本發(fā)明涉及家畜配子胚胎工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種牛卵泡膜細(xì)胞體外調(diào)節(jié)劑及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

卵泡膜細(xì)胞作為卵巢中組成卵泡的3種主要細(xì)胞之一，在卵巢的各項(xiàng)功能如甾體合成、卵泡發(fā)育和卵泡閉鎖中都發(fā)揮了一定的作用。卵泡膜細(xì)胞起源于卵巢中類似成纖維細(xì)胞樣的基質(zhì)細(xì)胞，其可分泌雄激素，與卵泡刺激素(fsh)相互作用促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖，促進(jìn)卵泡的發(fā)育。

褪黑激素，n-乙?；?5甲氧基色胺(melatonine，mt)，主要由松果體分泌，其生物學(xué)功能多樣，包括調(diào)控生物周期節(jié)律、睡眠機(jī)能、繁殖和抗氧化應(yīng)激功能等。有研究表明，在哺乳動(dòng)物，褪黑激素通過(guò)結(jié)合下丘腦-垂體-性腺軸系上的結(jié)合位點(diǎn)、活化其受體進(jìn)而影響性發(fā)育和繁殖功能(clemens等，lifesciences，2001，69：27-35；hu等，generalandcomparativeendocrinology，2017，242：101-107)。在雄性動(dòng)物，褪黑激素能通過(guò)調(diào)控gnrh、lh的分泌、睪酮的合成以及睪丸的成熟影響季節(jié)性和非季節(jié)性繁殖動(dòng)物的繁殖功能(tian等，journalofpinealresearch，2014，57：239-247)。褪黑激素能夠促進(jìn)綿羊、豬、牛、小鼠和人卵母細(xì)胞和胚胎的發(fā)育(mayo等，celluarandmolecularlifesciences，2002，59：1706-1713；he等，animalreproductionscience，2016，172：164-172)，另一方面，褪黑激素表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗氧化和抗凋亡能力，可以添加在培養(yǎng)基中提高體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞的受精率和胚胎早期發(fā)育率(ishizuka等，journalofpinealresearch，2000，28：48-51；voiculescu等，journalofmedicineandlife，2014，7：488-492)。

褪黑激素對(duì)卵巢細(xì)胞類固醇激素合成的影響研究較少，在大鼠顆粒細(xì)胞，褪黑激素能促進(jìn)孕酮的合成(fiske等，endocrinology，1984，114：407-410)，也有研究證明褪黑激素對(duì)孕酮合成無(wú)影響(nakamura等，thejournalofsteroidbiochemistryandmolecularbiology，2014，143：233-239)。褪黑激素對(duì)膜細(xì)胞增殖的影響無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。近期，褪黑激素被認(rèn)為是人子宮內(nèi)膜的一種生長(zhǎng)因子(arjmand等，molecularbiotechnology，2016，58：684-694)。目前，沒有文獻(xiàn)報(bào)道褪黑激素對(duì)牛卵泡膜細(xì)胞基因表達(dá)的影響，僅有報(bào)道表明褪黑激素抑制未成熟睪丸間質(zhì)細(xì)胞lh刺激的雄激素的合成，原因是下調(diào)了cyp11a1和cyp17a1基因的表達(dá)(qin等，reproductivebiomedicineonline，2015，31：638-646)。褪黑激素能夠促進(jìn)顆粒細(xì)胞類固醇激素合成(webley和luck，journalofreproductionandfertility，1986，78：711-717；wang等，theriogenology，2012，78：1517-1526)。迄今為止，沒有有關(guān)褪黑激素對(duì)牛卵泡膜細(xì)胞影響的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種牛卵泡膜細(xì)胞體外培養(yǎng)調(diào)節(jié)劑。

本發(fā)明另一目的是提供一種促進(jìn)牛卵泡膜細(xì)胞體外培養(yǎng)增殖的方法。

本發(fā)明再一目的是提供褪黑激素在抑制牛卵泡膜細(xì)胞類固醇激素合成的應(yīng)用及褪黑激素在制備用于促進(jìn)牛卵泡膜細(xì)胞體外膜細(xì)胞增殖/抑制膜細(xì)胞類固醇激素合成藥物中的應(yīng)用。

