本發(fā)明屬于胚胎發(fā)育領(lǐng)域，涉及一種小鼠胚胎透明帶去除試劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

透明帶(zonapelluccida，zp)是一層包繞在所有哺乳動物卵母細(xì)胞外圍的非細(xì)胞的糖蛋白結(jié)構(gòu)，對卵子的發(fā)育、受精以及著床前胚胎發(fā)育起著關(guān)鍵性作用。小鼠的透明帶由zp1、zp2、zp3構(gòu)成，與豬和人等其他哺乳動物不盡相同，zp1、zp2和zp3在zp中并非呈雜亂混融狀，而是有其特定構(gòu)型的。通過電鏡分析知，zp3呈重復(fù)的網(wǎng)格狀纖維結(jié)構(gòu)，通過二硫橋的方式將多個zp2·zp3異質(zhì)二聚體連成一串珠狀長鏈；zp1通過形成二聚體連接zp1和zp2，三者相結(jié)合構(gòu)成具有三維構(gòu)型的網(wǎng)格蛋白。ivf(invitrofertilization，體外受精)、體外人工核移植以及其他需要對早期胚胎顯微操作的研究都需要在著床前胚胎即透明帶尚未消失前進(jìn)行，所以透明帶的存在成為上述研究的一種障礙，因此確定一種簡單易行、快速去除透明帶且對胚胎損傷最小的方法可以為上述研究打下良好的基礎(chǔ)。

巴氯芬(baclofen)分子結(jié)構(gòu)為其為γ-氨基丁酸的衍生物，是首個應(yīng)用于臨床的選擇性gabab受體激動劑，分子量為213.5，為白色粉末，熔點約為200℃，熔融時同時分解，溶于熱水，微溶于乙醇、乙醚。對于baclofen的研究，大多數(shù)集中于臨床方面的應(yīng)用，主要是baclofen對神經(jīng)系統(tǒng)和運動系統(tǒng)的鎮(zhèn)痛、解痙作用，有少數(shù)幾個報道則是研究baclofen在胃食管反流病中的治療效果，在其他方面的研究則鮮有報道。

現(xiàn)有比較成熟去除透明帶的方法主要為：酸性臺式液去透明帶法、0.5％鏈酶蛋白酶去透明帶法。但是這些方法普遍存在對胚胎的安全性低，處理速度慢等問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供了一種新型的溶解小鼠透明帶的試劑和方法，其溶解快速，對胚胎的傷害較小，可直接應(yīng)用于體外受精、體外人工核移植等實驗技術(shù)中。

本發(fā)明的目的是通過以下措施實現(xiàn)的：

巴氯芬(baclofen)在溶解小鼠透明帶中的應(yīng)用。

一種去除小鼠透明帶試劑，包括巴氯芬，所述巴氯芬的濃度為300μm-10mm，所述試劑ph為5-6。為了進(jìn)一步減小對胚胎的傷害，并提高溶解速率，所述巴氯芬的濃度為500μm，ph為5.5。

上述去除小鼠透明帶試劑，其制備方法為將巴氯芬溶于pbs溶液中，ph調(diào)整為5.0-6.0，巴氯芬濃度為300μm-10mm。

本發(fā)明的另一目的在于提供利用上述試劑去除小鼠透明帶的方法，包括以下步驟：

(1)獲得小鼠任意時期胚胎并培養(yǎng)；

(2)將上述試劑用微旋移液器或其他微量注射器注向小鼠胚胎透明帶，透明帶立即

(1-2s)溶解；

(3)更換胚胎培養(yǎng)液更換，接續(xù)培養(yǎng)或做其他實驗用。

有益效果

1.本發(fā)明能有效的去除小鼠透明帶，速度快，1-2s內(nèi)即刻可去除透明帶，且透明帶去除后胚胎活力不受影響，可以順利進(jìn)行多胚胎融合，形成超大囊胚。

2.本發(fā)明處理量大，僅需少量試劑就可處理大批對象，溶解20個胚胎只需要500μm的巴氯芬5μl以內(nèi)，成本低，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。

