專利名稱：從注射了冷凍干燥的精子的卵母細胞發(fā)育成正常的后代的制作方法
本申請要求了1998年10月23日提交的美國專利申請No．09／177，391的優(yōu)先權(quán)，而該申請又要求了1998年3月20日和1998年6月19日提交的美國臨時專利申請No．60／078，925和60／089，938的優(yōu)先權(quán)。
美國政府在本發(fā)明中有一個已支付的許可，并且在一定情況下有權(quán)根據(jù)衛(wèi)生部國立衛(wèi)生研究院資助合同No．R01-HD-03402中的條款要求專利所有人以合理的條件許可他人使用。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及精子的冷凍干燥、用重建的冷凍干燥的精子使卵母細胞受精，以及從其發(fā)育成活的后代。
利用冷凍保護劑來成功地冷凍保藏精子以及長時期保藏冷凍精子的能力已經(jīng)使動物飼養(yǎng)以及人類生殖醫(yī)學(xué)有了很大改進。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，冷凍保護的凍融精子通常重新獲得活動能力，并能幾乎與新鮮精子一樣有效地受精。
常規(guī)方法是將精子長期保藏在液氮(-196℃)中來冷凍保藏牛和人的精子。然而，常規(guī)長期保藏精子是非常昂貴的，因為需要持續(xù)提供液氮。而且，在世界上某些地區(qū)，將精子保藏在液氮內(nèi)可能是不方便的和／或昂貴的，例如在不易獲得液氮(或甚至是干冰)的發(fā)展中國家。常規(guī)方法冷凍的精子的運輸也很成問題，因為它可能需要運輸大的液氮罐或使用含有液氮或干冰的特殊運輸容器。因此，人們作了很多嘗試來保藏精子而無需保藏在液氮內(nèi)。例如，如果能將有受精能力的精子以凍干狀態(tài)在常溫下或普通冰箱內(nèi)保藏，則維持和運輸成本將大幅度下降。
據(jù)信第一次記載冷凍干燥精子的嘗試是在1949年，當(dāng)時將1毫升(ml)家禽精液與等體積的含有20-30％甘油的Ringer＇s溶液混合，在蒸餾瓶上涂成一薄層，通過除去90％的水來“冷凍干燥”。據(jù)報道，當(dāng)制備物在放回室溫后2小時內(nèi)重新水化(rehydrate)時，多達50％的精子重新獲得活動能力。然而，卻沒有測定重新水化的精子的受精能力。
隨后有人嘗試用冷凍干燥的精子來產(chǎn)生活的后代，但沒有成功。例如，已經(jīng)報道說，在用冷凍干燥后立即重建且顯示出50％精子活動能力的公牛精子對母牛人工授精后，生出一頭活的小牛。還有報道說，用冷凍干燥的精子授精后得到了12頭正常的家兔仔。然而，創(chuàng)始人均不能重復(fù)這些結(jié)果，本領(lǐng)域其他工作人員也不能復(fù)制和證實這些結(jié)果。
通過研究正常的和凍融的精子性質(zhì)和受精能力，已經(jīng)知道，為了使精子支持正常的胚胎發(fā)育，從常規(guī)意義講精子無需是“活”的(即具有完整的質(zhì)膜)。例如，在胞質(zhì)內(nèi)精子注射(ICSI)技術(shù)中，選出能游動的人精子。它們在注射入卵母細胞之前通過其尾部的侵蝕性磨損而被立即固定(“殺死”)，導(dǎo)致質(zhì)膜破壞。曾報道，精子固定顯著提高了ICSI的受精成功率。也已報道，當(dāng)小鼠精子懸浮在沒有冷凍保護劑的介質(zhì)中，然后立即冷凍在液氮中時，如活／死細胞染色所判斷，100％的精子是“死亡的”，而將解凍的精子頭部顯微注射入卵母細胞后，卻仍產(chǎn)生了正常的胚胎發(fā)育。還有報道說，將無冷凍保護劑時凍融滅活的精子顯微注射入卵母細胞后，生出了兩頭正常的小牛。
盡管已知將凍干的倉鼠和人精子頭部注入倉鼠卵母細胞內(nèi)能形成看上去正常的前核，但是卻從未確定過這些精子頭部是否能支持正常的胚胎發(fā)育。另外，已經(jīng)證實，當(dāng)精子被冷凍并干燥至水分含量分別小于30％、7％和0．5％時，分別發(fā)生活動力喪失、頂體破壞和酶釋放。還得到了這樣的證據(jù)，即精子中的細胞蛋白因脫水低于6％水分而改變。
鑒于前述內(nèi)容，需要一種可靠的能再現(xiàn)的方法來冷凍干燥精子，使凍干精子在環(huán)境溫度、普通冰箱溫度或更低溫度下長期保存期間保留其受精能力。還需要一種精子注射方法，該方法采用重新水化的凍干的精子使受體卵母細胞受精，從而產(chǎn)生正常的活后代。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種冷凍干燥精子來獲得至少一個頭部(胞核)能使卵母細胞受精產(chǎn)生活后代的重建精子的方法。本發(fā)明的方法包括下列步驟(a)收集活的精子；(b)將精子懸浮在懸浮培養(yǎng)基中；(c)冷凍精子懸液；和(d)將精子懸液干燥至水分含量低于1％、較佳的低于0．01％、更佳的低于0．001％、特別佳的低于0．00001％。該方法還包括使經(jīng)冷凍干燥的精子懸液從新水化的步驟，其中至少一個重新水化的精子頭部保留其遺傳完整性，并能使卵母細胞受精產(chǎn)生活的后代。如下所述，該方法可能還包括在重新水化前保藏經(jīng)冷凍干燥的精子的步驟。
為了獲得活的后代，至少將重新水化精子的頭部(胞核)插入分離的卵母細胞內(nèi)，形成受精的卵母細胞。可用顯微注射、較佳的是壓電驅(qū)動的顯微注射來將精子頭部注入卵母細胞內(nèi)。較佳的，胞核的插入在重新水化后1小時以內(nèi)進行。然后使受精的卵母細胞發(fā)育成胚胎，并植入代孕母親的子宮內(nèi)，該卵母細胞在子宮內(nèi)發(fā)育成活的后代。
在一些種類動物(例如大多數(shù)真獸亞綱動物，包括人)中，受精卵母細胞的正常胚胎發(fā)育還需要隨精子胞核插入的親代中心體。當(dāng)精子頭部和尾部分開時，中心體通常與精子頭部的后端或精子尾部的前端連接。因此，在本發(fā)明的實施方案中，來自另一精子的與精子連接的中心體可以和精子頭部同時插入，或可以和精子尾部同時插入或連續(xù)插入。另外，精子胞核和中心體的插入可通過將一個完整的重新水化的精子插入卵母細胞來實現(xiàn)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，用本發(fā)明方法冷凍干燥過的精子可在環(huán)境溫度(例如室溫)至冰箱溫度(例如約4℃)的溫度范圍內(nèi)保藏至少三個月，或更佳的至少一年，而不喪失其遺傳完整性或受精能力。因此，用本發(fā)明方法制得的冷凍干燥的精子可以在常溫或冰箱溫度下運輸至世界上幾乎任何地方期間保留其(受精)能力，并且在不易獲得液氮或干冰的場所在環(huán)境或冰箱溫度下能短期保藏。較佳的，經(jīng)冷凍干燥的精子的長期(例如無限期)保藏宜在低于4℃的溫度(例如-20℃或更低)下進行。
