本發(fā)明屬于動物繁殖技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于農(nóng)業(yè)-畜牧獸醫(yī)繁殖的技術(shù)，具體涉及牛體外受精胚胎培養(yǎng)液在牛體外受精胚胎培養(yǎng)中的應(yīng)用。進(jìn)一步的，本發(fā)明還涉及使用該牛體外受精胚胎培養(yǎng)液進(jìn)行牛體外受精胚胎培養(yǎng)的方法。
背景技術(shù)：
體外受精(invitrofertilization)或(externalfertilization)是指哺乳動物的精子和卵子在體外人工控制的環(huán)境中完成受精過程的技術(shù)，英文簡稱為ivf。由于它與胚胎移植技術(shù)(et)密不可分，又簡稱為ivf-et。在生物學(xué)中，把體外受精胚胎移植到母體后獲得的動物稱試管動物(test-tubeanimal)。這項技術(shù)成功于20世紀(jì)50年代，在最近20年發(fā)展迅速，現(xiàn)已日趨成熟而成為一項重要而常規(guī)的動物繁殖生物技術(shù)。
體外受精技術(shù)對動物生殖機理研究、畜牧生產(chǎn)、醫(yī)學(xué)和瀕危動物保護等具有重要意義。如用小鼠、大鼠或家兔等作實驗材料，體外受精技術(shù)可用于研究哺乳動物配子發(fā)生、受精和胚胎早期發(fā)育機理。在家畜品種改良中，體外受精技術(shù)為胚胎生產(chǎn)提供了廉價而高效的手段，對充分利用優(yōu)良品種資源，縮短家畜繁殖周期，加快品種改良速度等有重要價值。在人類，ivf-et技術(shù)是治療某些不孕癥和克服性連鎖病的重要措施之一。體外受精技術(shù)還是哺乳動物胚胎移植、克隆、轉(zhuǎn)基因和性別控制等現(xiàn)代生物技術(shù)不可缺少的組成部分。
隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技的發(fā)展，為了更充分利用良種母牛的繁殖潛力，加速遺傳育種進(jìn)程，在生產(chǎn)實踐中應(yīng)用高效的繁殖新技術(shù)成為必然。活體采卵(ovumpickup，opu)和體外受精技術(shù)(invitrofertilization，ivf)是二十世紀(jì)八十年代快速發(fā)展起來的胚胎工程新技術(shù)，二者相結(jié)合可獲得大量遺傳系譜明確的胚胎，從而縮短世代間隔。目前，這兩種技術(shù)已經(jīng)成為歐美和大洋洲等畜牧業(yè)發(fā)達(dá)國家的農(nóng)場主為擴大良種母牛群而采用的重要繁殖技術(shù)。然而，采用常規(guī)的牛胚胎培養(yǎng)體系(cr1aa和sof液)，牛體外受精的囊胚發(fā)育率較低，而且胚胎質(zhì)量也遠(yuǎn)不及體內(nèi)胚胎，導(dǎo)致胚胎移植受體后的妊娠率低，因此如何提高囊胚發(fā)育率及胚胎質(zhì)量成為體外受精胚胎生產(chǎn)的重點和研究的焦點。
早在1878年，德國人scnenk就以家兔和豚鼠為材料，開始探索哺乳動物的體外受精技術(shù)。但直到1951年，美籍華人張民覺和austin分別發(fā)現(xiàn)精子體外獲能現(xiàn)象后，體外受精技術(shù)才獲得了突破性進(jìn)展。牛體外受精技術(shù)受到卵母細(xì)胞的體外成熟、精子的體外獲能、受精卵的體外培養(yǎng)環(huán)境等多個方面的影響。
胚胎的體外培養(yǎng)是ivf技術(shù)的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，亦是卵母細(xì)胞體外成熟和體外受精技術(shù)最終效果的體現(xiàn)和檢驗。在體外受精后，受精卵在向囊胚發(fā)育過程中將需經(jīng)歷一系列重要的變化，包括合子的形成、第一次卵裂、胚胎基因組的激活、致密化以及形成囊胚。這一過程中，外界環(huán)境的變化會導(dǎo)致基因表達(dá)發(fā)生改變，從而影響胚胎的正常發(fā)育及質(zhì)量。目前，哺乳動物早期胚胎的體外培養(yǎng)研究主要集中在改善培養(yǎng)液成分以滿足不同發(fā)育階段的胚胎營養(yǎng)需求。基于rosenkrans等(rosenkrans，c.f.，jr.andn.l.first，effectoffreeaminoacidsandvitaminsoncleavageanddevelopmentalrateofbovinezygotesinvitro.janimsci，1994.72(2):p.434-7)開發(fā)的charlesrosenkrans1(cr1)培養(yǎng)液和tervit等(tervit，h.r.，d.g.whittingham，andl.e.rowson,successfulcultureinvitroofsheepandcattleova.jreprodfertil,1972.30(3):p.493-7)開發(fā)的合成輸卵管液(syntheticoviductalfluid，sof)，經(jīng)多年不斷改進(jìn)逐步形成了兩種培養(yǎng)體系。據(jù)hakansagirkaya等(sagirkaya,h.,etal.,developmentalpotentialofbovineoocytesculturedindifferentmaturationandcultureconditions.animreprodsci,2007.101(3-4):p.225-40)和somfai等(somfai,t.,etal.,developmentofbovineembryosculturedincr1aaandivd101mediausingdifferentoxygentensionsandculturesystems.actavethung,2010.58(4):p.465-74)研究成果表明，cr1aa培養(yǎng)液用于牛胚胎培養(yǎng)有較好的效果，可以廣泛應(yīng)用于牛的胚胎培養(yǎng)；thompson,j.g.