培養(yǎng)在正常0～22h培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h后，轉(zhuǎn)入到正常的22～44h培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)24h，進(jìn)行后續(xù)孤雌激活實(shí)驗(yàn)。3、結(jié)果結(jié)果如表1所示，通過(guò)考察豬卵母細(xì)胞的形態(tài)正常率、卵裂率以及囊胚率發(fā)現(xiàn)，豬卵母細(xì)胞在只單獨(dú)添加forskolin的培養(yǎng)液中培養(yǎng)后的發(fā)育潛力反而不如對(duì)照組，且差異顯著；豬卵母細(xì)胞在只單獨(dú)添加roscovitine的培養(yǎng)液中培養(yǎng)后的發(fā)育潛力與對(duì)照組無(wú)顯著差異；豬卵母細(xì)胞在添加5μmforskolin和5μmroscovitine的培養(yǎng)液中培養(yǎng)后的細(xì)胞形態(tài)正常率與對(duì)照組無(wú)顯著差異，但卵裂率和囊胚率與對(duì)照組差異顯著，尤其是囊胚率較對(duì)照組大大提高。表1forskolin處理后豬卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力（孤雌激活）組別卵母細(xì)胞數(shù)形態(tài)正常率（%）卵裂率（%）囊胚率（%）實(shí)驗(yàn)組forskolin38085.4(324/390)66.2(214/324)a17.5(37/214)a實(shí)驗(yàn)組roscovitine29083.4(242/290)44.6(108/242)a18.5(20/108)a促進(jìn)劑組forskolin+roscovitine31886.5(275/318)84.4(232/275)59.9(138/232)a陽(yáng)性對(duì)照組32091.9(294/320)79.6(234/294)26.1(61/234)b陰性對(duì)照組30089.3(268/300)78.7(211/268)27.5(58/211)b注：同列字母不同表示差異有顯著性(p＜0.05)，無(wú)字母表示無(wú)顯著性差異(p＞0.05)。實(shí)施例2豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)1、配制溶液及培養(yǎng)液與實(shí)施例1相同。2、豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)（1）將毛喉素（forskolin）和核抑制劑roscovitine分別添加至0～22h培養(yǎng)液中，使forskolin終濃度為3μm，roscovitine終濃度為7μm；將豬卵母細(xì)胞在上述添加有forskolin和roscovitine的0～22h培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h后，轉(zhuǎn)入到22～44h培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)24h，進(jìn)行后續(xù)孤雌激活實(shí)驗(yàn)。（2）設(shè)置對(duì)照組，與實(shí)施例1相同。3、結(jié)果結(jié)果如表4所示，通過(guò)考察豬卵母細(xì)胞的形態(tài)正常率、卵裂率以及囊胚率發(fā)現(xiàn)，豬卵母細(xì)胞在添加3μmforskolin和7μmroscovitine的培養(yǎng)液中培養(yǎng)后的細(xì)胞形態(tài)正常率與對(duì)照組無(wú)顯著差異，但卵裂率和囊胚率與對(duì)照組差異顯著，尤其是囊胚率較對(duì)照組大大提高。表43μmforskolin和7μmroscovitine處理后豬卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力（孤雌激活）組別卵母細(xì)胞數(shù)形態(tài)正常率（%）卵裂率（%）囊胚率（%）促進(jìn)劑組31085.6(272/318)85(231/272)a54.3(125/231)a陽(yáng)性對(duì)照組32091.9(294/320)79.6(234/294)26.1(61/234)b陰性對(duì)照組30089.3(268/300)78.7(211/268)27.5(58/211)b注：同列字母不同表示差異有顯著性(p＜0.05)，無(wú)字母表示無(wú)顯著性差異(p＞0.05)。實(shí)施例3豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)1、配制溶液及培養(yǎng)液與實(shí)施例1相同。2、豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)（1）將毛喉素（forskolin）和核抑制劑roscovitine分別添加至0～22h培養(yǎng)液中，使forskolin終濃度為7μm，roscovitine終濃度為3μm；將豬卵母細(xì)胞在上述添加有forskolin和roscovitine的0～22h培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h后，轉(zhuǎn)入到22～44h培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)24h，進(jìn)行后續(xù)孤雌激活實(shí)驗(yàn)。（2）設(shè)置對(duì)照組，與實(shí)施例1相同。3、結(jié)果結(jié)果如表5所示，通過(guò)考察豬卵母細(xì)胞的形態(tài)正常率、卵裂率以及囊胚率發(fā)現(xiàn)，豬卵母細(xì)胞在添加7μmforskolin和3μmroscovitine的培養(yǎng)液中培養(yǎng)后的細(xì)胞形態(tài)正常率與對(duì)照組無(wú)顯著差異，但卵裂率和囊胚率與對(duì)照組差異顯著，尤其是囊胚率較對(duì)照組大大提高。