本發(fā)明的方法可用來冷凍干燥無脊椎動物和脊椎動物的精子，這些動物包括，但不局限于，無脊椎動物如海膽、鮑魚、龍蝦、有殼的水生動物等，以及脊椎動物如魚類、兩棲類、爬蟲類、鳥類和所有哺乳動物。
附圖簡述本專利的文件含有至少一張彩色附圖。在請求并支付所需費用后，專利商標(biāo)局將提供具有彩色附圖的本專利副本。


圖1是含有冷凍干燥的小鼠精子的真空密封安瓿的照片。每個安瓿底部的白色粉末是含有精子的經(jīng)干燥的CZB培養(yǎng)液。
圖2A是冷凍干燥的小鼠精子在重新水化后立即拍攝的顯微照片。根據(jù)保藏期間對干燥樣品處理得輕微還是粗糙，沒有尾部或有尾部斷裂的精子頭部的部分是不同的。
圖2B顯示未冷凍的正常精子頭部前端區(qū)域的縱向橫截面的電子顯微照片。
圖2C顯示重新水化后凍干精子頭部在重新水化后的前端區(qū)域縱向和橫向橫截面的電子顯微照片。缺少了質(zhì)膜(p)和頂體物質(zhì)(ac)。(ia)=頂體內(nèi)膜，(oa)=頂體外膜，(n)=胞核。
圖3是CD-1(白化體)代孕母親生出的三只幼鼠(黑色)的照片。這些幼鼠從注射了B6D2F1精子的B6D2F1卵母細胞發(fā)育而來，而該B6D2F1精子在冷凍干燥后室溫下放置了一個月。
發(fā)明詳述在哺乳動物正常受精期間，有受精能力的精子沿雌性的生殖道上行，鉆過卵母細胞的外殼，然后與卵母細胞融合。精子與卵母細胞的融合觸發(fā)卵母細胞激活。激活的卵母細胞恢復(fù)減數(shù)分裂，卵母細胞染色體轉(zhuǎn)變成雌性前核。同時，卵母細胞內(nèi)的精子胞核解凝聚，轉(zhuǎn)變成雄性前核。然后，完全發(fā)育的雌性和雄性前核聯(lián)合，這些前核的染色體混合在一起。得到的受精卵發(fā)育成活的后代。
本發(fā)明提供了一種冷凍干燥精子的方法，該精子在重新水化后能使分離的卵母細胞受精產(chǎn)生活的后代。用本發(fā)明方法產(chǎn)生的凍干的精子保留了其遺傳和繁殖能力，即使在重新水化后，它們也不能游動，在常規(guī)意義下是“死”的。當(dāng)將本發(fā)明精子的整個精子或分離的精子頭部(即含有包括胞核的所有頭部組分)或脫膜(demembranating)的精子或精子頭部(即保留了胞核和核周物質(zhì)，但是缺少質(zhì)膜)直接注入卵母細胞內(nèi)后，卻發(fā)生了能導(dǎo)致產(chǎn)生活后代的正常受精和胚胎發(fā)育。較佳的，將精子頭部(胞核)直接插入卵母細胞的胞質(zhì)內(nèi)。精子頭部的插入可通過顯微注射、較佳的是壓電驅(qū)動的顯微注射來進行。如下文進一步描述的，一些種類動物的受精卵母細胞的胚胎發(fā)育可能需要同時或依次注入精子中心體。如果中心體在冷凍干燥過程中沒有存活，則可從未冷凍的精子收獲中心體用來插入卵母細胞內(nèi)。
現(xiàn)在將更詳細地描述本發(fā)明用來制備有受精能力的冷凍干燥的精子的方法，及其在體外受精程序中的各個步驟及分步驟。
精子的制備。
為了確保在本發(fā)明的冷凍干燥過程中有盡可能多的冷凍干燥精子保留其遺傳完整性，較佳的是在本發(fā)明方法中采用生理上成熟的精子。在成熟精子中，DNA與稱為魚精蛋白的堿性蛋白結(jié)合在一起。在哺乳動物中，魚精蛋白通過二硫鍵充分交聯(lián)。這使精子胞核穩(wěn)定，并使它們能非常耐受物理和化學(xué)破壞。胞核魚精蛋白的交聯(lián)主要發(fā)生在精子轉(zhuǎn)移通過附睪期間。因此在附睪內(nèi)的以及射精(精液)中的哺乳動物精子通常在生理上比在睪丸內(nèi)的精子更成熟，因此在本發(fā)明方法中是較佳的，至少在哺乳動物是如此。
無脊椎動物和脊椎動物的成熟精子可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來收集。例如嚙齒類動物(如小鼠、金色(Syrian)倉鼠、豚鼠)、家兔等的成熟精子可以從尾附睪收集；而在其他種類的動物如人、豬、馬、公牛、山羊、禽等情況下，可以從能育雄性剛射出的精液分離集成熟精子。魚(例如劍尾(swordtail)，Xiphophorus helleri)以及無脊椎動物如海膽(Tripneustes gratilla)的精子可以從成熟雄性的睪丸收集得到。
下面是從尾附睪獲得精子的一個方法例子。取出成熟雄性小鼠(出生后約8周)的尾附睪。除去尾附睪表面的血液和脂肪組織。然后將其壓縮，釋放出稠密的精子團。將1滴(約2微升)精子團置于1．5毫升聚丙烯離心試管的底部，用0．5毫升溫?zé)岬纳砼囵B(yǎng)液(如CZB培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液或等滲鹽溶液)覆蓋。37℃下約10至20分鐘后，可以從上清液中收集到游動的精子。
下面是從精液中獲得精子方法的一個例子。使新鮮射出的人精液在室溫下(約25℃)液化約30分鐘。然后用約10毫升鹽水稀釋精液，并過濾通過大約兩層濾紙，除去碎片。然后400xg離心濾液大約10分鐘，將沉淀的精子重懸于生理溶液中至所需濃度，用于冷凍干燥過程。
下面是從睪丸獲得精子的方法的一個例子。將切下的睪丸置于紅細胞裂解緩沖液(例如155毫摩爾NH4Cl，10毫摩爾KHCO3，2毫摩爾EDTA，pH7．2-7．4)中，用一把細剪刀剪碎，并通過約兩層濾紙過濾除去碎片。然后離心濾液(例如700xg，5分鐘)，將沉淀重懸于生理溶液中至所需濃度，用于冷凍干燥過程。
不論采用何種方法來制備精子，回收得到的精子有50％以上應(yīng)是能游動的。
將如此回收得到的精子重懸于下文所述的用于冷凍干燥過程的生理培養(yǎng)基中。或者，精子可在冷凍干燥前經(jīng)歷進一步加工，以獲得脫膜的精子頭部。
脫膜精子頭部的制備脫膜精子頭部是經(jīng)洗滌劑抽提過的頭部，它缺少所有的膜(包括質(zhì)膜和頂體內(nèi)膜和外膜)，但是保留了胞核和核周物質(zhì)。例如，可用含有或不含SDS(十二烷基硫酸鈉)的Triton X-100處理使精子頭部脫膜。Triton X-100是熟知的非離子表面活性劑，它廣泛用于在非變性條件下除去膜組分。SDS是陰離子洗滌劑，用來使各種蛋白(包括膜蛋白)溶解。在小鼠中，用Triton X-100脫膜的精子頭部表明能激活卵母細胞，導(dǎo)致正常的胚胎發(fā)育。
下面是對精子頭部脫膜的一個典型方法。對上述制得的精子懸液等份進行超聲處理。例如，將上述從尾附睪、睪丸或精液中收集的精子懸浮在5毫升BM緩沖液(75毫摩爾氯化鈉、24毫摩爾EDTA和50毫摩爾Tris-HCl，pH7．2)中，在Biosonik超聲儀(Bronwill Scientific，Rochester，NY)以70-80％輸出功率超聲處理30秒。該處理使95％以上的精子去頂。為了使精子頭部脫膜，使超聲后的精子懸液700xg離心5分鐘，用BM緩沖液洗滌沉淀，然后在室溫下用1％Triton X-100(以NIM培養(yǎng)液配制)處理5分鐘。(NIM培養(yǎng)液由123．0毫摩爾氯化鉀、2．6毫摩爾氯化鈉、7．8毫摩爾磷酸二氫鈉、1．4毫摩爾磷酸二氫鉀、3毫摩爾EDTA二鈉組成，pH7．2)。然后用NIM培養(yǎng)液充分洗滌頭部，并重懸于用于冷凍干燥過程的精子懸浮培養(yǎng)液中。
