本發(fā)明屬于細(xì)胞
技術(shù)領(lǐng)域：
：，更具體涉及一種團(tuán)頭魴骨組織細(xì)胞的培養(yǎng)方法，適用于日后有關(guān)骨組織細(xì)胞分化過程、骨骼發(fā)育、骨組織礦化過程、基因篩選與功能分析等方面的研究。技術(shù)背景魚類相較于哺乳動(dòng)物而言具有很多技術(shù)性的優(yōu)點(diǎn)，因此越來越多的研究學(xué)者選擇用魚類作為研究模型(請(qǐng)見:rafaelms,marquescl,parameswaranv,etal.fishbone-derivedcelllines:analternativeinvitrocellsystemtostudybonebiology[j].journalofappliedichthyology,2010,26(26):230-234)，截止目前一些魚類已作為研究模型成功用以骨骼發(fā)育及相關(guān)疾病的研究?，F(xiàn)今國外已有利用組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行魚類骨組織細(xì)胞培養(yǎng)的報(bào)道，如vijayakumar等利用頜部、椎骨及鰓弓組織塊成功培養(yǎng)了斑馬魚骨組織細(xì)胞(請(qǐng)見:vijayakumarp,laizév,cardeiraj,etal.developmentofaninvitrocellsystemfromzebrafishsuitabletostudybonecelldifferentiationandextracellularmatrixmineralization[j].zebrafish,2013,10(4):500-509.)；marques等以鰓弓及椎骨組織塊為材料培養(yǎng)了金頭鯛鈣化組織細(xì)胞(請(qǐng)見:marquescl,rafaelms,cancelaml,etal.establishmentofprimarycellculturesfromfishcalcifiedtissues[j].cytotechnology,2007,55(1):9-13.)；另外rafael等利用頜部及脊柱培養(yǎng)了大西洋鮭的骨組織細(xì)胞(請(qǐng)見：rafaelms,marquescl,parameswaranv,etal.fishbone-derivedcelllines:analternativeinvitrocellsystemtostudybonebiology[j].journalofappliedichthyology,2010,26(26):230-234.)。目前國內(nèi)還無針對(duì)魚類骨組織細(xì)胞培養(yǎng)的相關(guān)報(bào)道。骨組織細(xì)胞的主要成分包括骨細(xì)胞(osteocyte)及成骨細(xì)胞(osteoblast,ob)。成骨細(xì)胞是一種結(jié)締組織細(xì)胞，一般存在于骨小梁的表面及骨膜內(nèi)側(cè)，是骨生成代謝過程中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞，其主要介導(dǎo)骨細(xì)胞的生成，使骨的生成維持在動(dòng)態(tài)平衡。骨細(xì)胞位于胞外礦物質(zhì)沉積形成的骨陷窩內(nèi)，由成骨細(xì)胞分化而來，是骨組織中機(jī)械應(yīng)力的主要感受器。國內(nèi)對(duì)哺乳動(dòng)物如人類，小鼠成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)較成熟，通常選用酶消化法消化組織分離出單細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)(請(qǐng)見：謝艷芳,陳克明,馬小妮,等.大鼠顱骨成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的分離純化與比較研究[j].解放軍醫(yī)藥雜志,2015(3):1-5.陳建庭,楊德鴻,景宗森,等.人成骨細(xì)胞培養(yǎng)方法改進(jìn)及細(xì)胞成骨特性觀察[c]//全國老年骨質(zhì)疏松專題學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編.2000)。由于細(xì)胞培養(yǎng)通常受到個(gè)體不同組織及年齡大小的限制，在魚類骨骼生長(zhǎng)發(fā)育相對(duì)快速的幼魚時(shí)期，個(gè)體還較小，組織也相對(duì)較小，利用酶消化法可能會(huì)對(duì)組織及細(xì)胞造成損傷，這一特點(diǎn)對(duì)魚類骨組織細(xì)胞培養(yǎng)起到了一定的限制作用。團(tuán)頭魴(megalobramaamblycephala)，俗稱武昌魚，隸屬于鯉形目(cypriniformes)，鯉科(cyprinidae)，鲌亞科(culterinae)，魴屬(megalobrama)，俗稱武昌魚，是我國特有的重要草食性經(jīng)濟(jì)魚類之一。其具有存活率高、生長(zhǎng)快、營養(yǎng)價(jià)值高和易捕撈的特點(diǎn)。