一種牛卵泡膜細(xì)胞體外培養(yǎng)調(diào)節(jié)劑，以牛卵泡膜細(xì)胞體外培養(yǎng)液為基質(zhì)，在所述基質(zhì)中含有褪黑激素。

如上所述的牛卵泡膜細(xì)胞體外培養(yǎng)調(diào)節(jié)劑，優(yōu)選地，所述褪黑激素濃度為0.023μg/ml-2.3μg/ml，更優(yōu)選，所述褪黑激素濃度為0.23μg/ml-2.3μg/ml。

如上所述的牛卵泡膜細(xì)胞體外培養(yǎng)調(diào)節(jié)劑，優(yōu)選地，所述基質(zhì)為按體積比為1:1的混合ham′sf-12和dmem的培養(yǎng)基，其中，含有體積比為10％的胎牛血清，濃度為2.0mmol/l的谷氨酰胺、0.12mmol/l的慶大霉素和38.5mmol/l的碳酸氫鈉，及含有30ng/ml的促黃體生成素(lh)。

如上所述的牛卵泡膜細(xì)胞體外培養(yǎng)調(diào)節(jié)劑，優(yōu)選地，所述基質(zhì)為按體積比為1:1的混合ham′sf-12和dmem的培養(yǎng)基，其中，含有體積比為10％的胎牛血清，濃度為2.0mmol/l的谷氨酰胺、0.12mmol/l的慶大霉素和38.5mmol/l的碳酸氫鈉，及含有30ng/ml的促黃體生成素(lh)30ng/ml的類胰島素一號(hào)增長(zhǎng)因子(igf1)。

如上所述的牛卵泡膜細(xì)胞體外培養(yǎng)調(diào)節(jié)劑，優(yōu)選地，所述基質(zhì)為按體積比為1:1的混合ham′sf-12和dmem的培養(yǎng)基，其中，含有體積比為10％的胎牛血清，濃度為2.0mmol/l的谷氨酰胺、0.12mmol/l的慶大霉素和38.5mmol/l的碳酸氫鈉，及30ng/ml的類胰島素一號(hào)增長(zhǎng)因子(igf1)。

一種促進(jìn)牛卵泡膜細(xì)胞體外培養(yǎng)增殖的方法，其是將牛卵泡膜細(xì)胞在如上所述的牛卵泡膜細(xì)胞體外培養(yǎng)調(diào)節(jié)劑中培養(yǎng)。

優(yōu)選地，所述牛卵泡膜細(xì)胞分離自8～22mm的大卵泡。

進(jìn)一步，本發(fā)明提供了褪黑激素在促進(jìn)牛卵泡膜細(xì)胞增殖的應(yīng)用。

進(jìn)一步，本發(fā)明提供了褪黑激素在抑制牛卵泡膜細(xì)胞類固醇激素合成的應(yīng)用。

進(jìn)一步，本發(fā)明提供了褪黑激素在制備用于促進(jìn)牛卵泡膜細(xì)胞體外增殖合成藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，本發(fā)明提供了褪黑激素在制備用于抑制牛卵泡膜細(xì)胞類固醇激素合成藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述類固醇激素為孕酮。

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明中，在牛卵泡膜細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)時(shí)，促黃體生成素(lh)誘導(dǎo)下褪黑激素對(duì)膜細(xì)胞孕酮的合成無(wú)影響，促黃體生成素(lh)單獨(dú)的具有細(xì)胞增殖作用，在輔助有igf1存在的情況下，褪黑激素能呈劑量依賴性刺激牛膜細(xì)胞增殖，igf1能增加膜細(xì)胞對(duì)褪黑激素的敏感性。lh+類胰島素一號(hào)增長(zhǎng)因子(igf1)誘導(dǎo)下褪黑激素可呈劑量依賴性抑制膜細(xì)胞孕酮等類固醇激素的合成。褪黑激素抑制lh+igf1誘導(dǎo)的star和casp3表達(dá)，但對(duì)cyp11a1和cyp17a1表達(dá)無(wú)影響。但是，褪黑激素能夠促進(jìn)牛卵泡膜細(xì)胞增殖，褪黑激素作為牛卵巢功能的內(nèi)分泌調(diào)控因子，通過(guò)下調(diào)類固醇激素的合成抑制lh和igf1的效應(yīng)，進(jìn)而延緩膜細(xì)胞分化。