精子懸浮培養(yǎng)液在冷凍干燥制備時，將精子(或脫膜的精子頭部)懸浮在生理溶液中，該溶液足以在正常條件下支持至少精子胞核的完整性。該溶液應(yīng)是平衡鹽溶液，至少具有合適的滲透壓和pH。沒有一種培養(yǎng)基能支持所有種類動物的精子存活。例如，對于海膽精子合適的溶液是海水，具有大約1000滲透壓毫摩爾的滲透壓，pH值約為8．2。然而，海水會立即殺死哺乳動物精子。哺乳動物精子要求溶液的滲透壓約為300滲透壓毫摩爾，pH為7．0-7．6。然而，該溶液會殺死海膽精子。
鑒于前述內(nèi)容，必須根據(jù)涉及的動物種類、按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)來選擇精子用懸浮培養(yǎng)液。這種選自無需作過多的實驗。因為為了通過注射使卵母細胞成功地受精，精子不必是膜完整的(它們可以是“死”的)，因此懸浮培養(yǎng)液中絕對不需要冷凍保護劑如甘油等。
包裝精子懸浮液可以放在各種不同的容器內(nèi)，這些容器包括但不局限于，帶有螺帽的玻璃安瓿或塑料冷凍管(冷凍瓶)，或可將懸液抽入塑料吸管內(nèi)，該吸管在冷凍干燥過程后可通過粉末密封劑、加熱或用尼龍塞來密封。每一包裝物中精子懸液的體積并不是關(guān)鍵。通常，在2毫升安瓿內(nèi)采用約50-100微升的體積。
精子的冷凍干燥精子懸液可用己知的方法緩慢或迅速冷凍。例如，可用本領(lǐng)域熟知的方法將懸液冷凍在液氮蒸氣內(nèi)或機械(電子)冷凍器的致冷空氣中。冷卻和冷凍可通過人工靜態(tài)或分步方案來進行，或在電子自動化以及程控液氮進料系統(tǒng)中實施?？刹捎貌煌睦鋬鏊俣?例如1℃-25℃／分鐘)。例如，可以在-196℃下進行冷凍步驟10分鐘。
在成功地以液氮蒸氣冷凍吸管、安瓿或冷凍管內(nèi)的懸液時可作各種改進?？刹捎靡旱吕錂C，將帶雪茄管的金屬容器(罐)、帶有吸管的其他支架、或帶安瓿或冷凍管的支架或框架直接放在液氮蒸氣中。
冷凍的精子懸液在真空下的干燥可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種不同系統(tǒng)來實現(xiàn)。例如，一種已知的裝置是VirTis型號10-020(VirTis Co．，Gardiner，NY)。將懸液干燥至水分含量低于1％量。然而，水分含量宜低于0．01％，更佳的低于0．001％，尤其佳的是低于0．00001％。帶有冷凍干燥的精子的容器宜為真空密封的，或在惰性氣體(氮氣或氬氣)存在下密封。
保藏帶有冷凍干燥的精子的容器宜保藏在暗處，或用鋁箔等包裹。對于長期保藏，較佳的是將該容器保藏在-20℃或更低的溫度下。與用相當(dāng)方法冷凍干燥的細菌、真菌等一樣，預(yù)計冷凍干燥的精子胞核在這些保藏條件下將無限期地保留其遺傳完整性。然而，該容器可在環(huán)境溫度(如室溫)或常規(guī)的冰箱溫度(約4℃)保藏超過3個月而不損害冷凍干燥的精子胞核使卵母細胞受精的能力。因此，冷凍干燥的精子可以運輸，而無需特殊的條件或大容器。
冷凍干燥的精子的重新水化冷凍干燥的精子制備物宜通過加入純水來重新水化，加入體積與精子懸液在冷凍干燥前的初始體積相同。一旦重新水化后，任何生理鹽溶液，如0．9％鹽溶液或CZB培養(yǎng)液(見下文)可用于稀釋。稀釋體積并不關(guān)鍵。最終的重新水化的培養(yǎng)基中的精子濃度應(yīng)當(dāng)足以幫助重新獲得單個精子或單個精子頭，便于將精子注射入卵母細胞內(nèi)(如下所述)。
卵母細胞激活以及注射精子頭部后的正常受精的發(fā)生率看來隨精子重新水化后的時間增加而降低。重新水化和注射之間允許的時間在各動物種類之間可能不同；然而，作為一個例子，對于小鼠精子的時間宜為1小時或更短。
重新水化的冷凍干燥的精子的顯微鏡檢查冷凍干燥后重新水化的精子不能游動?？刹捎媚軈^(qū)分常規(guī)意義上活的或死的精子的染色方法，以評價精子的生存力。一種用于本發(fā)明的合適的市售的生存力測試試劑盒是購自Molecular Probes，Eugene，Oregon的Live／dead FertiLight，它能在碘化丙啶／SYBR 14染色后根據(jù)UV顯微鏡下的熒光圖案來區(qū)分質(zhì)膜完整的(活的)和質(zhì)膜被損傷的(死的)細胞。具有完整質(zhì)膜的“活的”精子的胞核熒光呈綠色，而“死”的精子胞核的熒光呈亮橙紅色。預(yù)計所有受檢測的精子在常規(guī)意義下都是“死”的。
圖2A是典型的冷凍干燥的小鼠精子在重新水化后立即拍攝的顯微照片。一些精子的頭部和尾部分開。根據(jù)保藏時對干燥樣品處理是輕微還是粗魯，尾部斷裂或沒有尾部的精子比例可能是不同的。將有或沒有尾部的精子用于下述的注射程序。
圖2B和2C中分別描述了新鮮的(非冷凍干燥的)、活的精子與用本發(fā)明方法冷凍干燥并重新水化的精子之間的差別。每張圖顯示了通過精子頭部前端區(qū)域的縱向橫截面。盡管冷凍干燥并重新水化的精子保留了胞核(n)，一部分頂體外膜(oa)和一部分頂體內(nèi)膜(ia)，但卻缺少質(zhì)膜(p)和頂體物質(zhì)(ac)。
受體卵母細胞受體卵母細胞可以這樣獲得，例如通過注射促性腺激素(例如依次給予馬和人絨毛膜促性腺素)誘導(dǎo)動物排卵或超排卵，以及在排卵預(yù)計時間(例如小鼠注射人絨毛膜促性腺素后13-15小時)立即用外科方法收獲輸卵管卵細胞?；蛘?，收集卵巢卵母細胞，培養(yǎng)在培養(yǎng)基中使它們成熟，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的。較佳的培養(yǎng)基例子是添加了牛血清白蛋白(BSA)的改進的Eagle培養(yǎng)基(MEM)，如Downs，S．M．和A．M．Mastropolo在Develop．Biol．162∶154-168，1994中所述用于小鼠卵母細胞的培養(yǎng)基。
體外成功受精所需的精子組分已經(jīng)知道，在小鼠，正常的受精可通過將分離的精子頭部注射入卵母細胞中來實現(xiàn)，且質(zhì)膜、頂體膜和所有尾部組分并非正常胚胎發(fā)育所必需的。小鼠以及可能大多數(shù)常用實驗室嚙齒類動物是“例外的”，因為精子中心體并非正常受精所必需，且在正常受精期間，精子頸部區(qū)域內(nèi)的精子中心體注定會在受精后的卵母細胞內(nèi)退化。
