一種新型DC?CTLs細(xì)胞培養(yǎng)體系及其培養(yǎng)方法【專利摘要】本發(fā)明提供了一種新型DC?CTLs細(xì)胞培養(yǎng)體系及其培養(yǎng)方法。體內(nèi)和體外的研究表明樹突狀細(xì)胞（DCs）和細(xì)胞毒T細(xì)胞（CTLs）在相互作用中一方面產(chǎn)生刺激性信號(hào)激活CTL發(fā)揮抗腫瘤、抗病毒的作用，另一方面則產(chǎn)生抑制性信號(hào)使免疫反應(yīng)控制在合理的范圍，以免過(guò)強(qiáng)的免疫反應(yīng)對(duì)機(jī)體造成傷害?；谏鲜鲈?，我們利用PD?1的抑制劑優(yōu)化DC?CTL培養(yǎng)體系，并在體外檢測(cè)該體系培養(yǎng)的CTLs對(duì)腫瘤細(xì)胞MCF10的特異殺傷活性。結(jié)果表明我們改進(jìn)的培養(yǎng)體系能顯著增強(qiáng)CTL對(duì)腫瘤細(xì)胞MCF10的特異殺傷。該培養(yǎng)體系培養(yǎng)的DC?CTL可以用于臨床腫瘤的免疫細(xì)胞治療?！緦＠f(shuō)明】_種新型DG-GTLs細(xì)胞培養(yǎng)體系及其培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001]本發(fā)明涉及一種新型DC-CTLs細(xì)胞培養(yǎng)體系及其培養(yǎng)方法，用于細(xì)胞免疫治療領(lǐng)域，但DC和CTL相互作用過(guò)程中，DC細(xì)胞會(huì)表達(dá)ro-Ll，而激活的CTL細(xì)胞會(huì)誘導(dǎo)表達(dá)ro-1，因而，ro-1/PD-Ll途徑對(duì)CTL的增殖和減弱影響對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用?；谏鲜隼碛?，我們?cè)贒C-CTL共培養(yǎng)體系中加入ro-Ι的抑制劑可以阻斷PD-1和PD-Ll的結(jié)合，從而有助于刺激CTL的增殖和對(duì)腫瘤的殺傷功能。此外，DC-CTL培養(yǎng)體系的建立過(guò)程中需要其它細(xì)胞因子，優(yōu)化了整個(gè)培養(yǎng)體系和CTL回輸前的處理?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]癌癥問(wèn)題日趨嚴(yán)峻，癌癥的預(yù)防與控制面臨巨大挑戰(zhàn)。世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究中心認(rèn)為，未來(lái)癌癥發(fā)病人數(shù)年均將會(huì)以3%?5%的速度遞增，預(yù)計(jì)2020年全球?qū)⒂?000萬(wàn)癌癥新發(fā)病例，死亡病例將達(dá)1400萬(wàn)。據(jù)《2012年中國(guó)腫瘤登記年報(bào)》報(bào)告，我國(guó)腫瘤發(fā)病率和死亡率的概況為:每10萬(wàn)人有286人患癌，腫瘤發(fā)病率隨人群年齡逐漸上升，特別是50歲以上隨年齡增加而大幅上升，50歲以上占全部發(fā)病的80%以上，每年腫瘤死亡人數(shù)為140-150萬(wàn)。[0003]常規(guī)的腫瘤治療手段，即手術(shù)、放療和化療，對(duì)于進(jìn)展性的或晚期腫瘤仍然束手無(wú)策，許多腫瘤患者最終死于腫瘤的轉(zhuǎn)移和耐藥。由于腫瘤變異的特性，腫瘤對(duì)常規(guī)放射和化學(xué)治療有明顯的反彈效應(yīng)。例如，當(dāng)細(xì)胞毒性化療藥物將大部分腫瘤細(xì)胞摧毀后，少量對(duì)這種藥物有抗性的細(xì)胞仍有能力成為新的腫瘤灶。更糟的是，這種腫瘤對(duì)先前有效的治療不再產(chǎn)生反應(yīng)，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞在細(xì)胞毒性藥物的選擇壓力下會(huì)產(chǎn)生抗性。即在正常條件下存活而被選擇出來(lái)的那部分腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致了腫瘤的復(fù)發(fā)、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。