目前關(guān)于團(tuán)頭魴細(xì)胞培養(yǎng)方面的研究還很少，僅有祝冬梅在2013年成功建立了團(tuán)頭魴肌肉、鰭條和心臟細(xì)胞系(請(qǐng)見:祝冬梅.團(tuán)頭魴三種細(xì)胞系的建立、鑒定及其初步應(yīng)用[d].華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2013)。團(tuán)頭魴骨組織細(xì)胞系(megalobramabonecells,mbcs)的建立可為日后魚類骨組織生長(zhǎng)代謝的體外研究提供一定的材料基礎(chǔ)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種團(tuán)頭魴骨組織細(xì)胞培養(yǎng)的方法，方法易行，操作簡(jiǎn)便，解決了由于樣品個(gè)體大小限制及胰蛋白酶消化法使用受限等問題。采用組織塊法獲得原代骨組織細(xì)胞，為日后研究魚類骨骼生長(zhǎng)發(fā)育等相關(guān)研究提供基礎(chǔ)材料。為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：其技術(shù)構(gòu)思是：一種團(tuán)頭魴原代骨組織細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，取團(tuán)頭魴的尾椎骨及肋骨及周圍結(jié)締組織，在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中用培養(yǎng)基浸泡組織塊，使細(xì)胞從組織塊內(nèi)遷出；待匯合度達(dá)到80％后，用胰蛋白酶消化收集貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，即獲得團(tuán)頭魴原代骨組織細(xì)胞；在此基礎(chǔ)上，將細(xì)胞重懸后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。一種團(tuán)頭魴骨組織細(xì)胞培養(yǎng)的方法，其步驟是：1)選取3月齡生長(zhǎng)狀況良好的團(tuán)頭魴為材料，實(shí)驗(yàn)前用體積比為0.01％高錳酸鉀溶液浸泡20分鐘。放入無菌操作臺(tái)內(nèi)，用75％酒精對(duì)魚體進(jìn)行消毒。2)用消毒過的手術(shù)刀剪去尾鰭，剝離魚體表皮膚后，在解剖顯微鏡下剝離尾椎及肋骨周圍的肌肉，僅取靠近團(tuán)頭魴(新鮮或已死亡)尾椎和肋骨的結(jié)締組織。3)pbs(ph＝7.4)沖洗3次后，用眼科剪將組織塊剪碎至2mm3。將組織塊在胎牛血清中潤濕后，用鑷子將其放入培養(yǎng)瓶底部，25cm2培養(yǎng)瓶約接種20個(gè)組織塊；4)將培養(yǎng)瓶放入28℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)4小時(shí)后，輕輕翻面，使組織塊慢慢浸潤在m-199培養(yǎng)基[含體積分?jǐn)?shù)為1％雙抗、20％胎牛血清、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(egf)25ng/ml、人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bfgf)25ng/ml]中；5)每日觀察細(xì)胞遷出情況，大概3天更換一次培養(yǎng)基，每次換液量為1/3。6)20天左右細(xì)胞匯合度達(dá)到80％后進(jìn)行胰蛋白酶消化傳代，一瓶細(xì)胞1：1傳至兩個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，獲得團(tuán)頭魴原代骨組織細(xì)胞；7)待團(tuán)頭魴原代骨組織細(xì)胞的匯合度達(dá)到70～80％時(shí)使用胰蛋白酶進(jìn)行細(xì)胞的消化傳代，細(xì)胞離心后重懸，接種于兩個(gè)新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，獲得傳代細(xì)胞。作為可選方式，在上述方法中，利用骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞特性采用堿性磷酸酶(alp)、茜素紅(alizarinred)染色、vonkossa’s染色、giemsa染色、魚骨鈣素elisa檢測(cè)對(duì)所得原代細(xì)胞進(jìn)行鑒定。作為可選方式，在上述方法中，取第10代細(xì)胞，秋水仙素處理后，統(tǒng)計(jì)中期分裂相染色體數(shù)目并制作染色體分析模型。作為可選方式，在上述方法中，提取傳代細(xì)胞rna，對(duì)成骨細(xì)胞分化起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子runx2a/b及osterix進(jìn)行半定量及定量檢測(cè)。采用組織塊法培養(yǎng)團(tuán)頭魴骨組織細(xì)胞，方法簡(jiǎn)單易行且成本較低，解決了因樣品大小而造成的技術(shù)困難，并且避免了酶消化培養(yǎng)法中胰蛋白酶給組織塊帶來的傷害。