相反，在大多數(shù)其他真獸亞綱哺乳動物(包括牛和人)中，精子中心體在形成微管中起關(guān)鍵作用，而微管又是雄性和雌性前核聯(lián)合以及以后在胚胎發(fā)育期間的斷裂所必需的。因此，在這些動物種類中，精子胞核(頭部)和中心體導(dǎo)入卵母細胞似乎是產(chǎn)生正常后代所必需的。目前還不知道所有種類動物的精子中心體在冷凍干燥中是否能存活。如果不存活，則必須將未冷凍精子的中心體與經(jīng)冷凍干燥的精子頭部一起注入卵母細胞，以保證正常的胚胎發(fā)育。然而，導(dǎo)入數(shù)量過多的中心體將導(dǎo)致前核發(fā)育異常和胚胎發(fā)育異常。
當(dāng)頭部和尾部分開時，中心體通常與精子頭部的后端或精子尾部的前端相連接。因此，可將精子中心體與精子頭部同時插入卵母細胞內(nèi)，或同時或連續(xù)將精子尾部插入來插入精子中心體。另外，精子胞核和中心體的插入可通過將完整的重新水化的精子插入卵母細胞內(nèi)來實現(xiàn)。
將精子胞核插入受體卵母細胞可以將整個精子插入受體卵母細胞的細胞質(zhì)內(nèi)，但是在精子較大的動物種類中，宜通過顯微注射技術(shù)將分離的精子頭部(胞核)直接注射入受體卵母細胞的細胞質(zhì)內(nèi)。在將重新水化的精子頭部或重新水化的脫膜精子頭部注射入受體卵母細胞中的較佳實施方案中，宜采用壓電驅(qū)動的微量移液管。
市售的合適的壓電驅(qū)動裝置是Prime Tech Ltd．(Tsukuba，Ibaraki-ken，Japan)生產(chǎn)的名稱為"壓電微量操作儀／壓電沖擊驅(qū)動單元(Piezo Micromanipulator／Piezo ImpactDrive Unit)"。該單元利用壓電效應(yīng)以高度控制的快速方式使(注射)移液管夾持器向前推進非常短的距離(約0．5微米)。每一脈沖的強度和時間可以不同，并由一控制單元調(diào)控。
為了注射入卵母細胞，按照生產(chǎn)商說明書將單個精子(首先是尾部)吸入注射移液管中，該移液管具有內(nèi)徑約5微米的短的平頭嘴部，其安裝在壓電驅(qū)動單元中。向精子頸部區(qū)域施加一個或數(shù)個壓電脈沖，使精子頭部和尾部分開。然后將頭部深深吸入移液管內(nèi)。
在注射精子頭部(胞核)的整個過程中，用常規(guī)的夾持移液管來固定卵母細胞。使含有所選精子頭部的注射移液管嘴部與卵母細胞的透明帶密切接觸，施加數(shù)個壓電脈沖(用控制器設(shè)定強度等級為1-5，速度為4-6)，以推進移液管，同時維持其中稍稍呈負壓。當(dāng)移液管嘴部通過透明帶后，將產(chǎn)生得到的透明帶栓(堵塞物)擠入卵黃周隙，將精子頭部向前推至其靠近移液管嘴。然后將移液管嘴與質(zhì)膜并列，并向卵母細胞的對側(cè)面推進，直至夾持移液管幾乎到達卵母細胞皮質(zhì)的對側(cè)?，F(xiàn)在，卵母細胞質(zhì)膜深深地套在注射針嘴的周圍。在施加1至2次壓電脈沖(強度為1-2，速度為1)后，卵膜被移液管嘴刺破，表現(xiàn)為清晰可見的卵膜迅速松弛。然后，將精子頭部和伴隨的最少量(約6pL)培養(yǎng)基擠入卵質(zhì)。然后輕輕抽出移液管，使新導(dǎo)入的胞核留在卵母細胞的細胞質(zhì)內(nèi)。該方法進行得很迅速，通常一批可進行10-15個卵母細胞，而這些卵母細胞其它時間則是維持在培養(yǎng)條件下。
備選的顯微注射方案也可用來插入精子頭部，其中采用的是常規(guī)的注射移液管。采用常規(guī)移液管來將精子頭部注入倉鼠卵母細胞的合適的顯微注射方法例子在Yanagida，K．，Yanagimachi，R．，Perreault，S．D．和R．G．Kleinfeld，Biology of Reproduction44，440-447(1991)中有所描述，關(guān)于該方法的公開內(nèi)容被納入本文作參考。
顯微注射精子頭部／脫膜精子頭部提供了幾個優(yōu)點。首先，用顯微注射輸送精子頭部適用于各種精子類型，不管其大小形態(tài)等如何。第二，顯微注射能在注射精子頭部時仔細地控制附加試劑(和供體精子頭部一起)共同注射入卵母細胞內(nèi)。這些在下文有舉例說明。第三，在用壓電驅(qū)動顯微注射插入精子頭部的本發(fā)明實施方案中，提供了一種迅速有效地加工樣品的方法，從而減少了對經(jīng)受操作的精子和卵母細胞的損傷。某些種類動物(如小鼠)的卵母細胞不易用常規(guī)針頭來進行顯微注射，而壓電驅(qū)動的顯微注射提供了高的成功率。
受精的卵母細胞的激活已經(jīng)知道，可通過注射單個完整的小鼠精子或其分離的頭部來激活小鼠卵母細胞。分離的精子尾部不能激活卵母細胞。在圓形精子細胞轉(zhuǎn)變成精子時，通常會出現(xiàn)有活性的精子攜帶的卵母細胞激活因子。這些因子并非高度種類特異性的，因為注射外源種類(如倉鼠、家兔、豬、人、甚至是魚)的精子也可激活小鼠卵母細胞。已有報道說，一種這樣的激活因子是存在于頂體赤道段區(qū)域內(nèi)的33千道爾頓的蛋白。該蛋白稱為振蕩蛋白(oscillin)，它容易通過簡單的凍融從成熟(倉鼠)精子中抽提得到。除了振蕩蛋白外，成熟精子看來還攜帶了另一種激活因子，該因子不易被抽提，但是可通過用Triton X-100和SDS依次處理精子來獲得。還不知道可抽提的振蕩蛋白和耐受凍融抽提的因子在生物學(xué)和化學(xué)上是否相同。
已經(jīng)知道，在Triton X-100存在下超聲處理的精子頭部喪失了除胞核和核周物質(zhì)外的所有組分。然而，當(dāng)用顯微外科方法注入卵母細胞內(nèi)后，這些經(jīng)Triton X-100處理過的精子頭部(具有胞核和核周物質(zhì)，但是沒有質(zhì)膜)能象完整精子一樣有效地激活卵母細胞。
如下文實施例所述的，至少在小鼠情況下，精子攜帶的卵母細胞激活分子必定對冷凍干燥有耐受力，因為在注射入冷凍干燥的精子頭部后存活的大多數(shù)卵母細胞能被正常地激活和受精。
如果在其他動物種類中，精子頭部的注射沒有起激活卵母細胞的作用，則激活可能是通過單性生殖方式發(fā)生的，例如通過電激活、注射入一種或多種激活卵母細胞的物質(zhì)、或?qū)⒙涯讣毎D(zhuǎn)移到含有一種或多種激活卵母細胞的物質(zhì)的培養(yǎng)基中。能提供激活刺激(或激活刺激組合)的試劑包括，但不局限于，精子細胞質(zhì)激活因子以及某些藥理學(xué)化合物(如Ca2+和其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑)，它們可與精子頭部共同注射或在注射精子頭后通過顯微注射來導(dǎo)入。將受精的卵母細胞轉(zhuǎn)移至含有一種或多種激活性化合物亞組的培養(yǎng)基中后，就可提供某些激活刺激，這些激活化合物包括Ca2+釋放刺激劑(如咖啡堿，Ca2+離子載體如A23187和離子霉素，以及乙醇)、磷蛋白信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)劑(例如2-氨基嘌呤、星形孢菌素和鞘氨醇)、蛋白合成的抑制劑(例如A23187、環(huán)己酰胺)、6-二甲基氨基嘌呤或前述物質(zhì)的組合(例如6-二甲基氨基嘌呤和離子霉素)。在本發(fā)明的一個實施方案中，是通過在含有2-10毫摩爾Sr2+、不含Ca2+的CZB培養(yǎng)液中培育1-6小時來激活小鼠卵母細胞的。