因?yàn)槟[瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的遺傳可塑性，所以對(duì)任何致死性壓力的抗性，都可以在腫瘤細(xì)胞群體中被進(jìn)化選擇出來(lái)。要成功地治療腫瘤，可能需要多種針對(duì)腫瘤細(xì)胞不同存活機(jī)制的靶向制劑。[0004]通常有兩種解決方法:攻擊腫瘤細(xì)胞本身改變成攻擊維持腫瘤生長(zhǎng)和存活的環(huán)境，或者使免疫系統(tǒng)像對(duì)付感染那樣去殺傷腫瘤細(xì)胞。前一種策略，就其本質(zhì)而言是被動(dòng)的，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞是被間接的途徑所殺傷。例如，抗血管生長(zhǎng)治療阻斷腫瘤的血液供應(yīng)，從而間接地殺傷腫瘤。這種治療不容易誘導(dǎo)產(chǎn)生抗性，因?yàn)槟[瘤環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞在基因組上相對(duì)穩(wěn)定。然而，由于其被動(dòng)型，這種治療仍然因腫瘤細(xì)胞的演化而容易復(fù)發(fā)，例如抗血管生長(zhǎng)治療中，血管又會(huì)再現(xiàn)，可能因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)和低氧環(huán)境導(dǎo)致腫瘤干細(xì)胞的產(chǎn)生。與此相反，一種主動(dòng)的、更具吸引力的策略是，在腫瘤患者中“喚醒”主動(dòng)免疫反應(yīng)，使其參與抗腫瘤治療。這種策略的主要作用是規(guī)避腫瘤的異質(zhì)性，而這種異質(zhì)性是腫瘤細(xì)胞對(duì)選擇壓力反應(yīng)的結(jié)果。在這點(diǎn)上，免疫系統(tǒng)特別適合于清除少量殘存的腫瘤細(xì)胞，尤其是那種放療和化療很難殺滅的靜止期細(xì)胞或腫瘤干細(xì)胞，這有助于延長(zhǎng)患者無(wú)瘤生存期并提高其生活質(zhì)量。[0005]目前國(guó)內(nèi)外非常關(guān)注免疫細(xì)胞治療腫瘤。從上個(gè)世紀(jì)的80年代的LAK細(xì)胞，到1989年的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine-1nducedkillers,CIKs)，腫瘤侵潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TILs)，這些免疫細(xì)胞治療腫瘤無(wú)疑為患者的治療帶來(lái)了福音。2010年FDA批準(zhǔn)DC細(xì)胞疫苗治療前列腺癌具有里程碑意義，世界各國(guó)已有200多項(xiàng)治療各種不同腫瘤的DC疫苗進(jìn)入臨床Ι、Π期。近年來(lái)除了DC細(xì)胞疫苗外，其他免疫細(xì)胞和DCs聯(lián)合使用用于腫瘤的治療JnDC-CIK，DC-CTL和DC-NK，其中CIK應(yīng)用較為廣泛，DC-CIKs或CTL較單純的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)腫瘤的治療效果好，主要由于DC和效應(yīng)細(xì)胞CIKs和CD8+T之間的相互作用，增加了效應(yīng)細(xì)胞對(duì)腫瘤的特異殺傷和效應(yīng)細(xì)胞的活化。但DC細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞的相互作用非常復(fù)雜，不僅存在MHC-1-表位多肽復(fù)合物和T細(xì)胞受體(TCR)作用的第一信號(hào)(signal-Ι)和共刺激分子和其受體之間的作用的第二信號(hào)(signal-2)，以及細(xì)胞因子刺激的第三信號(hào)(signal-3)(參見(jiàn)圖1)。[0006]第一信號(hào)的產(chǎn)生是病原體感染DC細(xì)胞或DC細(xì)胞攝取突變或轉(zhuǎn)化細(xì)胞后，對(duì)抗原進(jìn)行加工處理，并把抗原表位和主要組織相關(guān)性復(fù)合物(MHC)結(jié)合成MHC/抗原表位復(fù)合物，然后成熟的DCs迀徙到類淋巴組織，把抗原信息呈遞給輔助性T細(xì)胞或交叉遞呈給⑶8+T細(xì)胞，誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)病原體或轉(zhuǎn)化細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)。