將褪黑激素應(yīng)用在牛卵泡膜細(xì)胞的促進(jìn)膜細(xì)胞增殖或抑制類固醇合成的制劑中，具有良好的應(yīng)用價(jià)值。褪黑激素可作為新型的牛卵泡膜細(xì)胞促進(jìn)膜細(xì)胞增殖藥物制劑在家畜胚胎工程上推廣應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

圖1為不同濃度的褪黑激素在加lh與加lh和igf1處理時(shí)，膜細(xì)胞增殖情況的比較圖。

圖2為不同濃度的褪黑激素在加lh與加lh和igf1處理時(shí)，孕酮合成情況的比較圖。

圖3為全部加有l(wèi)h和igf1時(shí)，在不加與加褪黑激素處理時(shí)，膜細(xì)胞star基因的表達(dá)結(jié)果圖。

圖4為全部加有l(wèi)h和igf1時(shí)，在不加與加褪黑激素處理時(shí)，膜細(xì)胞casp3基因的表達(dá)結(jié)果圖。

圖5為全部加有l(wèi)h和igf1時(shí)，在不加與加褪黑激素處理時(shí)，膜細(xì)胞cyp11a1基因的表達(dá)結(jié)果圖。

圖6為全部加有l(wèi)h和igf1時(shí)，在不加與加褪黑激素處理時(shí)，膜細(xì)胞cyp17a1基因的表達(dá)結(jié)果圖。

其中，圖中不同小寫字母表示存在差異(p<0.05)

具體實(shí)施方式

本發(fā)明經(jīng)過(guò)發(fā)明人大量的研究發(fā)現(xiàn)，在igf1存在的情況下，褪黑激素能呈劑量依賴性抑制孕酮的合成，還可刺激牛卵泡膜細(xì)胞增殖，單獨(dú)褪黑激素對(duì)細(xì)胞增殖的刺激能力有限，igf1能增加膜細(xì)胞對(duì)褪黑激素的敏感性。褪黑激素可顯著抑制膜細(xì)胞孕酮的合成。研究還發(fā)現(xiàn)了，褪黑激素處理牛膜細(xì)胞可下調(diào)casp3的表達(dá)。褪黑激素具有抑制膜細(xì)胞類固醇激素合成和抗凋亡的作用；褪黑激素能夠調(diào)控牛卵巢膜細(xì)胞功能，通過(guò)下調(diào)類固醇合成相關(guān)酶基因(star)的表達(dá)抑制類固醇激素的合成，并通過(guò)下調(diào)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(casp3)的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而刺激膜細(xì)胞增殖。了解褪黑激素的作用機(jī)理有助于解密這種抗分化因子對(duì)正常和異常卵巢功能(如卵泡囊腫)是如何調(diào)控的。

下面結(jié)合具體的實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。所用試劑和激素的來(lái)源可為如下：ham′sf-12(f12)、dmem培養(yǎng)基、慶大霉素、碳酸氫鈉、臺(tái)盼藍(lán)、蛋白酶、膠原酶、透明質(zhì)酸酶、脫氧核糖核酸酶、lh購(gòu)自sigma(北京)，胎牛血清(fbs)購(gòu)自gibco(上海)，重組人igf-1購(gòu)自sciencell(sandiego，ca)。

elisa測(cè)定試劑：牛孕酮(bim，sanfrancisco，ca)。

rna檢測(cè)試劑：一鏈合成試劑盒，熒光定量試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)。

實(shí)施例1褪黑激素對(duì)牛大卵泡膜細(xì)胞類固醇合成的影響

1.細(xì)胞培養(yǎng)