胚胎發(fā)育產(chǎn)生活的胎兒和后代在形成前核后，可以體外培養(yǎng)胚胎，直至其達到2-8細胞階段或桑椹胚／胚泡階段，此時可將胚胎轉(zhuǎn)移到代孕母親的輸卵管或子宮內(nèi)。
與精子頭部同時注射生物學(xué)感興趣的物質(zhì)在本發(fā)明的一個實施方案中，將精子頭部顯微注射入卵母細胞時可允許在將精子頭部導(dǎo)入卵母細胞之前、期間或之后導(dǎo)入一種或多種具有改變胚胎發(fā)育結(jié)果潛力的試劑。例如，可在注射精子頭部之前或之后通過顯微注射將核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)導(dǎo)入卵母細胞。例如，注射入攜帶所需順式活性信號的重組DNA可導(dǎo)致重組DNA上的序列通過常駐的或共注射的轉(zhuǎn)錄因子來轉(zhuǎn)錄，隨后表達出對發(fā)育抑制因子有拮抗作用、或?qū)ε咛グl(fā)育有正作用的編碼蛋白質(zhì)。另外，轉(zhuǎn)錄物可具有針對編碼發(fā)育抑制蛋白的mRNA的反義活性?；蛘?，可通過注射入核酸(或它們的衍生物)來實現(xiàn)反義調(diào)節(jié)，這些核酸能通過與沒有在卵母細胞中先行轉(zhuǎn)錄的它們的核酸靶標(biāo)直接反應(yīng)來發(fā)揮抑制作用。
通過本發(fā)明方法導(dǎo)入的重組DNA(線形或其它形狀)可含有一個功能性復(fù)制子，該復(fù)制子含有一個或多個在啟動子控制下表達的功能性基因，該基因能表現(xiàn)出從窄到寬的發(fā)育表達分布圖。例如，當(dāng)啟動子僅在早期受精卵中有活性時，該啟動子可能指導(dǎo)立即而簡短的表達。導(dǎo)入的DNA可能在胚胎發(fā)育期間的某一時刻喪失，或整合入一個或多個基因組基因座，在所得轉(zhuǎn)基因個體的整個生命中穩(wěn)定地復(fù)制。在一個實施方案中，編碼推定“抗老化”蛋白(如端粒酶或超氧化物歧化酶)的DNA構(gòu)建物可通過顯微注射來導(dǎo)入卵母細胞。另外，可直接注射這些蛋白。
實施例下列實施例描述了本發(fā)明的方法以及從注射了重建的經(jīng)冷凍干燥的精子的卵母細胞發(fā)育成活的后代。具體地說，這些實施例描述了從小鼠卵母細胞來發(fā)育產(chǎn)生正常的小鼠，這些卵母細胞中注射了重建的經(jīng)冷凍干燥的小鼠精子頭部(胞核)，該精子曾保藏在室溫(約25℃)或冰箱(約4℃)下。如下所述，在冷凍干燥前的精子懸浮培養(yǎng)液是CZB或DMEM。
本文中這些實施例的目的只是列舉可用于本發(fā)明方法的來自一種動物的卵母細胞和精子、精子懸浮培養(yǎng)液、冷凍方案、保藏條件、重新水化的介質(zhì)等例子，并沒有限制性，因為本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地認識到本發(fā)明實施方案的其它例子。
材料和試劑所有無機和有機化合物均購自Sigma Chemical Co．，(St．Louis，MO)，除非另有所述。
在注射精子前，將收獲的卵母細胞保持在CZB培養(yǎng)液(Chatot，等人，1989．J．Reprod．Fert．86，679-688)中。CZB培養(yǎng)液包含81．6毫摩爾氯化鈉、4．8毫摩爾氯化鉀、1．7毫摩爾氯化鈣、1．2毫摩爾硫酸鎂、1．8毫摩爾磷酸二氫鉀、25．1毫摩爾碳酸氫鈉、0．1毫摩爾EDTA二鈉、31毫摩爾乳酸鈉、0．3毫摩爾丙酮酸鈉、7單位／毫升青霉素G、5單位／毫升硫酸鏈霉素和4毫克／毫升牛血清白蛋白。用于從輸卵管收集卵母細胞、隨后的處理以及顯微操作的培養(yǎng)液是改進的CZB，它含有20毫摩爾Hepes、減少量的碳酸氫鈉(5毫摩爾)和3毫克／毫升牛血清白蛋白(BSA)。培養(yǎng)液在這里稱為Hepse-CZB。為了顯微注射的目的，較佳的是將BSA置于含有0．1毫克／毫升聚乙烯醇(PVA，可溶于冷水，平均分子量為10×103)的Hepes CZB中，因為與BSA相比，PVA能在更長時間內(nèi)使注射移液管壁粘度更低，這在重復(fù)使用單根移液管進行多個精子頭部／卵母細胞的多次轉(zhuǎn)移期間是有利的。
在冷凍干燥前，采用兩種不同的精子懸浮培養(yǎng)液來懸浮精子(1)沒有乙二胺四乙酸(EDTA)、含有4毫克／毫升BSA的CZB培養(yǎng)液；和(2)添加了10％(v／v)胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)的Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)液(DMEM)。
進行初步實驗以調(diào)查哪個是用于此目的的“最佳”的精子懸浮培養(yǎng)液，實驗這樣進行首先將新鮮精子懸浮在CZB培養(yǎng)液內(nèi)，然后離心并重懸于下文列出的一種培養(yǎng)液內(nèi)，然后立即對精子冷凍干燥。測試的精子懸浮培養(yǎng)液包括(a)蒸餾水，(b)含34％蔗糖的蒸餾水，(c)180毫克／毫升蜜三糖加上5毫克／毫升BSA，(d)0．9％氯化鈉和5毫克／毫升BSA，(e)0．9％氯化鈉和1毫克／毫升葡萄糖加上5毫克／毫升BSA，以及(f)不含乳酸鹽和鈣鹽的CZB。只有最后的培養(yǎng)液(f)顯示出在冷凍干燥期間能象常規(guī)CZB一樣好地保持了精子胞核發(fā)育的能力(數(shù)據(jù)未顯示)。
動物這些實施例中所用的動物按照夏威夷大學(xué)實驗動物服務(wù)部(Laboratory AnimalService at the University of Hawaii)以及實驗資源國立研究委員會研究所的實驗動物管理和使用委員會(Committee on Care and Use of Laboratory Animals of the Institute ofLaboratory Resources National Research Council)制定的指南(DHEW公布號[NIH]80-23，1985年修訂)來飼養(yǎng)。動物的處理方法得到夏威夷大學(xué)動物管理和使用委員會的監(jiān)督和批準(zhǔn)。