顯然，抗原表位和MHC分子的結(jié)合是啟動(dòng)特異免疫反應(yīng)的關(guān)鍵步驟之一。[0007]多肽免疫治療的吸引力在于是有效T細(xì)胞反應(yīng)的最小必需原件:MHC-1和/或II表位肽，制備簡(jiǎn)單方便。但是，當(dāng)用多肽疫苗觀察免疫反應(yīng)時(shí)，有臨床療效的少，表明其免疫原性弱。MHC相關(guān)不變鏈(Ii)的一部分能加強(qiáng)MHC-1I表位電荷，導(dǎo)致抗原特異的⑶4+Th激活。這一策略的有效性在各種不同的體外體系、動(dòng)物模型和臨床實(shí)驗(yàn)中得到了證明。I1-key雜交技術(shù)代表一個(gè)安全有效的多肽免疫治療策略，在臨床實(shí)驗(yàn)中顯示有療效。[0008]MHC-1I在抗原呈遞細(xì)胞合成后不久，MHC-1I異二聚體形成與在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的不變鏈(Ii蛋白)組裝，從高爾基復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)吞作用途徑，大部分Ii被低PH液泡中的蛋白酶從MHC-1I分子上除去，僅剩下稱為II類相關(guān)不變鏈多肽(CLIP)的Ii蛋白水解片斷[CresswellP.Assembly,transport,andfunct1nofMHCclass11molecules.AnnRevImmunol1994;12:259-93]XLIP作為在MHC-1I表位-結(jié)合溝中的看護(hù)者，抑制構(gòu)象改變[NatarajanSKjAssadiMjSadegh-NasseriS.StablepeptidebindingtoMHCclassIImoleculeisrapidandisdeterminedbyareceptiveconformat1nshapedbypr1rassociat1nwithlowaffinitypeptides.JImmunol1999;162(7):4030-6.L當(dāng)外源多肽結(jié)合新生的MHCII復(fù)合體后，以一個(gè)協(xié)同的方式除去CLIPtj人類的HLA-DM或小鼠的H2-M在CLIP的替代中起關(guān)鍵作用[DenzinLKjCresswellP.HLA-DMinducesCLIPdissociat1nfromMHCclassIIalphabetadimersandfacilitatespeptideloading.Cell1995;82(1):155-65.]。除了替代CLIP外，DM在極短時(shí)間內(nèi)和沒(méi)有結(jié)合表位肽的MHC-1I相互作用產(chǎn)生一個(gè)接受多肽的構(gòu)象，在抗原呈遞中選擇特異多肽/MHC-1I復(fù)合體[DenzinLKjCresswellP.HLA-DMinducesCLIPdissociat1nfromMHCclassIIalphabetadimersandfacilitatespeptideloading.Cell1995;82(I):155-65.]。最近的研究表明Ii片斷在抗原加工、表位和MHC-1I分子結(jié)合能模擬HLA-DM功能。I1-key的特性和用它修飾多肽疫苗使其成為加強(qiáng)多肽疫苗的抗原性的候選分子[ChouCL，MirshahidiS，SuKffjKimA,NarayanK，KhoruzhenkoS，etal.ShortpeptidesequencesmimicHLA-DMfunct1ns.MolImmunol2008;45(7):1935-43.]0早期研究表明Ii(小鼠I1:77-92:LRMKLPKSAKPVQMR)的一個(gè)17氨基酸多肽序列能夠大大加強(qiáng)1-E限制的抗原多肽呈遞給反應(yīng)的T細(xì)胞雜交瘤[AdamsS，HumphreysRE.1nvariantchainpeptidesenhancingorinhibitingthepresentat1nofantigenicpeptidesbymajorhistocompatibilitycomplexclassIImolecules.EurJImmunol1995;25(6):1693-702.L序列的C末端刪去后，剩余(后來(lái)稱為I1-Key)N末端的LRMKLPK多肽，仍保留了大部分活性[AdamsS，Alberic1F，AlsinaJ，SmithER，HumphreysRE.B1logicalactivityandtherapeuticpotentialofhomologsofanIipeptidewhichregulatesantigenicpeptidebindingtocellsurfaceMHCclassIImolecules.Arzneimittelforschung1997;47(9):1069-77.]