等(thompson,j.g.,etal.,effectofinhibitorsanduncouplersofoxidativephosphorylationduringcompactionandblastulationofbovineembryosculturedinvitro.jreprodfertil,2000.118(1):p.47-55)和jeanm.feugang等(feugang,j.m.,o.camargo-rodriguez,ande.memili,culturesystemsforbovineembryos.livestockscience,2009.121(2-3):p.141-149)的研究結(jié)果顯示，sof培養(yǎng)液也是一種適合于牛胚胎培養(yǎng)的培養(yǎng)體系。張志平等(張志平,安志興,張銹,張涌,牛胚胎培養(yǎng)體系的優(yōu)化.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報,2006.34)和桑國俊等(桑國俊,牛卵母細(xì)胞及體外胚培養(yǎng)技術(shù)研究.2008)研究結(jié)果也顯示，經(jīng)過優(yōu)化的cr1aa和sof培養(yǎng)液均適合于牛的體外胚胎培養(yǎng)，均取得良好的培養(yǎng)效果。哺乳動物早期胚胎發(fā)育是一個高度協(xié)調(diào)且精確調(diào)節(jié)的過程。在進(jìn)化過程中，配子細(xì)胞逐步形成了一系列的分子級聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，以保證胚胎發(fā)育周期系統(tǒng)地進(jìn)行。在發(fā)育過程中，胚胎的內(nèi)外活性氧自由基(reactiveoxygenspecies，ros)與抗氧化劑的平衡對早期胚胎發(fā)育起著決定性作用。
大多生化反應(yīng)均產(chǎn)生ros，其在細(xì)胞內(nèi)、外均有著重要的作用，一部分ros起著信號分子的作用，但是大多數(shù)ros對機體是有害的。brooker,r.j.等(brooker,r.j.,genetics:analysisandprinciples(4thed.).mcgraw-hillscience,2011)報道，ros可以引起細(xì)胞dna損傷、不飽和脂肪酸的氧化、蛋白質(zhì)中氨基酸的氧化甚至可以導(dǎo)致某些酶的失活。一般來說，ros以四種形式存在，其中h2o2氧化作用較強，是引起氧化傷害的最主要因素。
大量研究表明，谷胱甘肽(gsh)是以非蛋白質(zhì)形式存在的一種抗氧化劑，能夠清除多種自由基：超氧陰離子自由基、羥基自由基、過氧化氫、次氯酸和脂氧自由基，并且能夠維持細(xì)胞內(nèi)外氧化還原平衡。細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境gsh和ros水平是影響受精卵發(fā)育過程中的兩個重要因素。早在2000年，dematos等(dematos,d.g.andc.c.furnus,theimportanceofhavinghighglutathione(gsh)levelafterbovineinvitromaturationonembryodevelopmenteffectofbeta-mercaptoethanol,cysteineandcystine.theriogenology,2000.53(3):p.761-71)曾通過在體外胚胎培養(yǎng)過程中添加β-巰基乙醇、半胱氨酸和胱氨酸來提高囊胚率。
盡管體外受精技術(shù)能成功應(yīng)用于許多哺乳動物，但由于體外受精的囊胚率低而導(dǎo)致體外受精胚胎的生產(chǎn)成本高、效率低，限制了該技術(shù)在牛快速擴繁實踐中的廣泛應(yīng)用。因此，如何能夠降低成本并提高牛ivf胚胎生產(chǎn)效率和胚胎質(zhì)量成為亟待解決的問題。
目前，牛體外受精的技術(shù)體系中主要以cr1aa和sof液為胚胎體外培養(yǎng)液，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，囊胚發(fā)育率均有不同程度的提高，囊胚發(fā)育率平均為30％-40％。對于囊胚質(zhì)量，可以通過囊胚細(xì)胞總數(shù)、icm細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)比例、細(xì)胞凋亡率來評估。囊胚細(xì)胞總數(shù)根據(jù)囊胚所處階段的不同而不同，s.iwasaki等(iwasaki,s.andt.nakahara,cellnumberandincidenceofchromosomalanomaliesinbovineblastocystsfertilizedinvitrofollowedbycultureinvitroorinvivoinrabbitoviducts.theriogenology,1990.33(3):p.669-75)獲得的牛早期囊胚總細(xì)胞數(shù)平均為44，icm細(xì)胞數(shù)/囊胚總細(xì)胞數(shù)比例為15.8％左右；andrewj.watson等(watson,a.j.,etal.,impactofbovineoocytematurationmediaonoocytetranscriptlevels,blastocystdevelopment,cellnumber,andapoptosis.biolreprod,2000.62(2):p.355-64)統(tǒng)計牛囊胚細(xì)胞凋亡率約為7.7％-13％。