實施例1精子的制備制得四種不同的冷凍干燥的精子制備物，以用來闡述精子懸浮培養(yǎng)液、保藏溫度和保藏時間對冷凍干燥的精子胞核注入卵母細胞后參與活后代發(fā)育的能力的影響，如下文及表1所述。對于每種制備物，采用成熟B6D2F1雄性小鼠的兩個尾附睪。用手指擠壓每個附睪，同時用鋒利的鉗子刺穿其遠側(cè)部。將從附睪中滲出的稠密的精液團轉(zhuǎn)移到1．5毫升聚丙烯管中，管內(nèi)含有1毫升上述兩種測試培養(yǎng)液CZB或DMEM的一種。37．5℃下培育30分鐘后，從管中取出上部0．3-0．5毫升培養(yǎng)液。該懸浮液中90％以上的精子(每毫升約3-10×106個)能活潑地游動。
實施例2精子的冷凍干燥將精子懸浮液等份(100微升)置于2毫升安瓿(Wheaton Scientific，Millville，NJ，目錄號No．651506)內(nèi)，將安瓿直接放入液氮中。10分鐘后，將安瓿放在與冷凍干燥系統(tǒng)(10-020型，VirTis Co．，Gardner，NY)相連的預(yù)冷(-50℃)的冷凍瓶內(nèi)。入口壓力約為1毫乇(Torr)。約12小時后，用氣體干燥罐(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA目錄號09-204)提供的氬氣充滿該瓶，然后將其從系統(tǒng)中取出。將99％以上的氣體抽出后，將每個安瓿與一真空泵相連，并用火焰封口。用鋁箔個別包裹安瓿，并于室溫下(約25℃)或4℃下保藏于暗處。
圖1中描述了如上所述制得的含凍干小鼠精子的安瓿。每個安瓿底部的白色粉末是含有精子的經(jīng)干燥的CZB培養(yǎng)液。
實施例3冷凍干燥的精子的重新水化將上述制得的含凍干精子的安瓿打碎，將100微升蒸餾水加入安瓿內(nèi)，形成重建的精子懸液。然后，使5微升精子懸液與含有12％(w／v)聚乙烯吡咯烷酮(平均分子量為360000)的50微升Hepes-CZB充分混合。用顯微鏡觀察重新水化的精子，只選出具有完整頭部和尾部的那些作進一步操作。
實施例4冷凍干燥的精子的運輸進行一個實驗，以確證用本發(fā)明方法制得的經(jīng)冷凍干燥的精子是否能運輸至外國且仍然保留其在重新水化后使卵母細胞受精的能力。在本實驗中，在從夏威夷火奴魯魯?shù)饺毡镜娜苈贸唐陂g，人工攜帶數(shù)瓶含冷凍干燥的附睪精子的安瓿。在冷凍干燥前，精子懸浮于CZB培養(yǎng)液中。沒有采取特殊的措施來保藏精子，只是在整個旅程中用鋁箔包裹安瓿并置于紙板箱內(nèi)。環(huán)境溫度在5℃和30℃之間變化。在返回火奴魯魯?shù)囊恢芎?，使精子重新水化并用于本發(fā)明的方法中。
實施例5卵母細胞的準(zhǔn)備每只小鼠注射7．5國際單位(IU)的懷孕母馬血清促性腺激素，48小時后注射7．5IU的人絨毛膜促性腺素(hCG)，誘使成熟的B6D2F1(C57BL／6×DBA／2)雌鼠過度排卵。注射hCG14小時后，從輸卵管收集卵丘-卵母細胞復(fù)合體，用含有牛睪丸透明質(zhì)酸酶(300USP U／毫升；ICN Biochemicals，Costa Mesa，CA)的Hepes-CZB培養(yǎng)液處理3分鐘以分散卵丘細胞。注射精子胞核前，用CZB培養(yǎng)液洗滌卵母細胞，并在5％CO2的空氣下在CZB培養(yǎng)液中37℃保藏最多4小時。
實施例6將精子胞核顯微注射到卵母細胞內(nèi)為了將精子頭部注射入制得的卵母細胞內(nèi)，用塑料平皿(100毫米×150毫米；Falcon Plastics，Oxnard，CA，目錄號1001)的蓋子(深度為10毫米)制得顯微注射室。沿平皿的中心線放置一排兩滴圓形液滴和一滴伸長的液滴。第一滴液滴(約2微升；直徑為2毫米)用于洗滌移液管(Hepes-CZB，含有12％[w／v]PVP，平均分子量為360000道爾頓)。第二滴(約2微升；直徑為2毫米)是如上所述制得的含有重新水化的冷凍干燥的精子的CZB或DMEM懸液。第三滴伸長的液滴(6微升；寬2毫米，長6毫米)是用于卵母細胞的Hepes-CZB培養(yǎng)液。這些液滴的每一滴用礦物油(Squibb andsons)覆蓋。將平皿置于倒置顯微鏡相差鏡頭的載物臺上。
用前面描述的壓電顯微注射儀方法，采用Prime Tech Ltd．(Tsukuba，Ibaraki-ken，Japan)的MB-U型壓電操作儀，將精子胞核顯微注射入卵母細胞中。該單元采用壓電效應(yīng)來使移液管夾持器以非常高的速度推進非常小的距離(例如0．5微米)。脈沖的強度和速度由控制儀來調(diào)控。
為了注射入上述制得的卵母細胞內(nèi)，將單個精子(首先是尾部)吸入已經(jīng)和壓電移液管驅(qū)動單元相連的注射移液管(嘴部內(nèi)徑約5微米)中。向精子頸部區(qū)域施加一個或數(shù)個壓電脈沖，使精子頭部和尾部分開。脈沖的強度和速度(頻率)由控制儀PMAS-CT01(控制儀設(shè)定等級強度2，速度1)調(diào)控。然后將頭部深深吸入移液管內(nèi)，將少量(約0．5微升)水銀置于注射移液管的毗鄰端。
同時，將成熟的未受精的卵母細胞置于顯微鏡載物臺上的Hepes-CZB培養(yǎng)液內(nèi)。用夾持移液管夾持卵母細胞，使注射移液管嘴部在3點鐘位置與透明帶緊密接觸。施加數(shù)個壓電脈沖(強度為1-2，速度為1-2)，以推進移液管，同時向其施加稍稍的負壓。當(dāng)移液管嘴部通過透明帶后，就將嘴內(nèi)透明帶圓柱狀片段擠入卵黃周隙。在將精子頭部向前推至靠近移液管嘴后，用機械方式推進移液管，直至其嘴部幾乎到達卵母細胞皮質(zhì)的對側(cè)。施加1或2次壓電脈沖(強度為1-2，速度為1)，刺破卵膜，將精子頭部和最少量(約6pL)伴隨的精子懸浮培養(yǎng)液擠入卵質(zhì)中。在盡可能多地取回培養(yǎng)液后，輕輕抽出移液管，使精子頭部留在卵質(zhì)內(nèi)。所有注射在精子重新水化1小時以內(nèi)在Hepes-CZB中室溫下(23-27℃)進行。每個卵母細胞注射一個精子頭部。用該方法在10-15分鐘內(nèi)可顯微注射約5-20個卵母細胞。
實施例7卵母細胞的檢查和胚胎轉(zhuǎn)移在含5％CO2的空氣內(nèi)，將注射了精子頭部的卵母細胞37℃培育在CZB內(nèi)，5-6小時后用倒置顯微鏡檢查。具有兩個明顯的前核和第二個極體的那些卵母細胞被認為是正常受精的，讓它們在CZB中培養(yǎng)4天。將達到桑椹胚或胚泡階段的那些受精卵轉(zhuǎn)移到受體CD-1雌鼠(白化體)的子宮角內(nèi)，該雌鼠在3天前已經(jīng)和切除輸精管的CD-1雄鼠交配過，以使胚胎發(fā)育階段與子宮內(nèi)膜的階段同步。將平均數(shù)目為八個的桑椹胚／胚泡轉(zhuǎn)移到每個子宮角內(nèi)。使雌鼠接生和喂養(yǎng)其代孕的后代(有黑色、棕色或灰色的皮毛)。隨機選出一些成熟的雄性和雌性后代并交配以檢查它們的生育力。