。Ii蛋白的這個(gè)片斷能夠與MHC-1I分子的別構(gòu)位點(diǎn)結(jié)合，方便以前結(jié)合的多肽釋放，加強(qiáng)了新的多肽與MHC-1I的結(jié)合[XuMjJacksonRjAdamsS，HumphreysRE.StudiesonactivitiesofinvariantchainpeptidesonreleasingorexchangingofantigenicpeptidesathumanLeukocyteantigen-DRl.Arzneimittelforschung1999;49(9):791-9.]。為了強(qiáng)化MHC-1I表位肽疫苗的能力，I1-Key/表位雜交體通過(guò)I1-Key核心基序LRMK通過(guò)一個(gè)簡(jiǎn)單的多聚亞甲基橋和MHC-11表位的N末端連接而成[HumphreysRE，AdamsS，KoldzicG，NedelescuB，vonHofeE，XuM.1ncreasingthepotencyofMHCclassI1-presentedepitopesbylinkagetoI1-Keypeptide.Vaccine2000;18(24):2693-7.]。最初11_1(#/?6(1:(aa95-104)的雜交體的體外T細(xì)胞雜交瘤的增殖研究顯示I1-Key/PGCC(aa95-104)雜交體刺激PGCC(aa95_104)T細(xì)胞雜交瘤較PGCC(aa95-104)表位肽強(qiáng)200-250倍[11]接下來(lái)的研究顯示來(lái)源不同相關(guān)疾病的Th細(xì)胞體內(nèi)外I1-Key雜交體疫苗的作用[KallinterisNLjLuXjWuS，HuH，LiY，GulfoJVjetal.11-Key/MHCclassIIepitopehybridpeptidevaccinesforHIV.Vaccine2003;21(27-30):4128-32；KalIinterisNLjWuS，LuXjvonHofeE，HumphreysRE，XuM.LinkageofI1-Keysegmenttogpl00(46_58)epitopeenhancestheproduct1nofepitope-specificantibodies.Vaccine2005;23(17-18):2336-8；KalIinterisNLjWuS，LuXjHumphreysRE，vonHofeE，XuM.EnhancedCD4+T_cellresponseinDR4-transgenicmicetoahybridpeptideIinkingtheI1-Keysegmentoftheinvariantchaintothemelanomagpl00(48_58)MHCclass11epitope.JImmunother2005;28(4):352-8；XuM，LuXjSposatoM，ZinckgrafJffjWuS，vonHofeE.11-Key/HPV16E7hybridpeptideimmunotherapyforHPVl6+cancers.Vaccine2009;27(34):4641-7；GiIloglyME,KallinterisNLjXuM，GulfoJVjHumphreysRE，MurrayGL.11-Key/HER-2/neuMHCclass-1Iantigenicepitopevaccinepeptideforbreastcancer.CancerImmunolImmunother2004;53(6):490-6；VoutsasIF，GritzapisADjMahairaLGjSalagianniM，vonHofeE，KallinterisNLjetal.1nduct1nofpotentCD4+T~ceI1-mediatedantitumorresponsesbyahelperHER-2/neupeptideIinkedtotheI1-Keymoietyoftheinvariantchain.1ntJCancer2007;121(9):2031-41.]