cn103898046b(中國專利申請?zhí)?01410073635.4)公開了一種專用于牛體外受精胚胎的培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)液配方為：nacl109.5mm、kcl3.1mm、nahco326.2mm、mgcl2·6h2o0.8mm、kh2po31.19mm、丙酮酸鈉0.4mm、葡萄糖1.5mm、半乳糖酸鈣5mm、10v/v％胎牛血清、l-谷氨酰胺1mm、2v/v％必需氨基酸、1v/v％非必須氨基酸和谷胱甘肽3mm，以水配制；所述必需氨基酸為以下氨基酸按比例混合后配制的水溶液，其中，各氨基酸含量為：l-鹽酸精氨酸6.32g/l、l-胱氨酸二鹽酸鹽1.564g/l、l-鹽酸組氨酸一水物2.1g/l、l-異亮氨酸2.625g/l、l-亮氨酸2.62g/l、l-賴氨酸鹽酸鹽3.625g/l、l-蛋氨酸0.755g/l、l-苯丙氨酸1.65g/l、l-蘇氨酸2.38g/l、l-色氨酸0.51g/l、l-酪氨酸1.8g/l和l-纈氨酸2.34g/l；所述非必須氨基酸為以下氨基酸按比例混合后配制的水溶液，其中，各氨基酸含量為：l-丙氨酸0.89g/l、l-天門冬酰胺一水物1.5g/l、l-天冬氨酸1.33g/l、l-谷氨酸1.47g/l、甘氨酸0.75g/l、l-脯氨酸1.15g/l和l-絲氨酸1.05g/l。將牛體外受精胚胎置于上述培養(yǎng)液中進(jìn)行體外培養(yǎng)，據(jù)信結(jié)果顯示明顯優(yōu)于未添加gsh的對照組，提高了囊胚發(fā)育率及胚胎質(zhì)量，降低體外生產(chǎn)胚胎的成本，為牛ivf技術(shù)應(yīng)用于實踐提供實驗基礎(chǔ)，可大大加速遺傳育種進(jìn)程。
其他參考文獻(xiàn)：
陳大元.受精生物學(xué).2003,北京:科學(xué)出版社；
方俊順.牛胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)研究.《中國優(yōu)秀碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫.農(nóng)業(yè)科技輯》.2007,(第4期)；
曹海清.卵丘細(xì)胞和培養(yǎng)條件對牛體外胚胎生產(chǎn)效率的影響.《中國優(yōu)秀碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫.農(nóng)業(yè)科技輯》.2008,(第9期)；
i.h.kimetal.effectofexogenousglutathioneontheinvitrofertilizationofbovineoocytes.theriogenology.1999,vol.52(3)。
然而，本領(lǐng)域仍然期待有性能改進(jìn)的牛體外受精胚胎的培養(yǎng)的方法。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種性能改進(jìn)的牛體外受精胚胎的培養(yǎng)的方法，特別是期待提高牛ivf胚胎生產(chǎn)效率和胚胎質(zhì)量。更具體的，本發(fā)明為達(dá)成上述目的而需要提供一種專用于牛體外受精胚胎的培養(yǎng)液和以及使用該培養(yǎng)進(jìn)行牛體外受精胚胎培養(yǎng)的方法。本發(fā)明人已經(jīng)出人意料的發(fā)現(xiàn)，使用本發(fā)明方法呈現(xiàn)優(yōu)異的技術(shù)效果，本發(fā)明因此發(fā)現(xiàn)而得以完成。
為此，本發(fā)明第一方面提供了一種牛體外受精胚胎的培養(yǎng)方法，該方法包括如下步驟：
將牛體外受精胚胎置于牛體外受精胚胎培養(yǎng)液中，在38.5℃、0.5％co2、100％濕度條件下進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，其中胚胎體外培養(yǎng)包括如下步驟：
(1)精卵共孵育8h后，取出卵母細(xì)胞，使用1mg/ml的透明質(zhì)酸酶消化處理3min，然后使用移液槍反復(fù)吹打，直至卵丘細(xì)胞基本脫落；
(2)使用含10％fbs的tcm199終止透明質(zhì)酸酶的消化，用口吸管將疑似受精卵在添加有牛血清白蛋白(通常亦縮寫為bsa)的胚胎前期培養(yǎng)液中洗3次后，放入胚胎前期培養(yǎng)液滴中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為38.5℃、0.5％co2、100％濕度；
(3)48h后，將卵裂至4-8細(xì)胞的胚胎移至胚胎后期培養(yǎng)液(其即為本發(fā)明的牛體外受精胚胎培養(yǎng)液)滴中進(jìn)行培養(yǎng)(培養(yǎng)條件為38.5℃、0.5％co2、100％濕度)，48h后半量更換胚胎后期培養(yǎng)液并繼續(xù)培養(yǎng)(38.5℃，5％co2氣體，95％濕度)；