表57μmforskolin和3μmroscovitine處理后豬卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力（孤雌激活）組別卵母細(xì)胞數(shù)形態(tài)正常率（%）卵裂率（%）囊胚率（%）促進(jìn)劑組31586.3(271/315)86.1(207/271)a51.2(106/207)a陽(yáng)性對(duì)照組32091.9(294/320)79.6(234/294)26.1(61/234)b陰性對(duì)照組30089.3(268/300)78.7(211/268)27.5(58/211)b注：同列字母不同表示差異有顯著性(p＜0.05)，無(wú)字母表示無(wú)顯著性差異(p＞0.05)實(shí)施例4豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)1、配制溶液及培養(yǎng)液與實(shí)施例1相同。2、豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)（1）將毛喉素（forskolin）和核抑制劑roscovitine分別添加至0～22h培養(yǎng)液中，使forskolin終濃度為2μm，roscovitine終濃度為8μm；將豬卵母細(xì)胞在上述添加有forskolin和roscovitine的0～22h培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h后，轉(zhuǎn)入到22～44h培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)24h，進(jìn)行后續(xù)孤雌激活實(shí)驗(yàn)。（2）設(shè)置對(duì)照組，與實(shí)施例1相同。3、結(jié)果結(jié)果如表6所示，通過(guò)考察豬卵母細(xì)胞的形態(tài)正常率、卵裂率以及囊胚率發(fā)現(xiàn)，豬卵母細(xì)胞在添加2μmforskolin和8μmroscovitine的培養(yǎng)液中培養(yǎng)后的細(xì)胞形態(tài)正常率、卵裂率以及囊胚率均與對(duì)照組無(wú)顯著差異。表62μmforskolin和8μmroscovitine處理后豬卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力（孤雌激活）組別卵母細(xì)胞數(shù)形態(tài)正常率（%）卵裂率（%）囊胚率（%）促進(jìn)劑組32086.4(276/320)81.1(223/276)30.3(67/223)陽(yáng)性對(duì)照組32091.9(294/320)79.6(234/294)26.1(61/234)陰性對(duì)照組30089.3(268/300)78.7(211/268)27.5(58/211)注：同列字母不同表示差異有顯著性(p＜0.05)，無(wú)字母表示無(wú)顯著性差異(p＞0.05)實(shí)施例5豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)1、配制溶液及培養(yǎng)液與實(shí)施例1相同。2、豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)（1）將毛喉素（forskolin）和核抑制劑roscovitine分別添加至0～22h培養(yǎng)液中，使forskolin終濃度為8μm，roscovitine終濃度為2μm；將豬卵母細(xì)胞在上述添加有forskolin和roscovitine的0～22h培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h后，轉(zhuǎn)入到22～44h培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)24h，進(jìn)行后續(xù)孤雌激活實(shí)驗(yàn)。（2）設(shè)置對(duì)照組，與實(shí)施例1相同。3、結(jié)果結(jié)果如表7所示，通過(guò)考察豬卵母細(xì)胞的形態(tài)正常率、卵裂率以及囊胚率發(fā)現(xiàn)，豬卵母細(xì)胞在添加8μmforskolin和2μmroscovitine的培養(yǎng)液中培養(yǎng)后的細(xì)胞形態(tài)正常率、卵裂率以及囊胚率均與對(duì)照組無(wú)顯著差異。表78μmforskolin和2μmroscovitine處理后豬卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力（孤雌激活）組別卵母細(xì)胞數(shù)形態(tài)正常率（%）卵裂率（%）囊胚率（%）促進(jìn)劑組30684.5(258/306)76.3(196/258)28.4(56/196)陽(yáng)性對(duì)照組32091.9(294/320)79.6(234/294)26.1(61/234)陰性對(duì)照組30089.3(268/300)78.7(211/268)27.5(58/211)注：同列字母不同表示差異有顯著性(p＜0.05)，無(wú)字母表示無(wú)顯著性差異(p＞0.05)實(shí)施例6豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)1、配制溶液及培養(yǎng)液與實(shí)施例1相同。2、豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)將毛喉素（forskolin）和核抑制劑roscovitine分別添加至0～22h培養(yǎng)液中，使forskolin與roscovitine終濃度均為5μm；將豬卵母細(xì)胞在上述添加有forskolin和roscovitine的0～22h培養(yǎng)液，按表8所述時(shí)間分別進(jìn)行培養(yǎng)。3、結(jié)果結(jié)果如表8所示，當(dāng)豬卵母細(xì)胞在添加有forskolin和roscovitine的0～22h培養(yǎng)液中培養(yǎng)22～24h后，轉(zhuǎn)入到22～44h培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)22～24h后，其發(fā)育潛力要較其他不同培養(yǎng)時(shí)間的發(fā)育潛力好。