。AE37，是一個(gè)HER2表位肽和I1-key的雜交體，即使沒(méi)有GM-CSF佐劑下免疫腫瘤患者，能誘導(dǎo)產(chǎn)生CD4+T細(xì)胞和抗-HER2免疫反應(yīng)[HolmesJP，BenavidesLC，GatesJD，CarmichaelMG，HuemanMT，MittendorfEA，etal.ResultsofthefirstphaseIclinicaltrialofthenovelI1-keyhybridpreventiveHER-2/neupeptide(AE37)vaccine.JClinOncol2008;26(20):3426-33;GatesJD，CliftonGT，BenavidesLC，SearsAK，CarmichaelMG，HuemanMT，etal.CirculatingregulatoryT-cells(CD4+CD25+F0XP3+)decreaseinbreastcancerpatientsaftervaccinat1nwithamodifiedMHCclassIIHER2/neu(AE37)peptide.Vaccine2010;28(47):7476-82；PerezSAjKallinterisNL,BisiasS，TzonisPKjGeorgakopoulouK，Varla-Lefther1tiM，etal.ResultsfromaphaseIclinicalstudyofthenovelIi_Key/HER-2/neu((aa776_790))hybridpeptidevaccineinpatientswithprostatecancer.ClinCancerRes2010;16(13):3495-506.]。圖2描述了I1-Key/表位肽和MHC-1I結(jié)合。表明I1-Key/抗原表位肽能夠“劫持”以前的表位肽，讓與I1-Key融合的抗原表位肽與MHC-1I分子結(jié)合，無(wú)需通過(guò)DC細(xì)胞對(duì)抗原加工處理。[0009]圖1顯示效應(yīng)細(xì)胞激活后產(chǎn)生共抑制性信號(hào)，以減弱因效應(yīng)細(xì)胞過(guò)度激活對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的傷害，這種抑制性受體被稱為“免疫檢查點(diǎn)(immunecheckpoint)”主要有FD-1和共抑制性受體，如CTLA_4，B和T淋巴細(xì)胞減弱因子(BandTLymphocyteAttenuator，BTLA或CD272)，Tim_3(TcellImmunoglobulinandMucindomain-3),LAG-3(LymphocyteActivat1nGene-3)等。其中TO-l/PD-Ll信號(hào)途徑是最重要的途徑之一，大量證據(jù)表明H)-1是一個(gè)共抑制受體，在活化的T細(xì)胞表達(dá)，負(fù)調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能【DrewM.Pardoll.Theblockadeofimmunecheckpointsincancerimmunotherapy.NATUREREVIEWS|CANCER.2012，12(253):252-264.】。例如，PD-1在抗原-激活的CD8+T細(xì)胞高水平表達(dá)和CD8+T細(xì)胞耗損(Tcellexhaus1n)相關(guān)。被耗損的CD8+T細(xì)胞漸漸失去效應(yīng)功能，包括增殖能力、表達(dá)如IL-2、TNF-a和IFN-γ等細(xì)胞因子的能力，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡耗損的PD-1+CD8+T細(xì)胞在腫瘤的腫瘤侵潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor-1nfiltratinglymphocytes，TILs)和慢性病毒性感染得到證明【BadouaC?HansS，MerillonN，etal.PD-1-ExpressingTumor-1nfiltratingTCellsAreaFavorablePrognosticB1markerinHPV-AssociatedHeadandNeckCancer.CancerRes.2013;73(I):128-138.PaiS.AdaptiveimmuneresistanceinHPV—associatedheadandnecksquamouscellcarcinoma.0ncoImmunology.2013;2:5,e24065.SznolMandChenL.AntagonistAntibodiestoPD-1andB7-H1(PD-Ll)intheTreatmentofAdvancedHumanCancer.ClinCancerRes.2013;19(5):1021-1034.BauzonMandHermistonT.Armedtherapeuticviruses-adisruptivetherapyonthehorizonofcancerimmunotherapy.FrontiersinImmunology.2014;5:1-10.Lyford-PikeS，PengS，YoungG,etal.EvidenceforaroleofthePD-1:PD-LlpathwayinimmuneresistanceofHPV—associatedheadandnecksquamouscellcarcinoma.CancerRes.2013;73(6):1733-1741.】。但是，PD-1的表達(dá)抑制CD8+T細(xì)胞功能的確切機(jī)制未完全理解。除了ro-1、CTLA-4免疫檢查點(diǎn)外，免疫細(xì)胞內(nèi)在一些細(xì)胞因子的作用下存在抑制因子，以免免疫反應(yīng)對(duì)機(jī)體造成損害。[0010]無(wú)論是DC疫苗還是DC-CTL在體外的培養(yǎng)需要一組細(xì)胞因子。細(xì)胞因子是一類調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖的多肽小分子，其不能直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，需通過(guò)細(xì)胞因子受體介導(dǎo)，經(jīng)相應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)途徑發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。[0011]綜上所述，本發(fā)明主要是以I1-Key技術(shù)直接把抗原表位肽錨定在DCs的MHC-1I分子上，形成MHC-1I/I1-Key-抗原表位肽復(fù)合物，避免了DCs對(duì)抗原的加工處理，增強(qiáng)了MHC-1I和抗原表位的親合力，也避免了多肽抗原對(duì)MHC分子的限制性要求。另外，基于DC和CTL共培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的共抑制信號(hào)，用免疫檢查點(diǎn)Η)-1的抑制劑抑制DC-CTL相互作用產(chǎn)生的共抑制信號(hào)，并優(yōu)化CTL回輸前的流程，從而增強(qiáng)CTL后續(xù)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。在本發(fā)明中，我們以乳腺癌為研究對(duì)象，但該發(fā)明也同樣適應(yīng)于對(duì)其他腫瘤和病原體的治療，該發(fā)明經(jīng)臨床研究后可以用于腫瘤的免疫細(xì)胞治療?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0012]本發(fā)明通過(guò)生物信息學(xué)方法分析腫瘤的抗原表位肽，然后和I1-Key融合成I1-Key-抗原表位多肽，直接將該融合多肽加到培養(yǎng)的DCs，通過(guò)I1-Key將抗原表位肽錨定在DCs表面分子MHC-1I后，用腫瘤壞死因子-a(TNF-a)刺激DCs成熟后，與CTL效應(yīng)細(xì)胞共培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中加入I3D-1的單克隆抗體，濃度為lyg/ml，可以大大加強(qiáng)了CTLs對(duì)腫瘤細(xì)胞(以乳腺癌細(xì)胞系MCF-7為例)的特異殺傷作用。在本發(fā)明中，我們以乳腺癌為模型，將乳腺癌細(xì)胞系(高表達(dá)HER2)接種裸鼠，通過(guò)我們的方法培養(yǎng)的CTLs對(duì)荷瘤小鼠的治療，能顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，大大延長(zhǎng)了荷瘤小鼠的總體生存時(shí)間(p〈0.01)。