通過此方法，可培養(yǎng)純度較高的骨組織細(xì)胞，細(xì)胞的生物學(xué)特性穩(wěn)定且增殖能力強(qiáng)，為日后關(guān)骨組織細(xì)胞分化過程、骨骼發(fā)育、骨組織礦化過程、基因篩選與功能分析等方面的研究提供了基礎(chǔ)材料。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：以團(tuán)頭魴3月齡幼魚尾椎骨及肋骨及周圍結(jié)締組織為實(shí)驗(yàn)材料，采用組織塊法培養(yǎng)骨組織細(xì)胞，有效避免了酶消化培養(yǎng)方法對(duì)細(xì)胞的傷害。獲取的團(tuán)頭魴骨組織細(xì)胞，細(xì)胞呈梭形或多邊形，輪廓清晰。細(xì)胞生物學(xué)特性鑒定結(jié)果顯示細(xì)胞堿性磷酸酶，鈣化結(jié)節(jié)茜素紅染色，礦化結(jié)節(jié)vonkossa’s法染色均呈陽性結(jié)果，表明所培養(yǎng)的細(xì)胞具有典型骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞生物學(xué)活性；魚骨鈣素elisa試劑盒檢測(cè)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中骨鈣素含量為997.25ng/l；另外，熒光定量pcr結(jié)果顯示特異性調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子runx2a、runx2b和osterix基因在團(tuán)頭魴骨組織細(xì)胞系中均有表達(dá)，且runx2b和osterix的表達(dá)量顯著高于團(tuán)頭魴肌肉細(xì)胞系(p<0.05)。獲得具有良好的增殖活性，生長(zhǎng)速度快，且能連續(xù)傳代增殖的團(tuán)頭魴骨組織細(xì)胞系(megalobramabonecells,mbcs)，為日后魚類骨組織體外實(shí)驗(yàn)研究奠定了一定基礎(chǔ)。附圖說明圖1為一種組織塊培養(yǎng)20天后在放大倍數(shù)為10倍的光鏡下拍的照片示意圖；此時(shí)可見大量細(xì)胞已從組織塊邊緣遷出；圖2為一種細(xì)胞經(jīng)傳代2天后在10倍的光鏡下拍攝的照片示意圖；圖3為一種采用茜素紅染色后放大倍數(shù)為10倍的光鏡下拍攝的照片示意圖，鈣化結(jié)節(jié)被染成紅色(箭頭所指為陽性區(qū)域)；圖4為一種采用堿性磷酸酶試劑盒染色后在放大倍數(shù)為10倍的光鏡下拍攝的照片示意圖，陽性區(qū)域胞內(nèi)可見棕色沉淀(箭頭所指為陽性區(qū)域)；圖5為一種采用vonkossa’s染色后在放大倍數(shù)為10倍的光鏡下拍攝的照片示意圖，礦化結(jié)節(jié)被染成黑色(箭頭所指為陽性區(qū)域)；圖6為一種采用geimsa染色后在放大倍數(shù)為10倍的光鏡下拍攝的照片示意圖，可見細(xì)胞核被染成深藍(lán)色，位于細(xì)胞中央；圖7為一種采用秋水仙素處理后，染色體中期分裂相圖及制備的染色體模型圖，計(jì)數(shù)得骨組織細(xì)胞中期分裂相的染色體數(shù)目2n＝48，進(jìn)行核型分析后結(jié)果顯示，團(tuán)頭魴骨組織細(xì)胞48條染色體中有13對(duì)中部著絲粒染色體(m)，9對(duì)亞中部著絲粒染色體(sm)及2對(duì)亞端部著絲粒染色體(st)，核型公式為2n＝26m+18sm+4st，符合團(tuán)頭魴的染色體特征(請(qǐng)見：祝冬梅.團(tuán)頭魴三種細(xì)胞系的建立、鑒定及其初步應(yīng)用[d].華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2013)；圖8為一種采用魚骨鈣素(ot)elisa試劑盒檢測(cè)所培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)的骨鈣素含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖，計(jì)算可得細(xì)胞樣品中魚骨鈣素濃度平均值為997.25ng/l；圖9為一種runx2a，runx2b和osterix在樣品中的半定量表達(dá)結(jié)果(β-actin為內(nèi)參基因)示意圖，可見三個(gè)基因在團(tuán)頭魴骨組織細(xì)胞中均有一定表達(dá)；圖10為一種runx2a，runx2b和osterix在樣品及團(tuán)頭魴肌肉細(xì)胞中的定量表達(dá)結(jié)果，結(jié)果顯示runx2a的表達(dá)最為豐富，runx2b及osterix次之，且團(tuán)頭魴骨組織細(xì)胞各基因的表達(dá)量顯著高于團(tuán)頭魴肌肉細(xì)胞系(p<0.05)，此結(jié)果表明根據(jù)本實(shí)驗(yàn)方法所培養(yǎng)的團(tuán)頭魴骨組織細(xì)胞具有較高的純度。具體實(shí)施方式實(shí)施例1：一種團(tuán)頭魴骨組織細(xì)胞培養(yǎng)的方法，其步驟是：1)選取3月齡生長(zhǎng)狀況良好的團(tuán)頭魴為材料(新鮮或已死亡)，實(shí)驗(yàn)前用體積比為0.01％高錳酸鉀溶液浸泡20分鐘。