3.ph5-6即可快速溶解透明帶，比傳統(tǒng)的透明帶去除所需ph值更中性，酸性條件要求低。

4.本發(fā)明處理胚胎后直接更換培養(yǎng)液即可得到實驗用胚胎，操作簡單。

附圖說明

圖1采用本發(fā)明去除透明帶試劑有效溶解小鼠透明帶的實物圖1；

圖2采用本發(fā)明去除透明帶試劑有效溶解小鼠透明帶的實物圖2；

圖3采用本發(fā)明去除透明帶試劑溶解透明帶后胚胎發(fā)育活力實驗。

具體實施方式

下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。

實施例1

一種去除小鼠透明帶試劑，ph為5.5，試劑中包含濃度為500μm巴氯芬。該試劑的配制是將巴氯芬溶于pbs溶液中，將ph調(diào)整為5.5，巴氯芬濃度為500μm。

采用所得的去除小鼠透明帶試劑處理小鼠胚胎，包括以下步驟：

1、超排小鼠：下午13時對小鼠超數(shù)排卵：經(jīng)腹腔注射pmsg10iu/只，48h后，經(jīng)腹腔注射hcg10iu/只。注射hcg后，按雌雄鼠2∶1合籠，次日上午8時檢查雌鼠，通過檢查是否有陰道栓以確定受精母鼠。

2、獲取胚胎：確定受精母鼠的當(dāng)天上午，將受精母鼠快速并人道的利用頸椎脫臼法處死，在無菌條件下，打開小鼠腹腔，用小剪刀取出輸卵管以及部分靠近輸卵管的子宮，置于m2培養(yǎng)液中。解剖顯微鏡下觀察，找到膨大的輸卵管壺腹部，用針頭撕破壺腹部，即有被卵丘細(xì)胞包圍的合子團(tuán)流出。將合子移至透明質(zhì)酸酶溶液(用m2稀釋到0.3mg/ml)中，在解剖鏡下觀察，見卵丘細(xì)胞脫掉立即將受精卵轉(zhuǎn)移到含新鮮fhm操作液中，洗3-5次，以去除殘留的透明質(zhì)酸酶、卵丘細(xì)胞以及雜質(zhì)。

3、胚胎培養(yǎng)：在50mm小皿中制作6-9個kmso培養(yǎng)液滴，每個液滴約含有30ul培養(yǎng)液，隨后蓋上液體石蠟，將上一步獲取的胚胎轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液滴中，每個液滴約含20個胚胎。

4、去除透明帶：用微旋移液器或口吸管將胚胎溶解液注入培養(yǎng)液滴中(濃度為500μm，注射量為2μl。

實驗結(jié)果：

1.胚胎透明帶去除情況如圖1和圖2所示。圖1中(a)為帶有透明帶的小鼠胚胎(8細(xì)胞期)，(b)為用巴氯芬液去除小鼠透明帶的小鼠胚胎(8細(xì)胞期)。圖2(a-f)為間隔1s連續(xù)拍照，可見胚胎透明帶迅速溶解(1-2s)。

2.溶解透明帶后胚胎活力實驗

溶解透明帶后繼續(xù)培養(yǎng)，實現(xiàn)了多胚胎融合如圖3所示，處理組透明帶溶解之后半小時后再換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，于24h形成多胚胎融合，48h形成超大囊胚，證明其活力良好。(a)處理組用透明帶溶解液處理后的胚胎，透明帶已經(jīng)去除；(b)處理組24h之后可見胚胎聚團(tuán)正在融合；(c)48h后發(fā)育為一個特大囊胚；(d)對照組：上為正在脫帶的正常囊胚，下為還未脫帶的正常囊胚。

處理組為實驗組，注入本發(fā)明去除小鼠透明帶試劑。對照組所加試劑為pbs，其余培養(yǎng)條件均與實驗組相同。

最后說明的是，以上優(yōu)選實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。

技術(shù)特征：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種新型的溶解小鼠透明帶的試劑，包括巴氯芬，所述巴氯芬的濃度為300μM?10mM，所述試劑pH為5?6。本發(fā)明處理小鼠透明帶溶解快速，PH值高，對胚胎的傷害較小，可應(yīng)用于體外受精、體外人工核移植等實驗技術(shù)中。

技術(shù)研發(fā)人員：梁浩;葛良鵬;孫靜;吳夢
受保護(hù)的技術(shù)使用者：重慶市畜牧科學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：2017.06.15
技術(shù)公布日：2017.08.11