專利名稱：豬瘟陰、陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及豬瘟陰性血清陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其制備方法，屬于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)和 獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬瘟(ClassicalSwine Fever，CSF)是由豬癌病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)引起的一種高度接觸性、致死性的豬傳染病，在世界上很多國家和地區(qū)均有發(fā) 生，給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將豬瘟列為法定通報(bào) 性疫病，我國將其劃為一類動(dòng)物傳染病。因此，豬瘟研究和防制受到了世界范圍內(nèi)的廣范 重視，我國也不例外。但由于豬瘟病毒感染細(xì)胞后不引起細(xì)胞病變，且病毒增殖滴度較低， 因此病毒檢測(cè)、產(chǎn)品檢驗(yàn)、科學(xué)研究等難度加大，實(shí)驗(yàn)結(jié)果易受人員的經(jīng)驗(yàn)、能力以及實(shí)驗(yàn) 設(shè)施、環(huán)境的影響而存在較大誤差，嚴(yán)重制約了豬瘟的防控，因此亟需使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為客 觀、公正的標(biāo)尺，用于產(chǎn)品質(zhì)量控制、科學(xué)研究與實(shí)驗(yàn)室診斷的參照以及實(shí)驗(yàn)室之間的能力 比對(duì)。然而，豬瘟陰性血清和陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量要求高，制備方法和檢驗(yàn)、標(biāo)定方法 嚴(yán)格，有關(guān)制備程序和標(biāo)定方法至今未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種制備豬瘟陰性血清和陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的方法，并制備 出合格的豬瘟陰性血清和陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。本發(fā)明包括以下技術(shù)方案1.本發(fā)明所述的豬瘟陰性血清、陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)包括(1)豬瘟陰性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；(2)陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中有包括弱陽性豬瘟血清、中等陽性豬瘟血清和強(qiáng)陽性 豬瘟血清系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；(3)豬瘟陰性血清、陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中不含有口蹄疫、偽狂犬病、豬繁殖與呼吸 綜合征、豬細(xì)小病毒病、牛病毒性腹瀉/粘膜病抗體；(4)本發(fā)明所涉及的豬瘟陰性血清、陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是經(jīng)過不同單位的協(xié)作標(biāo) 定并統(tǒng)計(jì)分析定值的。2. 一種豬瘟陰性血清、陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，包括以下技術(shù)步驟(1)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物(簡稱候選物)的制備1)豬瘟陰性血清和陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是用口蹄疫、偽狂犬病、豬瘟、豬繁殖與呼吸 綜合征、豬細(xì)小病毒病、牛病毒性腹瀉/粘膜病的抗原、抗體陰性豬制備的；2)使用CVCC AV1411、CVCC AV03和CVCC AV22豬瘟病毒分別接種豬按常規(guī)方法 制備的豬瘟病毒血毒和豬瘟活疫苗作為制備豬瘟陽性血清的免疫原；3)豬瘟陰性血清由陰性豬直接采血按常規(guī)法制備；豬瘟弱陽性血清由陰性豬免 疫豬瘟疫苗2周后采血按常規(guī)法制備血清；豬瘟中等陽性血清由陰性豬免疫豬瘟活疫苗，2周后注射豬瘟混合血毒，2周后采血按常規(guī)法制備血清；豬瘟強(qiáng)陽性血清由陰性豬免疫豬 瘟活疫苗2周后，每隔2周反復(fù)注射豬瘟混合血毒3 5次后采血按常規(guī)法制備血清；4)將血清用6tlCo-Y射線輻照處理；再將血清先用0.4μπι無菌濾膜加壓過濾，最 后用0. 22 μ m無菌濾膜加壓過濾；5)候選物的檢驗(yàn)對(duì)候選物進(jìn)行無菌檢驗(yàn)和效力檢驗(yàn)，效力檢驗(yàn)采用細(xì)胞中和試 驗(yàn)、兔體中和試驗(yàn)和ELISA試驗(yàn)中任何一種方法；6)將血清無菌分裝至Iml滅菌長安瓿中，在分裝過程中一直用攪拌子低速混勻， 分裝精度為士0.01ml ；再冷凍、真空干燥后出箱，立即抽真空，火焰熔封；2.標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢驗(yàn)將血清進(jìn)行物理性狀檢驗(yàn)、無菌檢驗(yàn)，安全檢驗(yàn)，特異性檢驗(yàn)，均一性檢驗(yàn)，支原體 檢驗(yàn)，剩余水分測(cè)定和用細(xì)胞中和試驗(yàn)、兔體中和試驗(yàn)和ELISA試驗(yàn)測(cè)定的效力檢驗(yàn)；3.