結(jié)果重新水化的、冷凍干燥的精子的顯微鏡檢查用顯微鏡觀察重新水化的精子，結(jié)果顯示100％的精子不能游動。用能區(qū)分質(zhì)膜完整的(活的)或質(zhì)膜受損傷的(死的)細胞的市售的細胞生存力測試試劑盒 (Live／deadFertiLight，Molecular Probes，Eugene，Oregon)，根據(jù)UV顯微鏡下的熒光圖案來評價精子存活力。具有完整質(zhì)膜的“活的”精子的胞核呈綠色熒光，而“死”的精子胞核呈亮橙紅色熒光。在冷凍干燥和重新水化后，檢查來自四只雄鼠的10000個以上的精子。經(jīng)該試驗評價，所有檢查的精子均是“死的”。
注射了冷凍干燥精子頭部的小鼠卵母細胞的發(fā)育如表1所述，1353個卵母細胞中有1236個(91．4％)在顯微外科手術(shù)注射后存活，在存活者中，有1157個(93．6％)被精子胞核激活并正常受精，不論精子懸浮培養(yǎng)液是CZB還是DMEM，保藏溫度為25℃還是4℃，保藏時間為1天、2周、1個月還是3個月。
在這些實驗中，安瓿的最長保藏期為4℃3個月。在這些實驗中，來自三只雌鼠的57個卵母細胞中注射了保藏了3個月的精子。95％的經(jīng)注射的卵母細胞在顯微外科手術(shù)后存活，它們均正常受精。91％的受精卵在體外發(fā)育至桑椹胚／胚泡。將46個胚胎中的14個(30％)轉(zhuǎn)移到三只代孕母鼠中發(fā)育成正常的成年鼠。
大多數(shù)(90％-93％)的受精卵(已注射了CZB懸浮的精子頭部，這些精子頭部冷凍干燥后于25℃或4℃保藏了1天至2周，并重新水化)在體外發(fā)育至桑椹胚／胚泡，其中的25-34個(20％-29％)在轉(zhuǎn)移到代孕母鼠體內(nèi)后發(fā)育成正常的后代。盡管注射了在重新水化前25℃下保藏1個月的CZB懸浮的凍干精子的受精卵發(fā)育至桑椹胚／胚泡的百分數(shù)較低(76％)，但其中的16個(18％)在轉(zhuǎn)移到代孕母鼠體內(nèi)后發(fā)育成正常的后代。從受精卵(受精卵中注射了經(jīng)冷凍干燥、4℃下保藏3個月的CZB懸浮的精子頭部)衍生獲得的32個轉(zhuǎn)移胚胎中有9個(28％)發(fā)育成正常的后代。總之，當(dāng)采用CZB懸浮的凍干精子時，在轉(zhuǎn)移562個胚胎(從顯微外科手術(shù)中存活并正常受精的664個卵母細胞發(fā)育而來)后，總共產(chǎn)生143個活的后代，總成功率為21．5％。
在注射了冷凍干燥后于25℃保藏1天至1個月或4℃最多3個月的DMEM懸浮的精子頭的受精卵中，大多數(shù)(79％-91％)也在體外發(fā)育至桑椹胚／胚泡?？傊瑢@微外科手術(shù)中存活并正常受精的493個卵母細胞發(fā)育而來的326個胚胎轉(zhuǎn)移后，總共產(chǎn)生92個活的后代，總成功率為18．7％。
如圖1b所示，所有后代均正常生長。它們的性別比例約為1∶1。從12個實驗組的每一組中隨機選出兩只完全成長的雌鼠和兩只雄鼠，使它們交配。所有小鼠均表明是能生育的，并生出了數(shù)量正常的幼仔(8-12)。
冷凍干燥的精子的運輸對受精能力的影響在運去運回日本并在返回火奴魯魯后重建的精子中，隨機選出29個精子，分別注射入卵母細胞內(nèi)。23個卵母細胞(79％)存活并正常受精。有19個(83％)體外發(fā)育至桑椹胚／胚泡。在轉(zhuǎn)移到代孕母鼠體內(nèi)后，其中有3個(16％)足月分娩。所有三只小鼠(2只雌鼠和1只雄鼠)長成能生育的成年鼠。
鑒于前述實施例，已經(jīng)證明小鼠精子能在冷凍干燥后保留其遺傳穩(wěn)定性。沒有理由認為其它種類動物(包括無脊椎動物和脊椎動物)的精子行為會有所不同。
盡管本發(fā)明已經(jīng)參照較佳的實施方案作了描述，但應(yīng)理解這并不意味著本發(fā)明局限于所公開的具體形式。相反，這意味著覆蓋了在本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的所有改進和變化形式。
表1注射了冷凍干燥的精子的小鼠卵母細胞的發(fā)育
權(quán)利要求
1．一種冷凍干燥的精子，其特征在于，它在重新水化后能使卵母細胞受精，其中受精的卵母細胞發(fā)育成活的后代。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的冷凍干燥的精子，其中精子包含有頭部和尾部。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的冷凍干燥的精子，其中精子含有分離的頭部。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的冷凍干燥的精子，其中精子頭部是脫膜的頭部，它包含胞核和核周物質(zhì)。
5．根據(jù)權(quán)利要求1所述的冷凍干燥的精子，其中受精的卵母細胞還包含精子的中心體。
6．根據(jù)權(quán)利要求1所述的冷凍干燥的精子，其中精子來自無脊椎動物。
7．根據(jù)權(quán)利要求6所述的冷凍干燥的精子，其中精子來海膽、龍蝦、鮑魚或有殼的水生動物。
8．根據(jù)權(quán)利要求1所述的冷凍干燥的精子，其中精子來自脊椎動物。
9．根據(jù)權(quán)利要求8所述的冷凍干燥的精子，其中精子來自魚類、兩棲動物、爬行動物、鳥類或哺乳動物。
10．根據(jù)權(quán)利要求8所述的冷凍干燥的精子，其中精子來自人類。
11．根據(jù)權(quán)利要求8所述的冷凍干燥的精子，其中精子來自小鼠。
12．根據(jù)權(quán)利要求1所述的冷凍干燥的精子，其中受精的卵母細胞還包含來自非精子供體的外源核酸序列。
13．一種冷凍干燥精子以獲得能使卵母細胞受精產(chǎn)生活后代的精子的方法，該方法包括下列步驟收集活的精子；將精子懸浮在生理性懸浮培養(yǎng)液中；冷凍精子懸液；和將冷凍的精子懸液干燥至水分含量低于1％。
14．根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，該方法還包括使冷凍干燥的精子懸液重新水化的步驟，其中至少一個重新水化的精子能使卵母細胞受精產(chǎn)生活的后代。
15．根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述水分含量低于0．01％。
16．根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述水分含量低于0．001％。
17．根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述水分含量低于0．00001％。
18．根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，該方法還包括在冷凍步驟前使精子脫膜以形成脫膜的精子頭部的步驟。
19．根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中精子來自脊椎動物。