未妊娠牛的卵巢采集自北京遠(yuǎn)郊某大型屠宰場(chǎng)，采集后保存于含1％青鏈霉素的0.9％生理鹽水中，冰上運(yùn)輸1小時(shí)內(nèi)到達(dá)試驗(yàn)室。膜細(xì)胞分離自直徑8～22mm的大卵泡，要求卵泡血管清晰、卵泡液透明。大卵泡抽取卵泡液后用手術(shù)刀縱向切開，用鈍性分離法刮去殘留顆粒細(xì)胞。膜細(xì)胞用顯微解剖法分離并置于37℃搖床消化1小時(shí)。未消化的膜細(xì)胞用149μm濾器過(guò)濾。膜細(xì)胞在4℃50g離心7分鐘，用培養(yǎng)基(體積比為1:1的dmem和f12，其中包含2.0mmol/l的谷氨酰胺、0.12mmol/l的慶大霉素和38.5mmol/l的碳酸氫鈉)洗滌2次，用不含血清的培養(yǎng)基(包含1.25mg/ml膠原酶和0.5mg/mldnase)重懸，防止鋪板之前細(xì)胞凝集。膜細(xì)胞的純度應(yīng)大于90％。

膜細(xì)胞生存能力用臺(tái)盼藍(lán)法評(píng)估，平均為92％。大約鋪4.0×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔，用2ml含體積比為10％胎牛血清(fbs)的培養(yǎng)基在5％co2和95％空氣條件下培養(yǎng)48小時(shí)，每個(gè)孔用1ml無(wú)血清的培養(yǎng)基洗滌2次后獲得膜細(xì)胞。

2.igf1和褪黑激素對(duì)牛大卵泡膜細(xì)胞的處理

步驟1獲得的膜細(xì)胞在含體積比為10％fbs的培養(yǎng)基(體積比為1:1的dmem和f12，其中包含2.0mmol/l谷氨酰胺、0.12mmol/l慶大霉素和38.5mmol/l碳酸氫鈉)中培養(yǎng)48小時(shí)后，分別用0、0.023(0.1μmol/l)、0.23(1.0μmol/l)或2.3μg/ml(10μmol/l)含褪黑激素的含10％fbs的培養(yǎng)基處理48小時(shí)，加或不加30ng/ml的igf1。培養(yǎng)基每24小時(shí)更換一次。結(jié)束培養(yǎng)后，收集培養(yǎng)基用于測(cè)定孕酮含量，收集細(xì)胞用于細(xì)胞計(jì)數(shù)。因?yàn)樵型暮铣稍趌h缺失的情況下無(wú)法被igf1誘導(dǎo)，所以所有的處理都包含30ng/mllh。此實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)不同的重復(fù)。每一個(gè)重復(fù)的膜細(xì)胞來(lái)源于4-6頭牛卵巢上的5-7個(gè)大卵泡。

3.檢測(cè)方法

孕酮采用elisa試劑盒(bim)推薦的方法進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品測(cè)定2次。測(cè)定批次內(nèi)的變異系數(shù)分別為9.6％和8.7％。

細(xì)胞計(jì)數(shù)用tz20^tm計(jì)數(shù)器(bio-rad，上海，中國(guó))進(jìn)行。具體如下：在胰蛋白酶(0.25％，0.5ml)消化前用0.5mlpbs洗滌2次，消化5分鐘，吹打后吸10μl測(cè)量。

4.檢測(cè)結(jié)果

細(xì)胞計(jì)數(shù)和孕酮激素分泌用spss軟件中的2×4因子anova分析。不同平均數(shù)用tukey法比較，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。結(jié)果表明，褪黑激素單獨(dú)處理，添加量為0.23μg/ml和2.3μg/ml時(shí)能夠刺激膜細(xì)胞增殖1.12倍和1.13倍(p<0.05)，但添加量為0.023μg/ml時(shí)褪黑激素對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)影響。當(dāng)igf1存在時(shí)，褪黑激素添加量為0.023μg/ml、0.23μg/ml和2.3μg/ml時(shí)，可增加細(xì)胞數(shù)分別為1.12、1.16和1.14倍(p<0.05)。結(jié)果見圖1。孕酮素表示為pm/10⁵cells。對(duì)孕酮含量的檢測(cè)，結(jié)果見圖2，說(shuō)明褪黑激素呈劑量依賴性降低了lh和igf1誘導(dǎo)的孕酮合成，如0.23μg/ml和2.3μg/ml褪黑激素抑制孕酮合成25.3％和32.2％(p<0.05)。在缺乏igf1而lh存在時(shí)，褪黑激素對(duì)孕酮的產(chǎn)生沒有影響(p>0.05)。