(4)以受精當(dāng)天為0天開始計時，至第7天時統(tǒng)計囊胚率，至第9天時統(tǒng)計囊胚孵化率(其為孵化囊胚數(shù)除以囊胚數(shù)所得百分?jǐn)?shù))。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，所述牛體外受精胚胎培養(yǎng)液中包含：
109-110mm的nacl、
2.9-3.1mm的kcl、
26.0-26.5mm的nahco3、
0.5-1.0mm的mgcl2·6h2o、
1.0-1.3mm的kh2po3、
0.4mm的丙酮酸鈉、
1.5mm的葡萄糖、
5mm的半乳糖酸鈣、
10v/v％的胎牛血清、
1mm的l-谷氨酰胺、
2v/v％的必需氨基酸、
1v/v％的非必須氨基酸、
1-10mm的谷胱甘肽、和
作為配液溶劑的水。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，所述牛體外受精胚胎培養(yǎng)液中包含：
109mm的nacl、
3.1mm的kcl、
26.2mm的nahco3、
0.8mm的mgcl2·6h2o、
1.19mm的kh2po3、
0.4mm的丙酮酸鈉、
1.5mm的葡萄糖、
5mm的半乳糖酸鈣、
10v/v％的胎牛血清、
1mm的l-谷氨酰胺、
2v/v％的必需氨基酸、
1v/v％的非必須氨基酸、
1-10mm的谷胱甘肽、和
作為配液溶劑的水。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，所述牛體外受精胚胎培養(yǎng)液中的所述必需氨基酸是由以下氨基酸按比例和濃度配制所得的水溶液：
l-鹽酸精氨酸6.32g/l、
l-胱氨酸二鹽酸鹽1.564g/l、
l-鹽酸組氨酸一水物2.1g/l、
l-異亮氨酸2.625g/l、
l-亮氨酸2.62g/l、
l-賴氨酸鹽酸鹽3.625g/l、
l-蛋氨酸0.755g/l、
l-苯丙氨酸1.65g/l、
l-蘇氨酸2.38g/l、
l-色氨酸0.51g/l、
l-酪氨酸1.8g/l、和
l-纈氨酸2.34g/l。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，所述牛體外受精胚胎培養(yǎng)液中的所述非必需氨基酸是由以下氨基酸按比例和濃度配制所得的水溶液：
l-丙氨酸0.89g/l、
l-天門冬酰胺一水物1.5g/l、
l-天冬氨酸1.33g/l、
l-谷氨酸1.47g/l、
甘氨酸0.75g/l、
l-脯氨酸1.15g/l、和
l-絲氨酸1.05g/l。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，其中所述培養(yǎng)液中谷胱甘肽的濃度為1～7mm。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，其中所述培養(yǎng)液中谷胱甘肽的濃度為3～5mm。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，其中所述培養(yǎng)液中谷胱甘肽的濃度為1mm、3mm、5mm或7mm。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，其中所述培養(yǎng)液中谷胱甘肽的濃度為3mm或5mm。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，其中所述培養(yǎng)液中谷胱甘肽的濃度為3mm。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，所述牛體外受精胚胎培養(yǎng)液中還包含枸櫞酸鈉和麥芽糖。在一個實施方案中，所述牛體外受精胚胎培養(yǎng)液中枸櫞酸鈉和麥芽糖的濃度分別為0.03～0.05w/v％和0.01～0.03w/v％。在一個實施方案中，所述牛體外受精胚胎培養(yǎng)液中枸櫞酸鈉和麥芽糖的濃度分別為0.04w/v％和0.02w/v％。已經(jīng)出人意料的發(fā)現(xiàn)，在牛體外受精胚胎培養(yǎng)液中同時添加微量的枸櫞酸鈉和麥芽糖時，有助于提高囊胚孵化率，并且其它指標(biāo)不受影響。囊胚孵化率是囊胚質(zhì)量的重要評價指標(biāo)，在其它指標(biāo)不受影響的前提下提高囊胚孵化率，對于牛體外受精胚胎培養(yǎng)工作具有重要意義。
進(jìn)一步的，本發(fā)明第二方面提供了一種牛體外受精胚胎培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液包含：
109-110mm的nacl、
2.9-3.1mm的kcl、
26.0-26.5mm的nahco3、
0.5-1.0mm的mgcl2·6h2o、
1.0-1.3mm的kh2po3、
0.4mm的丙酮酸鈉、
1.5mm的葡萄糖、
5mm的半乳糖酸鈣、
10v/v％的胎牛血清、
1mm的l-谷氨酰胺、
2v/v％的必需氨基酸、
1v/v％的非必須氨基酸、
1-10mm的谷胱甘肽、和
作為配液溶劑的水。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的牛體外受精胚胎培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液包含：
109mm的nacl、
3.1mm的kcl、
26.2mm的nahco3、
0.8mm的mgcl2·6h2o、
1.19mm的kh2po3、
0.4mm的丙酮酸鈉、
1.5mm的葡萄糖、
5mm的半乳糖酸鈣、
10v/v％的胎牛血清、
1mm的l-谷氨酰胺、
2v/v％的必需氨基酸、
1v/v％的非必須氨基酸、
1-10mm的谷胱甘肽、和