標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的協(xié)作標(biāo)定和定值將該血清分發(fā)至國內(nèi)相關(guān)機(jī)構(gòu)進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定，最后將各單位標(biāo)定的數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì) 分析、定值。本發(fā)明的詳細(xì)描述一種豬瘟陰性血清和陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其制備方法，包括以下技術(shù)步驟1.標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物(簡稱候選物)的制備(1)動(dòng)物選擇選擇口蹄疫、偽狂犬病、豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬細(xì)小病毒病、牛病毒性腹瀉 /粘膜病的病原、抗體陰性(病原用PCR或RT-PCR方法檢測(cè)，抗體用ELISA方法檢測(cè))豬作 為血清制備動(dòng)物。(2)免疫原制備1)豬瘟活疫苗國內(nèi)生產(chǎn)的商品疫苗。2)用豬瘟病毒石門株(CVCC AV1411)、03 株(CVCC AV03)和 22 株(CVCC AV22)作 為種子病毒(來自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)，按常規(guī)方法分別制取3個(gè)毒株的豬瘟血毒(中華 人民共和國農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程二〇〇〇年版.化學(xué)工業(yè)出版社， 2000，259)，-200C以下凍存，使用時(shí)按等量混合成3個(gè)毒株的混合血毒(本發(fā)明稱“豬瘟混
合血毒”)。抗原檢驗(yàn)按照《中華人民共和國獸藥典》(中國獸藥典委員會(huì).中華人民共和國 獸藥典二〇〇五年版三部.中國農(nóng)業(yè)出版社，2005，以下稱《中國獸藥典》)進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)符 合純粹檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)規(guī)定。(3)免疫1)陰性血清制備陰性豬不免疫，按常規(guī)方法直接采血制備血清。2)弱陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備用豬瘟活疫苗2頭份免疫接種豬，2周后采血按常 規(guī)方法制備血清。3)中等陽性血清制備用豬瘟活疫苗2頭份免疫接種豬，2周后，肌肉注射豬瘟混 合血毒100ml，2周后采血按常規(guī)方法制備血清。4)強(qiáng)陽性血清制備用豬瘟活疫苗2頭份免疫接種豬，每隔2周反復(fù)注射(3 5 次)豬瘟混合血毒，每次注射200 300ml，最后采血按常規(guī)方法制備血清。
(4)血清處理將血清用6tlCo-γ射線輻照處理；再將血清先用0.4 μ m無菌濾膜加壓過濾，最后用 0. 22 μ m無菌濾膜加壓過濾。(5)候選物的檢驗(yàn)對(duì)候選物進(jìn)行無菌檢驗(yàn)和效力檢驗(yàn)，效力檢驗(yàn)采用細(xì)胞中和 試驗(yàn)、兔體中和試驗(yàn)和ELISA試驗(yàn)中任何一種方法；(6)分裝、凍干、熔封將血清無菌分裝至Iml滅菌長安瓿中，在分裝過程中一直用攪拌子低速混勻，分 裝精度為士0.01ml ；再冷凍、真空干燥后出箱，立即抽真空，火焰熔封。2.標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢驗(yàn)(1)物理性狀檢驗(yàn)，要求安瓿內(nèi)容物呈灰白色團(tuán)塊，加去離子水后在10分鐘之內(nèi) 溶解，溶解后為淡黃色澄明液體。(2)無菌檢驗(yàn)，按照《中國獸藥典》進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)符合規(guī)定。(3)安全檢驗(yàn)，要求不致死家兔、豚鼠、小鼠。(4)特異性檢驗(yàn)，要求ELISA方法檢測(cè)為口蹄疫、偽狂犬病、豬繁殖與呼吸綜合征、 豬細(xì)小病毒病、牛病毒性腹瀉/粘膜病抗體陰性。(5)均一性檢驗(yàn)，要求瓶內(nèi)、瓶間無顯著差異。(6)支原體檢驗(yàn)，按照《中國獸藥典》進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)符合規(guī)定。(7)剩余水分測(cè)定，按照《中國獸藥典》進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)符合規(guī)定。(8)真空度檢驗(yàn)，按照《中國獸藥典》進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)符合規(guī)定。(9)效力檢驗(yàn)，應(yīng)測(cè)定細(xì)胞中和效價(jià)、兔體中和效價(jià)與ELISA效價(jià)。3.標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的協(xié)作標(biāo)定和定值將血清分發(fā)至國內(nèi)相關(guān)機(jī)構(gòu)進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定；最后將各單位標(biāo)定的數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分 析，按照統(tǒng)計(jì)學(xué)原則剔除異常值并計(jì)算效價(jià)，最終定值。本發(fā)明的積極意義本發(fā)明涉及一種豬瘟陰性血清陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其制備方法。本發(fā)明所涉及的 豬瘟陰性血清陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是通過利用我國馴化和分離鑒定的豬瘟病毒按照不同免 疫程序免疫陰性豬，采血分離血清，再經(jīng)過輻照、過濾、分裝、凍干、熔封、檢驗(yàn)等工藝過程， 并且最終通過協(xié)作標(biāo)定、定值制備而成的。本發(fā)明制備的豬瘟陰性血清陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 制備程序科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)、完善，特異性好，適用范圍廣，定值準(zhǔn)確性高。