表8不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)豬卵母細(xì)胞發(fā)育潛力的影響實(shí)施例7豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)1、配制溶液及培養(yǎng)液（1）毛喉素（forskolin）：與實(shí)施例1相同；（2）核抑制劑roscovitine：與實(shí)施例1相同；（3）0～22h培養(yǎng)液：取8gtcm-199，4gnahco3，0.4gd-葡萄糖，0.15g丙酮酸鈉，0.05g青霉素鈉鹽，0.07g鏈霉素硫酸鹽，1g聚乙烯醇溶于1lddh2o中，充分混勻后，加入0.7μg/mllh，0.3μg/mlfsh，12ng/mlegf，0.3mml-半胱氨酸，12%pff；再充分混勻，抽濾除菌，置于co2培養(yǎng)箱平衡過(guò)夜。（4）22～44h培養(yǎng)液：取12gtcm-199，1gnahco3，0.7gd-葡萄糖，0.05g丙酮酸鈉，0.1g青霉素鈉鹽，0.03g鏈霉素硫酸鹽，4g聚乙烯醇溶于1lddh2o中，充分混勻后，加入9ng/mlegf和8%pff，抽濾除菌，置于co2培養(yǎng)箱平衡。（5）卵母細(xì)胞操作液：與實(shí)施例1相同；（6）融合液：與實(shí)施例1相同；（7）胚胎培養(yǎng)液：與實(shí)施例1相同；2、豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)將毛喉素（forskolin）和核抑制劑roscovitine分別添加至0～22h培養(yǎng)液中，使forskolin與roscovitine終濃度均為5μm；將豬卵母細(xì)胞在上述添加有forskolin和roscovitine的0～22h培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h后，轉(zhuǎn)入到22～44h培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)24h，進(jìn)行后續(xù)孤雌激活實(shí)驗(yàn)。3、結(jié)果豬卵母細(xì)胞在添加有5μmforskolin和5μmroscovitine的培養(yǎng)液中培養(yǎng)后的細(xì)胞形態(tài)正常率、卵裂率以及囊胚率均比不添加促進(jìn)劑培養(yǎng)的豬卵母細(xì)胞高。實(shí)施例8豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)1、配制溶液及培養(yǎng)液（1）毛喉素（forskolin）：與實(shí)施例1相同；（2）核抑制劑roscovitine：與實(shí)施例1相同；（3）0～22h培養(yǎng)液：取12gtcm-199，1gnahco3，0.7gd-葡萄糖，0.05g丙酮酸鈉，0.1g青霉素鈉鹽，0.03g鏈霉素硫酸鹽，4g聚乙烯醇溶于1lddh2o中，充分混勻后，加入0.3μg/mllh，0.7μg/mlfsh，8ng/mlegf，0.7mml-半胱氨酸，8%pff；再充分混勻，抽濾除菌，置于co2培養(yǎng)箱平衡過(guò)夜。（4）22～44h培養(yǎng)液：取8gtcm-199，4gnahco3，0.4gd-葡萄糖，0.15g丙酮酸鈉，0.05g青霉素鈉鹽，0.07g鏈霉素硫酸鹽，1g聚乙烯醇溶溶于1lddh2o中，充分混勻后，加入11ng/mlegf和12%pff，抽濾除菌，置于co2培養(yǎng)箱平衡。（5）卵母細(xì)胞操作液：與實(shí)施例1相同；（6）融合液：與實(shí)施例1相同；（7）胚胎培養(yǎng)液：與實(shí)施例1相同；2、豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)將毛喉素（forskolin）和核抑制劑roscovitine分別添加至0～22h培養(yǎng)液中，使forskolin與roscovitine終濃度均為5μm；將豬卵母細(xì)胞在上述添加有forskolin和roscovitine的0～22h培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h后，轉(zhuǎn)入到22～44h培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)24h，進(jìn)行后續(xù)孤雌激活實(shí)驗(yàn)。3、結(jié)果豬卵母細(xì)胞在添加有5μmforskolin和5μmroscovitine的培養(yǎng)液中培養(yǎng)后的細(xì)胞形態(tài)正常率、卵裂率以及囊胚率均比不添加促進(jìn)劑培養(yǎng)的豬卵母細(xì)胞高。本發(fā)明的毛喉素（forskolin）和核抑制劑roscovitine，其組合的最適宜搭配經(jīng)過(guò)我們各單一藥品、組合藥品的多種濃度及添加添加培養(yǎng)時(shí)間嘗試后，確定了體外培養(yǎng)的豬卵母細(xì)胞在添加濃度為5μmforskolin和5μmroscovitine后的培養(yǎng)液中培養(yǎng)22～24h，可有效提高體外培養(yǎng)的豬卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力。體外培養(yǎng)的豬卵母細(xì)胞是豬克隆胚胎的重要原材料，因此提高豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟效率對(duì)于科研及生產(chǎn)實(shí)踐均有重要意義。本發(fā)明提供的促進(jìn)劑型經(jīng)多次體外細(xì)胞培養(yǎng)及后續(xù)孤雌激活等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，卵裂率、囊胚數(shù)及囊胚細(xì)胞數(shù)都優(yōu)于未添加組，明確證實(shí)了此種抑制劑組合可有效地提高體外培養(yǎng)的豬卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力。當(dāng)前第1頁(yè)12