作為配液溶劑的水。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的牛體外受精胚胎培養(yǎng)液，其中所述必需氨基酸是由以下氨基酸按比例和濃度配制所得的水溶液：
l-鹽酸精氨酸6.32g/l、
l-胱氨酸二鹽酸鹽1.564g/l、
l-鹽酸組氨酸一水物2.1g/l、
l-異亮氨酸2.625g/l、
l-亮氨酸2.62g/l、
l-賴氨酸鹽酸鹽3.625g/l、
l-蛋氨酸0.755g/l、
l-苯丙氨酸1.65g/l、
l-蘇氨酸2.38g/l、
l-色氨酸0.51g/l、
l-酪氨酸1.8g/l、和
l-纈氨酸2.34g/l。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的牛體外受精胚胎培養(yǎng)液，其中所述非必需氨基酸是由以下氨基酸按比例和濃度配制所得的水溶液：
l-丙氨酸0.89g/l、
l-天門冬酰胺一水物1.5g/l、
l-天冬氨酸1.33g/l、
l-谷氨酸1.47g/l、
甘氨酸0.75g/l、
l-脯氨酸1.15g/l、和
l-絲氨酸1.05g/l。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的牛體外受精胚胎培養(yǎng)液，其中所述培養(yǎng)液中谷胱甘肽的濃度為1～7mm。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的牛體外受精胚胎培養(yǎng)液，其中所述培養(yǎng)液中谷胱甘肽的濃度為3～5mm。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的牛體外受精胚胎培養(yǎng)液，其中所述培養(yǎng)液中谷胱甘肽的濃度為1mm、3mm、5mm或7mm。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的牛體外受精胚胎培養(yǎng)液，其中所述培養(yǎng)液中谷胱甘肽的濃度為3mm或5mm。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的牛體外受精胚胎培養(yǎng)液，其中所述培養(yǎng)液中谷胱甘肽的濃度為3mm。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的牛體外受精胚胎培養(yǎng)液，其中還包含枸櫞酸鈉和麥芽糖。在一個實施方案中，所述牛體外受精胚胎培養(yǎng)液中枸櫞酸鈉和麥芽糖的濃度分別為0.03～0.05w/v％和0.01～0.03w/v％。在一個實施方案中，所述牛體外受精胚胎培養(yǎng)液中枸櫞酸鈉和麥芽糖的濃度分別為0.04w/v％和0.02w/v％。已經(jīng)出人意料的發(fā)現(xiàn)，在牛體外受精胚胎培養(yǎng)液中同時添加微量的枸櫞酸鈉和麥芽糖時，有助于提高囊胚孵化率，并且其它指標(biāo)不受影響。
本發(fā)明任一方面或該任一方面的任一實施方案所具有的任一技術(shù)特征同樣適用其它任一實施方案或其它任一方面的任一實施方案，只要它們不會相互矛盾，當(dāng)然在相互之間適用時，必要的話可對相應(yīng)特征作適當(dāng)修飾。下面對本發(fā)明的各個方面和特點作進(jìn)一步的描述。
本發(fā)明所引述的所有文獻(xiàn)，它們的全部內(nèi)容通過引用并入本文，并且如果這些文獻(xiàn)所表達(dá)的含義與本發(fā)明不一致時，以本發(fā)明的表述為準(zhǔn)。此外，本發(fā)明使用的各種術(shù)語和短語具有本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的一般含義，即便如此，本發(fā)明仍然希望在此對這些術(shù)語和短語作更詳盡的說明和解釋，提及的術(shù)語和短語如有與公知含義不一致的，以本發(fā)明所表述的含義為準(zhǔn)。
本發(fā)明使用的胎牛血清可以容易的從市場購得其標(biāo)準(zhǔn)化商品形式，例如可以從各種代理商處購得gibco公司的澳洲胎牛血清(貨號：10099141)、新西蘭胎牛血清(貨號：10091148)、北美胎牛血清(貨號：16000044)、墨西哥胎牛血清(貨號：10437028)等，這些商品化胎牛血清的價格500ml大多在8000元以上，用于本發(fā)明牛體外受精胚胎培養(yǎng)液中時胎牛血清是成本主要貢獻(xiàn)者。在本發(fā)明上下文的試驗中，如未特別說明，所用的胎牛血清是gibco公司的澳洲胎牛血清(貨號：10099141)。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點：本發(fā)明通過在培養(yǎng)液中添加一定濃度的谷胱甘肽(glutathione，gsh)，能顯著提高體外胚胎的發(fā)育能力。同時對囊胚進(jìn)行差異染色，區(qū)分內(nèi)細(xì)胞團(innercellmass，icm)、滋養(yǎng)層細(xì)胞和凋亡細(xì)胞，比較總細(xì)胞數(shù)，并計算icm細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)比例和凋亡率，結(jié)果顯示添加gsh的試驗組優(yōu)于對照組，提高了囊胚發(fā)育率及胚胎質(zhì)量，降低體外生產(chǎn)胚胎的成本，為牛ivf技術(shù)應(yīng)用于實踐提供實驗基礎(chǔ)，可大大加速遺傳育種進(jìn)程。另外，已經(jīng)出人意料的發(fā)現(xiàn)，使用具有本發(fā)明配方的牛體外受精胚胎培養(yǎng)液能夠顯著提高提高囊胚孵化率，并且其它指標(biāo)不受影響，囊胚孵化率是囊胚質(zhì)量的重要評價指標(biāo)，在其它指標(biāo)不受影響的前提下提高囊胚孵化率，對于牛體外受精胚胎培養(yǎng)工作具有重要意義。