實(shí)施例2褪黑激素對(duì)cyp11a1、cyp17a1、casp3和starmrna表達(dá)的影響

1.細(xì)胞培養(yǎng)

按實(shí)施例1中細(xì)胞培養(yǎng)的獲得膜細(xì)胞，在含10％fbs的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)后，使用3個(gè)處理：對(duì)照、igf1(30ng/ml)和褪黑激素(2.3μg/ml)+igf1(30ng/ml)，所有的處理均包括30ng/mllh。培養(yǎng)24小時(shí)結(jié)束后，吸取培養(yǎng)基，細(xì)胞裂解后用于rna提取。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)不同的重復(fù)。每一個(gè)重復(fù)的膜細(xì)胞來(lái)源于4-6頭牛卵巢上的5-7個(gè)大卵泡。

2.rna提取和rt-pcr定量測(cè)定表達(dá)量

培養(yǎng)結(jié)束后，吸取每孔的培養(yǎng)基；在孔中加入0.5mltrnzol試劑(天根生化科技有限公司，北京)，并提取rna。每個(gè)處理包括2個(gè)rna樣品。rna樣品用nanodropnd-1000分光光度計(jì)(nanodroptechnologies，inc.，wilmington，de)測(cè)定260nm處的吸光度值，rna樣品用depc水稀釋，保存與-80℃。

cyp11a1、cyp17a1和star基因引物見已發(fā)表文獻(xiàn)(spicer等，biologyofreproduction，2008，78：243-253)。caspase3(casp3)基因引物序列為：上游引物：cttccacgaaaatactggcatg，下游引物：tgaatgtttccctgaggtttgc，探針：tcgatctggtacagacgtg。對(duì)所有rt-pcr而言，設(shè)置一個(gè)不加模板和一個(gè)沒有反轉(zhuǎn)錄的對(duì)照，確保pcr反應(yīng)無(wú)dna或其他污染。pcr反應(yīng)結(jié)束后用瓊脂糖凝膠確定目的基因片段的大小。目的基因表達(dá)用持家基因18s核糖體rna做標(biāo)準(zhǔn)化處理(spicer等，biologyofreproduction，2008，78：243-253)，相對(duì)表達(dá)量用2^-△△ct法計(jì)算。

3.檢測(cè)結(jié)果

基因表達(dá)等用spss軟件中的anova分析，不同平均數(shù)用tukey法比較，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

結(jié)果如圖3-6所示，其中，star基因編碼類固醇激素急性調(diào)節(jié)蛋白，可作用于線粒體外膜,介導(dǎo)并促進(jìn)類固醇的底物——膽固醇經(jīng)線粒體外膜轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)膜，繼而在膽固醇側(cè)鏈裂解酶p450scc等的作用下逐級(jí)合成類固醇激素。cyp11a1基因編碼p450scc，是催化雌激素合成過(guò)程中的第一步，即將膽固醇轉(zhuǎn)化為孕烯雌酮，是雄激素、雌激素生物合成的關(guān)鍵限速酶。cyp17a1基因編碼細(xì)胞色素酶p450c17，可將孕烯雌酮和孕酮轉(zhuǎn)化為17-羥孕烯雌酮和孕酮。star，cyp11a1，cyp17a1均是孕酮合成過(guò)程中的限速酶。casp3基因表達(dá)的caspase3是細(xì)胞凋亡一個(gè)主要的下游效應(yīng)器和顆粒細(xì)胞凋亡的標(biāo)記。

結(jié)果表明，lh和igf1處理膜細(xì)胞，cyp11a1和cyp17a1基因表達(dá)不受褪黑激素影響。但是，2.3μg/ml褪黑激素可抑制star和casp3基因表達(dá)(p<0.05)。由此可見，褪黑激素能夠調(diào)控牛卵巢膜細(xì)胞功能，通過(guò)下調(diào)類固醇合成相關(guān)酶基因(star)的表達(dá)抑制類固醇激素的合成，并通過(guò)下調(diào)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(casp3)的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而刺激膜細(xì)胞增殖。