放入無菌操作臺(tái)內(nèi)，用75％(體積比)酒精對(duì)魚體進(jìn)行消毒；2)用消毒過的手術(shù)刀在無菌條件下剪去尾鰭，自泄殖孔后方向上切下整個(gè)尾部，鑷子小心剝離皮膚后，將組織塊浸潤在pbs中，在解剖顯微鏡下用眼科鑷及手術(shù)刀剝離尾椎及肋骨周圍的肌肉，取靠近團(tuán)頭魴(新鮮或已死亡)尾椎和肋骨的結(jié)締組織；3)在培養(yǎng)皿內(nèi)使用pbs沖洗組織塊3次后，用眼科剪將其剪碎至2mm3；將組織塊逐一在胎牛血清中潤濕后，用鑷子將其小心放入培養(yǎng)瓶底部，25cm2培養(yǎng)瓶約接種20個(gè)組織塊；4)放入28℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)4小時(shí)后，輕輕翻面，使組織塊慢慢浸潤在m-199培養(yǎng)基(含1％雙抗、20％胎牛血清、25ng/mlegf、25ng/mlbfgf)中；5)每日觀察細(xì)胞遷出情況，大概3天更換一次培養(yǎng)基(m-199培養(yǎng)基)，每次換液量為1/3；6)20天后可觀察到細(xì)胞逐漸遷移占據(jù)大部分底部(圖1)，單個(gè)細(xì)胞呈梭形或多邊形，輪廓清晰；7)待瓶底貼壁細(xì)胞匯合度達(dá)到80％后，使用體積分?jǐn)?shù)為0.25％的胰蛋白酶消化傳代，一瓶細(xì)胞傳至兩個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，獲得團(tuán)頭魴原代骨組織細(xì)胞(圖2)；8)待團(tuán)頭魴原代骨組織細(xì)胞的匯合度達(dá)到70～80％時(shí)繼續(xù)使用胰蛋白酶進(jìn)行細(xì)胞的消化傳代，細(xì)胞離心后重懸，接種于兩個(gè)新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)；9)取第二代骨組織細(xì)胞，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，2天待細(xì)胞匯合度達(dá)到80％時(shí)，經(jīng)茜素紅鈣化結(jié)節(jié)染色(圖3)、堿性磷酸酶試劑盒染色(圖4)、vonkossa’s礦化結(jié)節(jié)染色(圖5)及giemsa細(xì)胞核染色(圖6)對(duì)所培養(yǎng)的骨組織細(xì)胞進(jìn)行鑒定。染色結(jié)果顯示團(tuán)頭魴骨組織細(xì)胞細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，生物學(xué)特性鑒定結(jié)果呈大量陽性區(qū)域；10)取第10代團(tuán)頭魴骨組織細(xì)胞，傳代2天后，更換5ml新鮮培養(yǎng)液，加入0.1ml秋水仙素(1μg/ml)培養(yǎng)12小時(shí)，胰蛋白酶消化重懸后，進(jìn)行染色體制片，高倍顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)目(圖7)；11)根據(jù)上海雙贏生物魚骨鈣素elisa試劑盒使用說明，利用機(jī)械法(反復(fù)凍融)破壞第5代骨組織細(xì)胞，釋放細(xì)胞內(nèi)成分。使用魚骨鈣素elisa試劑盒對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞骨鈣素含量進(jìn)行測(cè)定。抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物使底物顯色后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算得到樣品中魚骨鈣素濃度(圖8)；12)取匯合度達(dá)到80％的第5代骨組織細(xì)胞，pbs洗滌兩次后，每個(gè)25cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入1mltrizol，混勻后室溫(20-25℃)靜置5分鐘。提取rna，瓊脂糖電泳鑒定，紫外分光光度計(jì)測(cè)定od值。將rna反轉(zhuǎn)錄后，以β-actin為內(nèi)參，利用primerpremier5.0合成runx2a，runx2b，osterix上下游引物(表1)，通過瓊脂糖電泳條帶亮度初步判斷基因表達(dá)情況(圖9)。采用sybrgreenⅱdye試劑，按照熒光定量pcr操作指南運(yùn)行，利用2－△△ct法(請(qǐng)見：livakkj,schmittgentd.analysisofrelativegeneexpressiondatausingreal-timequantitativepcrandthe2-△△ctmethod[j].methods,2001,25(4):402-408.)計(jì)算，得到基因在骨組織細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況(圖10)。表1基因表達(dá)所用引物及pcr信息當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12