具體實施方式
通過下面的實施例可以對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述，然而，本發(fā)明的范圍并不限于下述實施例。本領(lǐng)域的專業(yè)人員能夠理解，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可以對本發(fā)明進(jìn)行各種變化和修飾。本發(fā)明對試驗中所使用到的材料以及試驗方法進(jìn)行一般性和/或具體的描述。雖然為實現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的許多材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的，但是本發(fā)明仍然在此作盡可能詳細(xì)描述。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
實施例1：牛體外受精胚胎的培養(yǎng)方法
一、試劑
成熟培養(yǎng)液：含0.01iu/ml的fsh、10iu/ml的lh、1μg/ml雌二醇、100ng/ml的igf、50ng/ml的egf、100u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、10％胎牛血清的tcm-199培養(yǎng)液。
洗精液：含112.0mm的nacl、4.02mm的kcl、2.25mm的cacl2·2h2o、0.52mm的mgcl2·6h2o、0.83mm的kh2po3、37.0mm的nahco3、1.25mm的丙酮酸鈉、10μg/ml的肝素、4mg/ml的牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，bsa)、10mm的咖啡因、100u/ml的青霉素、100μg/ml的鏈霉素的水溶液。
受精液：含112.0mm的nacl、4.02mm的kcl、2.25mm的cacl2·2h2o、0.52mm的mgcl2·6h2o、0.83mm的kh2po3、37.0mm的nahco3、1.25mm的丙酮酸鈉、10μg/ml的肝素、4mg/ml的bsa、100u/ml的青霉素、100μg/ml的鏈霉素的水溶液。
胚胎前期培養(yǎng)液：含109.5mm的nacl、3.1mm的kcl、26.2mm的nahco3、0.8mm的mgcl2·6h2o、1.19mm的kh2po3、0.4mm的丙酮酸鈉、1.5mm的葡萄糖、5mm的半乳糖酸鈣、6mg/ml的bsa、1mm的l-谷氨酰胺、2v/v％必需氨基酸、1v/v％非必須氨基酸的水溶液。
胚胎后期培養(yǎng)液：含109.5mm的nacl、3.1mm的kcl、26.2mm的nahco3、0.8mm的mgcl2·6h2o、1.19mm的kh2po3、0.4mm的丙酮酸鈉、1.5mm的葡萄糖、5mm的半乳糖酸鈣、10v/v％胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)、1mm的l-谷氨酰胺、2v/v％必需氨基酸、1v/v％非必須氨基酸的水溶液。
所述必需氨基酸為以下氨基酸按比例/濃度配制的水溶液，其中，各氨基酸含量為：l-鹽酸精氨酸6.32g/l、l-胱氨酸二鹽酸鹽1.564g/l、l-鹽酸組氨酸一水物2.1g/l、l-異亮氨酸2.625g/l、l-亮氨酸2.62g/l、l-賴氨酸鹽酸鹽3.625g/l、l-蛋氨酸0.755g/l、l-苯丙氨酸1.65g/l、l-蘇氨酸2.38g/l、l-色氨酸0.51g/l、l-酪氨酸1.8g/l和l-纈氨酸2.34g/l。
所述非必須氨基酸為以下氨基酸按比例/濃度配制的水溶液，其中，各氨基酸含量為：l-丙氨酸0.89g/l、l-天門冬酰胺一水物1.5g/l、l-天冬氨酸1.33g/l、l-谷氨酸1.47g/l、甘氨酸0.75g/l、l-脯氨酸1.15g/l和l-絲氨酸1.05g/l。
二、卵母細(xì)胞的采集和體外成熟
1.從屠宰場采集牛卵巢，置于37℃生理鹽水中，3h內(nèi)送至實驗室。
2.使用含有青霉素和鏈霉素的溫?zé)岬纳睇}水將卵巢清洗3-5次。
3.使用真空蠕動泵，用18號針頭抽取5-8毫米卵泡中的卵泡液。
4.體視顯微鏡下挑選卵母細(xì)胞-卵丘細(xì)胞復(fù)合體(cocs)，在洗卵液中將cocs洗滌兩次，在成熟培養(yǎng)液中洗滌一次。
5.將洗干凈的cocs放入含有成熟培養(yǎng)液并覆蓋礦物油的四孔板中，每孔培養(yǎng)50枚cocs，培養(yǎng)22-24h。
三、體外受精
1.將cocs從成熟培養(yǎng)液中移入50μl受精滴中，每滴放15枚cocs。
2.38℃水浴解凍精液，使用5ml洗精液在500g條件下離心5min；棄上清，再加入5ml洗精液離心5min，棄上清，使用洗精液調(diào)整精子濃度，使精子濃度約為2×107個/ml。
3.取50μl精液，與含有cocs的受精滴混合成為100μl的液滴。
4.38.5℃，5％co2氣體，95％濕度條件下精卵共孵育8h。
四、胚胎體外培養(yǎng)
1.精卵共孵育8h后，取出卵母細(xì)胞，使用1mg/ml的透明質(zhì)酸酶消化處理3min，然后使用移液槍反復(fù)吹打，直至卵丘細(xì)胞基本脫落。
2.使用含10％fbs的tcm199終止透明質(zhì)酸酶的消化，用口吸管將疑似受精卵在添加有牛血清白蛋白的胚胎前期培養(yǎng)液中洗3次后，放入胚胎前期培養(yǎng)液滴中進(jìn)行培養(yǎng)(38.5℃，5％co2氣體，95％濕度)。