實(shí)施例本發(fā)明的實(shí)施例為進(jìn)一步描述本發(fā)明的技術(shù)方案，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例11.候選物的制備(1)動(dòng)物選擇選擇口蹄疫、偽狂犬病、豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬細(xì)小病毒 病、牛病毒性腹瀉/粘膜病的病原、抗體陰性(病原用PCR或RT-PCR方法檢測(cè)，抗體用ELISA 方法檢測(cè))豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；(2)抗原制備 將豬瘟病毒石門株(CVCC AV1411)、03株(CVCC AV03)和22 株(CVCC AV22)各1ml，分別肌肉注射3頭豬，待豬瀕死時(shí)頸動(dòng)脈采血，用玻璃珠脫纖抗凝，-20°C以下凍存；抗原檢驗(yàn)按照《中國獸藥典》進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果符合純粹檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)規(guī)定；(3)按照不同免疫程序制備一系列不同效價(jià)的血清1)陰性血清制備陰性豬直接頸動(dòng)脈采血分離血清。2)弱陽性血清制備陰性豬免疫豬瘟兔化弱毒疫苗2頭份，2周后經(jīng)ELISA抗體 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，抗體轉(zhuǎn)為陽性，頸動(dòng)脈采血分離血清。3)中等陽性血清制備陰性豬免疫豬瘟兔化弱毒疫苗2頭份2周后，經(jīng)ELISA抗 體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，抗體轉(zhuǎn)為陽性，肌肉注射豬瘟混合血毒100ml，2周后采血分離血清。4)強(qiáng)陽性血清制備陰性豬免疫豬瘟兔化弱毒疫苗2頭份2周后，經(jīng)ELISA抗體 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，抗體轉(zhuǎn)為陽性，每隔2周反復(fù)注射豬瘟混合血毒，每次注射200 300ml， 注射3 5次，最后采血分離血清。(4)血清處理將血清用6tlCo- γ射線輻照處理；再將血清先用0. 4 μ m無菌濾膜 加壓過濾，最后用0. 22 μ m無菌濾膜加壓過濾；(5)候選物的檢驗(yàn)對(duì)候選物進(jìn)行無菌檢驗(yàn)和效力檢驗(yàn)，效力檢驗(yàn)采用細(xì)胞中和 試驗(yàn)、兔體中和試驗(yàn)和ELISA試驗(yàn)中任何一種方法；(6)分裝、凍干、熔封將血清無菌分裝至Iml滅菌長安瓿中，在分裝過程中一直用 攪拌子低速混勻，分裝精度為士0.01ml ；再冷凍、真空干燥后出箱，立即抽真空，火焰熔封；2.標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢驗(yàn)1)物理性狀檢驗(yàn)隨機(jī)抽取5支樣品，結(jié)果所有安瓿內(nèi)容物呈灰白色團(tuán)塊，加去 離子水后在10分鐘之內(nèi)溶解，溶解后為淡黃色澄明液體；2)無菌檢驗(yàn)按照《中國獸藥典》進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果無菌生長；3)安全檢驗(yàn)取IOml注射家兔、5ml注射豚鼠、Iml注射小鼠，連續(xù)觀察10日，均 健活；4)特異性檢驗(yàn)用ELISA方法檢測(cè)，結(jié)果為口蹄疫、偽狂犬病、豬繁殖與呼吸綜合 征、豬細(xì)小病毒病、牛病毒性腹瀉/粘膜病抗體陰性；5)均一性檢驗(yàn)抽取10支樣品，每瓶內(nèi)取樣用ELISA方法檢測(cè)3次，結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì) 分析，瓶內(nèi)、瓶間無顯著差異；6)支原體檢驗(yàn)按照《中國獸藥典》進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果無支原體生長；7)剩余水分測(cè)定按照《中國獸藥典》進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果抽取的4支樣品剩余水分均 小于4% ；8)真空度檢驗(yàn)按照《中國獸藥典》進(jìn)行檢驗(yàn)，所有安瓿均呈現(xiàn)藍(lán)紫色輝光；9)效力檢驗(yàn)細(xì)胞中和效價(jià)分別為0、1:16、1:200、1:3200，兔體中和效價(jià)分別為 0、1 8、1 200、1 1600，ELISA 效價(jià)分別為 0、1 2、1 100、1 800。3.協(xié)作標(biāo)定和定值(1)協(xié)作標(biāo)定將血清分發(fā)至國內(nèi)相關(guān)機(jī)構(gòu)進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定，結(jié)果見表1。表1豬瘟陰性血清和陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)協(xié)作標(biāo)定效價(jià) (2)定值將各單位標(biāo)定的數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，按照統(tǒng)計(jì)學(xué)原則剔除異常值并計(jì)算 效價(jià)，最終定值見表2。表2豬瘟陰性血清和陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值效價(jià)