[0013]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:一種新的DC-CTLs細(xì)胞培養(yǎng)體系，在CTLs細(xì)胞的培養(yǎng)體系中加入DCs細(xì)胞和I3D-1單克隆抗體，F(xiàn)1D-1單克隆抗體為GCP級(jí)別，濃度為0.5-5yg/ml，優(yōu)選的濃度為lyg/ml。[0014]所述DCs細(xì)胞采用人PBMCs通過(guò)IL-4和GM-CSF培養(yǎng)得到。[0015]所述CTLs細(xì)胞用免疫磁珠分選后計(jì)數(shù)后用IL-2誘導(dǎo)得到。[0016]所述CTLs細(xì)胞和所述DCs細(xì)胞共培養(yǎng)的比例為50:1。[0017]上述的DC激活的CTLs細(xì)胞培養(yǎng)體系用于高表達(dá)HER2+的腫瘤患者的免疫細(xì)胞治療。[0018]一種新的DC-CTLs細(xì)胞培養(yǎng)方法，DCs細(xì)胞用IL-4和GM-CSF誘導(dǎo)制備，DCs細(xì)胞培養(yǎng)后的第3天用2yg/ml的AE37脈沖24小時(shí)，加入10ng/ml的TNF-al2小時(shí)，讓DCs細(xì)胞成熟后，然后與用IL-2誘導(dǎo)得到的CTLs細(xì)胞、PD-1抑制劑單克隆抗體一起共培養(yǎng)，DCs和CTLs的比例為1:50。[0019]采用上述方法培養(yǎng)的DC-CTLs細(xì)胞，共培養(yǎng)10天后開(kāi)始治療荷瘤(本發(fā)明接種MCF-7細(xì)胞)裸鼠進(jìn)行治療，治療流程為:第一次免疫細(xì)胞的總數(shù)為107，隔一天后再回輸免疫細(xì)胞，繼續(xù)2次。[0020]上述的DCs-CTLs細(xì)胞在治療腫瘤患者或病毒性疾病中的應(yīng)用。[0021]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明所述DCs細(xì)胞先經(jīng)過(guò)Ii_Key/AE37后，與CTLs共培養(yǎng)，強(qiáng)化了CTLs細(xì)胞的擴(kuò)增數(shù)量和功能;經(jīng)過(guò)上述處理的CTLs對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性較其它對(duì)照組顯著增強(qiáng)(p〈0.01)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明該處理的DCs激活后的CTLs效應(yīng)對(duì)荷瘤小鼠的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，顯著提高小鼠總體存活時(shí)間。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明與CN201410247801.8有幾點(diǎn)不同:(1)細(xì)胞不同，上一個(gè)是用CIK細(xì)胞，CIK細(xì)胞是異質(zhì)細(xì)胞群，包括CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、NK、NKT細(xì)胞等，這個(gè)發(fā)明是被免疫磁珠純化的CTL細(xì)胞(主要是⑶+τ細(xì)胞)。(2)抑制劑部分相同，前一個(gè)專利是ro-1抑制劑和SOCSl的抑制劑，這個(gè)專利抑制劑單一，即ro-Ι抑制劑。(3)最后但最重要的是，DC-CTL的整個(gè)流程被優(yōu)化，回輸前的CTL結(jié)合了ro-1的抑制劑，規(guī)避了游離的ro-1可能的副作用以及回輸?shù)腃TL因?yàn)槊庖呶h(huán)境中的免疫抑制信號(hào)限制CTL功能的發(fā)揮，最大限度發(fā)揮回輸?shù)腃TL對(duì)特異腫瘤細(xì)胞的殺傷活性?！靖綀D說(shuō)明】[0022]圖1為DCs細(xì)胞和初始/靜息T細(xì)胞相互作用過(guò)程中的主要信號(hào)的示意圖；圖2為用抗原特異的表位肽和I1-Key融合后結(jié)合DC細(xì)胞的示意圖；圖3為DCs細(xì)胞培養(yǎng)第3天，細(xì)胞貼壁成團(tuán)，部分呈半懸浮狀態(tài)；圖4為熒光標(biāo)記的AE37錨定DCs的激光共聚焦顯微鏡觀察到的圖片；圖5DCs細(xì)胞未成熟和成熟的表型分析；圖6用LDH釋放實(shí)驗(yàn)分析DC-CTLs細(xì)胞對(duì)MCF-7的殺傷活性?！