3.48h后，將卵裂至4-8細(xì)胞的胚胎移至胚胎后期培養(yǎng)液滴中進(jìn)行培養(yǎng)(38.5℃，5％co2氣體，95％濕度)，48h后半量更換胚胎后期培養(yǎng)液并繼續(xù)培養(yǎng)(38.5℃，5％co2氣體，95％濕度)。
4.以受精當(dāng)天為0天開始計時，至第7天時統(tǒng)計囊胚率，至第9天時統(tǒng)計囊胚孵化率(其為孵化囊胚數(shù)除以囊胚數(shù)所得百分?jǐn)?shù))。
五、胚胎后期培養(yǎng)液中g(shù)sh(谷胱甘肽)最適添加濃度篩選
1.配制0.5m的gsh作為儲液。
2.使用gsh儲液，按照終濃度為1mm、3mm、5mm、7mm梯度向胚胎后期培養(yǎng)液中添加配制為胚胎后期培養(yǎng)液的試驗組，以非添加組為對照。
3.分別于培養(yǎng)的第48h、第5天、第7天，統(tǒng)計各個組的卵裂卵與8細(xì)胞率、桑椹胚率和囊胚率。
六、胚胎差異染色
1.選取體外培養(yǎng)第7天的囊胚，使用2％多聚甲醛固定20min。
2.使用含0.5％bsa的磷酸鹽緩沖液(pbs-bsa)洗兩次，放入透化液(50μltriton、5μl吐溫80和9.945mlpbs)中，室溫放置30min。
3.使用2m鹽酸室溫處理20min，然后使用100mm的tris-hcl室溫處理10min，使cdx2蛋白能夠與一抗結(jié)合。
4.使用pbs-bsa清洗三次，將囊胚放入封閉液(1ml山羊血清、5μl吐溫80和8.995mlpbs)中，室溫封閉1h，然后轉(zhuǎn)入4℃冰箱封閉過夜。
5.棄去封閉液，cdx2一抗用封閉液按1:200稀釋，室溫孵育2h，棄去一抗稀釋液，用pbs-bsa清洗3次，每次5min。
6.caspase-3一抗(購自cellsignalingtechnology公司)用封閉液按1:200稀釋，室溫孵育2h，棄去一抗稀釋液，用pbs-bsa清洗3次，每次5min。
7.在避光條件下用封閉液按1:200稀釋cdx2特異性二抗(購自sigma公司)，室溫下避光放置1h。避光條件下棄去二抗稀釋液，用pbs清洗3次，每次5min。
8.在避光條件下用封閉液按1:200稀釋caspase-3特異性二抗(購自lifetechnologies公司)，室溫下避光放置1h。避光條件下棄去二抗稀釋液，用pbs清洗3次，每次5min。
9.加入10μg/ml的hochest33342染液染細(xì)胞核，室溫作用5min，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。
10.實驗重復(fù)三次，每次隨機選取10個囊胚，計算凋亡率、icm細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)來評估囊胚質(zhì)量。
七、數(shù)據(jù)統(tǒng)計
實驗數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件sasv8中的anova程序進(jìn)行分析，duncan’smultiple-range檢驗方法判定處理間的差異顯著性，當(dāng)p<0.05時認(rèn)為差異顯著。
八、胚胎后期培養(yǎng)液中添加gsh可顯著提高牛體外受精囊胚的發(fā)育率
選擇gsh添加濃度為0、1、3、5、7mm進(jìn)行篩選，通過統(tǒng)計卵裂率(即，卵裂率＝受精卵裂數(shù)/受精卵數(shù))、4-8細(xì)胞率、桑椹胚率、囊胚率(即，囊胚率＝囊胚數(shù)/卵裂胚胎數(shù))。
結(jié)果：
胚胎后期培養(yǎng)液中g(shù)sh添加濃度為0、1、3、5、7mm的五組間的卵裂率和4-8細(xì)胞率均差異不顯著(p>0.05)，例如五組卵裂率均在0.80～0.88范圍內(nèi)，五組4-8細(xì)胞率均在0.67～0.79范圍內(nèi)；
對桑葚胚發(fā)育率(即桑椹胚率，桑葚胚率＝桑葚胚胎數(shù)/卵裂胚胎數(shù))，3mm和5mm的gsh添加組均顯著高于對照組和5mm、7mm實驗組(p<0.05)，但3mm和5mm這兩組間差異不顯著(p>0.05)，例如對照組和5mm、7mm這三組的桑椹胚率在0.46～0.49范圍內(nèi)，而3mm和5mm這兩組的桑椹胚率在0.61～0.63范圍內(nèi)；
對囊胚率而言，1mm、3mm和5mm的gsh添加組均顯著高于對照組(p<0.05)，而7mm的gsh添加組與對照組間差異不顯著(p>0.05)，例如對照組和7mm組的囊胚率分別為0.32和0.36，1mm組的囊胚率為0.42，3mm和5mm組的囊胚率在0.46～0.51范圍內(nèi)；這些結(jié)果與cn103898046a表1結(jié)果基本一致?？梢娫谂咛ズ笃谂囵B(yǎng)液中添加gsh均可提高牛ivf胚胎的體外發(fā)育率。
九、胚胎后期培養(yǎng)液中添加gsh可提高牛體外受精胚胎的質(zhì)量
通過統(tǒng)計總細(xì)胞數(shù)、icm細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)、凋亡率(即，凋亡率＝凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))，比較分析了gsh不同添加濃度組獲得的囊胚質(zhì)量。結(jié)果如下：