權(quán)利要求
一種豬瘟陰性血清、陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其特征在于包括(1)豬瘟陰性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；(2)陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)又包括弱陽性豬瘟血清、中等陽性豬瘟血清和強(qiáng)陽性豬瘟血清系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；(3)豬瘟陰性血清、陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中不含有口蹄疫、偽狂犬病、豬繁殖與呼吸綜合征、豬細(xì)小病毒病、牛病毒性腹瀉/粘膜病抗體；(4)本發(fā)明所涉及的豬瘟陰性血清、陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是經(jīng)過不同單位的協(xié)作標(biāo)定并統(tǒng)計(jì)分析定值的。
2.一種豬瘟陰性血清、陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，其特征在于包括以下技術(shù)步驟(1)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物的制備1)豬瘟陰性血清和陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是用口蹄疫、偽狂犬病、豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合 征、豬細(xì)小病毒病、牛病毒性腹瀉/粘膜病的抗原、抗體陰性豬制備的；2)使用CVCCAV1411、CVCC AV03和CVCC AV22豬瘟病毒分別接種豬按常規(guī)方法制備 的豬瘟病毒血毒和豬瘟活疫苗作為制備豬瘟陽性血清的免疫原；3)豬瘟陰性血清由陰性豬直接采血按常規(guī)法制備；豬瘟弱陽性血清由陰性豬免疫豬 瘟疫苗2周后采血按常規(guī)法制備血清；豬瘟中等陽性血清由陰性豬免疫豬瘟活疫苗，2周后 注射豬瘟混合血毒，2周后采血按常規(guī)法制備血清；豬瘟強(qiáng)陽性血清由陰性豬免疫豬瘟活 疫苗2周后，每隔2周反復(fù)注射豬瘟混合血毒3 5次后采血按常規(guī)法制備血清；4)將血清用6tlCo-Y射線輻照處理；再將血清先用0.4μπι無菌濾膜加壓過濾，最后用 0. 22 μ m無菌濾膜加壓過濾；5)對(duì)進(jìn)行無菌檢驗(yàn)和效力檢驗(yàn)；6)將檢驗(yàn)合格的候選物無菌分裝至Iml滅菌長安瓿中，在分裝過程中一直用攪拌子低 速混勻，分裝精度為士0.01ml ；再冷凍、真空干燥后出箱，立即抽真空，火焰熔封。(2)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢驗(yàn)對(duì)冷凍真空干燥后的將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行物理性狀檢驗(yàn)、無菌檢驗(yàn)，安 全檢驗(yàn)，特異性檢驗(yàn)，均一性檢驗(yàn)，支原體檢驗(yàn)，剩余水分測(cè)定和用細(xì)胞中和試驗(yàn)、兔體中和 試驗(yàn)和ELISA試驗(yàn)測(cè)定的效力檢驗(yàn)；(3)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的協(xié)作標(biāo)定和定值將該血清分發(fā)至國內(nèi)相關(guān)機(jī)構(gòu)進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定，最后將 各單位標(biāo)定的數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、定值。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬瘟陰性血清和陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其制備方法。本發(fā)明所涉及的豬瘟陰性血清和陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是通過利用我國馴化和分離鑒定的豬瘟病毒按照不同免疫程序免疫陰性豬，采血分離血清，再經(jīng)過輻照、過濾、分裝、凍干、熔封、檢驗(yàn)等工藝過程，并且最終通過協(xié)作標(biāo)定、定值制備而成的。本發(fā)明制備的豬瘟陰性血清陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備程序科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)、完善，特異性好，適用范圍廣，定值準(zhǔn)確性高。
文檔編號(hào)G01N33/96GK101915850SQ201010237919
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2010年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月28日
發(fā)明者關(guān)孚時(shí), 戴志紅, 李翠, 王在時(shí), 蔣卉 申請(qǐng)人:中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所