20．根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中精子來自魚類、兩棲動物、爬行動物、鳥類或哺乳動物。
21．根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中精子來自人類。
22．根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中精子來自小鼠。
23．根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中精子來自無脊椎動物。
24．根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中精子來自海膽、龍蝦、鮑魚或有殼的水生動物。
25．根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中冷凍步驟在-196℃下進行10分鐘。
26．根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，該方法還包括在重新水化步驟前將經(jīng)冷凍干燥的精子保藏一段時間的步驟。
27．根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中經(jīng)冷凍干燥的精子保藏在環(huán)境溫度下。
28．根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中經(jīng)冷凍干燥的精子保藏于4℃。
29．根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中經(jīng)冷凍干燥的精子保藏在-20℃或更低溫度下。
30．根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中保藏時間長達3個月。
31．根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中保藏時間長達1年。
32．根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中保藏時間超過1年。
33．一種安瓿，它含有用權(quán)利要求13所述的方法制得的冷凍干燥的精子。
34．一種從經(jīng)重新水化的冷凍干燥的精子受精的卵母細胞產(chǎn)生活的哺乳動物后代的方法，該方法包括下列步驟分離重新水化的冷凍干燥的精子；將精子插入分離的卵母細胞內(nèi)，形成受精的卵母細胞；和使受精的卵母細胞發(fā)育成活的后代。
35．根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述分離步驟包括下列分步驟(ⅰ)收集活的精子；(ⅱ)將精子懸浮在生理性懸浮培養(yǎng)液中；(ⅲ)將精子懸液冷凍；(ⅳ)將冷凍的精子懸液干燥至水分含量低于1％；和(ⅴ)使冷凍干燥的精子懸液重新水化。
36．根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中插入精子的步驟還包括將精子頭部和精子尾部分離，并將精子頭部插入卵母細胞內(nèi)的分步驟。
37．根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中插入步驟通過壓電驅(qū)動的顯微注射來實施。
38．根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中重新水化的冷凍干燥的精子包含脫膜的精子頭部。
39．根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中插入步驟還包括插入精子中心體的分步驟。
40．根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中將精子插入卵母細胞的步驟還包括將非精子衍生的核酸序列插入卵母細胞內(nèi)的分步驟。
41．根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中允許步驟包括允許受精的卵母細胞發(fā)育成胚胎的分步驟；將胚胎植入代孕母親體內(nèi)的分步驟，其中代孕母親生出了活的后代。
42．根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中精子來自脊椎動物。
43．根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中精子來自魚類、兩棲動物、爬行動物、鳥類或哺乳動物。
44．根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中精子來自人類。
45．根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中精子來自小鼠。
46．根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中精子來自無脊椎動物。
47．根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中精子來自海膽、龍蝦、鮑魚或有殼的水生動物。
48．根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中水分含量低于0．01％。
49．根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中水分含量低于0．001％。
50．根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中水分含量低于0．00001％。
51．根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中在重新水化后1至60分鐘內(nèi)注射精子。
全文摘要
本發(fā)明提供一種冷凍干燥精子以獲得至少一個重建精子的方法,精子的頭部(胞核)能使卵母細胞受精產(chǎn)生活的后代。已被冷凍干燥并保藏于室溫真空下的精子的活動力在重新水化后沒有恢復(fù)。它們的質(zhì)膜被破壞,它們在常規(guī)意義上均是“死的”。然而,當(dāng)用顯微外科手術(shù)方法將它們注射入卵母細胞內(nèi)時,它們的胞核轉(zhuǎn)變成雄性前核并參與正常的胚胎發(fā)育。
文檔編號A61K35/48GK1293707SQ99804102
公開日2001年5月2日 申請日期1999年3月18日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月20日
發(fā)明者T·瓦卡雅瑪, R·楊吉麥希 申請人:夏威夷大學(xué)