對于總細(xì)胞數(shù)，1mm、3mm、5mm、7mm四個gsh濃度添加組均顯著高于對照組(p<0.05)，且3mm、5mm和7mm組均顯著高于1mm組(p<0.05)，例如0mm組總細(xì)胞數(shù)為42.4，1mm組總細(xì)胞數(shù)為63.6，3mm、5mm和7mm組總細(xì)胞數(shù)均在82～89范圍內(nèi)；
對于icm細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)的比率，1mm添加組與對照組差異不顯著(p>0.05)，3mm、5mm和7mm組均顯著低于對照組(p<0.05)，但這三組之間差異不顯著(p>0.05)，例如1mm添加組與對照組的icm細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)比均在0.41～0.48范圍內(nèi)，3mm、5mm和7mm組的icm細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)比均在0.41～0.48范圍內(nèi)0.27～0.34范圍內(nèi)；
對于凋亡率，四個添加組與對照組之間差異不顯著(p>0.05)，1mm、3mm、7mm的gsh添加組和對照組的凋亡率均顯著低于5mm添加組(p<0.05)；這些結(jié)果與cn103898046a表2結(jié)果基本一致。可見gsh的添加有助于提高牛體外受精胚胎的質(zhì)量。
十、胚胎后期培養(yǎng)液中添加gsh的最適添加濃度為3mm
在四個實驗組中，3mm和5mm的gsh添加組獲得的桑葚胚率和囊胚率均顯著高于對照組和其它實驗組(p<0.05)；但3mm的gsh添加組的桑葚胚率與5mm的gsh添加組間差異不顯著(p>0.05)，但囊胚率卻顯著高于5mm添加組(p<0.05)，可見3mm的gsh添加組中的牛ivf胚胎的發(fā)育率是最高的，因此gsh的最適濃度為3mm的gsh添加組。
本實施例篩選出了最適添加濃度，極大地提高了囊胚生產(chǎn)效率，囊胚率由30％提高至50％；對胚胎質(zhì)量進(jìn)行評估也顯示，添加本產(chǎn)品后囊胚質(zhì)量也優(yōu)于對照組。
實施例2：牛體外受精胚胎的培養(yǎng)方法
參照實施例1，不同的僅是其中的胚胎后期培養(yǎng)液組成改為：
109mm的nacl、
3.1mm的kcl、
26.0mm的nahco3、
0.5mm的mgcl2·6h2o、
1.3mm的kh2po3、
0.4mm的丙酮酸鈉、
1.5mm的葡萄糖、
5mm的半乳糖酸鈣、
10v/v％的胎牛血清、
1mm的l-谷氨酰胺、
2v/v％的必需氨基酸、
1v/v％的非必須氨基酸、
3mm的谷胱甘肽、和
作為配液溶劑的水。
照實施例1進(jìn)行試驗，結(jié)果各項指標(biāo)均與實施例1中使用3mm的谷胱甘肽組基本相同，例如本實施例中桑葚胚率為0.633、囊胚率為0.508、凋亡率0.050。
實施例3：牛體外受精胚胎的培養(yǎng)方法
參照實施例1，不同的僅是其中的胚胎后期培養(yǎng)液組成改為：
110mm的nacl、
2.9mm的kcl、
26.5mm的nahco3、
1.0mm的mgcl2·6h2o、
1.0mm的kh2po3、
0.4mm的丙酮酸鈉、
1.5mm的葡萄糖、
5mm的半乳糖酸鈣、
10v/v％的胎牛血清、
1mm的l-谷氨酰胺、
2v/v％的必需氨基酸、
1v/v％的非必須氨基酸、
3mm的谷胱甘肽、和
作為配液溶劑的水。
照實施例1進(jìn)行試驗，結(jié)果各項指標(biāo)均與實施例1中使用3mm的谷胱甘肽組基本相同，例如本實施例中桑葚胚率為0.636、囊胚率為0.521、凋亡率0.050。
實施例4：牛體外受精胚胎的培養(yǎng)方法
參照實施例1在胚胎后期培養(yǎng)液中添加3mm谷胱甘肽的試驗組，不同的僅是在胚胎后期培養(yǎng)液中還添加了枸櫞酸鈉和麥芽糖，二者濃度分別為0.04w/v％和0.02w/v％。結(jié)果顯示，在實施例1考察的各項指標(biāo)方面，本實施例4均與實施例1中使用3mm的谷胱甘肽組基本相同，例如本實施例4中桑葚胚率為0.634、囊胚率為0.518、凋亡率0.049；另外，在第9天時統(tǒng)計囊胚孵化率，結(jié)果顯示本實施例囊胚孵化率達(dá)71.6％，而另外統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)實施例1～3全部使用3mm谷胱甘肽的試驗中囊胚孵化率均在36～39％范圍內(nèi)。
在補充的試驗中，參照上述實施例4，不同的僅是枸櫞酸鈉濃度改為0.03w/v％或0.05w/v％(但麥芽糖仍為0.02w/v％)，兩個試驗中各項指標(biāo)均與上述實施例4基本相同，例如囊胚孵化率達(dá)70.2～71.4％范圍。在補充的試驗中，參照上述實施例4，不同的僅是麥芽糖濃度改為0.01w/v％或0.03w/v％(但枸櫞酸鈉仍為0.04w/v％)，兩個試驗中各項指標(biāo)均與上述實施例4基本相同，例如囊胚孵化率達(dá)71.6～72.6％范圍內(nèi)；這一結(jié)果表明，在胚胎后期培養(yǎng)液中補充添加適量枸櫞酸鈉和麥芽糖后能夠有效地提高囊胚孵化率。在補充的試驗中，參照上述實施例4，不同的僅是不添加枸櫞酸鈉(但麥芽糖仍為0.02w/v％)，或者不同的僅是不添加麥芽糖(但枸櫞酸鈉仍為0.04w/v％)，兩個試驗中除了囊胚孵化率以外的各項指標(biāo)均與上述實施例4基本相同，但是囊胚孵化率顯著的小，均在38～40％范圍內(nèi)(p<0.05，具有顯著性差異)；這一結(jié)果表明，僅添加枸櫞酸鈉和麥芽糖二者之一時不能有效提高囊胚孵化率。
雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。