揪唧w實(shí)施方式】[0023]一、樹突狀細(xì)胞(dendriticcells,DCs)細(xì)胞的培養(yǎng)l、DCs細(xì)胞的培養(yǎng)人DCs細(xì)胞的培養(yǎng)方法如下:采取健康外周血80毫升，用淋巴細(xì)胞分離液分離并得到PBMCs，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按照106細(xì)胞/ml鋪在細(xì)胞培養(yǎng)瓶，4小時(shí)候除去懸浮細(xì)胞，用含rhuGM-CSF(20ng/ml，PeproTech)和rhuIL_4(20ng/ml，PeproTech)的完全培養(yǎng)液進(jìn)彳丁培養(yǎng)，細(xì)胞在培養(yǎng)第2d棄培養(yǎng)液上清，并用新鮮含rhuGM-CSF和rhuIL_4培養(yǎng)基代替，經(jīng)過(guò)24h培養(yǎng)，沒(méi)有粘附的粒細(xì)胞被去掉。用流式細(xì)胞儀分析培養(yǎng)3天DCs的表型，如圖3所示。圖2表明DCs培養(yǎng)第3天，細(xì)胞貼壁成團(tuán)，同TNF-α處理后部分呈半懸浮狀態(tài)。[0024]2、DCs表型檢測(cè)流式細(xì)胞儀檢測(cè)不成熟和成熟DC細(xì)胞的表面標(biāo)記物。調(diào)細(xì)胞濃度為2X105/ml，分別加入Iμ?FITC標(biāo)記的小鼠⑶80、⑶83、⑶86單抗，設(shè)立空白對(duì)照。4°(:避光反應(yīng)30min，洗滌后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。流式細(xì)胞檢測(cè)操作流程:1)DCs細(xì)胞培養(yǎng)5d后，離心800r/min，7min，棄上清；2)含2%牛血清的I3BS洗液Iml洗滌2次；3)分別加標(biāo)記抗體(CD80，CD83，CD86)lyl至終濃度為5mg/L;陰性對(duì)照組加入FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG，終濃度為5mg/L；4)4°C避光輕度震蕩30min，用ImlPBS洗滌2次；5)加入400μ?I%多聚甲醛進(jìn)行固定；6)4°(:暗處保存，上機(jī)分析。[0025]3.ΑΕ37錨定DCs將以FITC-AE37和和Cy5-AE37以濃度lyg/mI加到DCs培養(yǎng)后的三天的培養(yǎng)物中，24小時(shí)觀察結(jié)果。此外，先加Cy5-AE3612小時(shí)，然后加入FITC-AE37后12小時(shí)再用熒光顯微鏡觀察結(jié)果。結(jié)果(圖5)表明:DCs細(xì)胞在細(xì)胞因子IL-4和GM-CSF誘導(dǎo)下形成具有典型特征的樹突狀的細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析表達(dá)CD40，CD80和CD86。當(dāng)FITC-AE37和Cy5-AE36均能結(jié)合到培養(yǎng)的DCs上，但當(dāng)Cy5-AE36先加入到DCs培養(yǎng)物后12小時(shí)，再加入FITC-AE37后在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，紅色的熒光減少甚至消失，而綠色的熒光增加，幾乎占整個(gè)細(xì)胞表面的絕大部分(圖4)。此外，如果先加入FITC-AE37后加入Cy5-AE36仍然只看見(jiàn)綠色熒光。該結(jié)果表明AE37能夠“劫持”已經(jīng)和MHC結(jié)合的AE36，DCs無(wú)需對(duì)錨定抗原進(jìn)行加工處理，能直接和錨定抗原結(jié)合，顯然能提高DCs的抗原負(fù)載效率。[0026]圖4表示的是AE36、AE37和DCs上的MHC的結(jié)合。A:普通光學(xué)顯微鏡下觀察到的DCs細(xì)胞;B:Cys-AE36和DCs的結(jié)合;C:DCs先與Cy5_AE36結(jié)合后12小時(shí)加入FITC-AE37后12小時(shí)觀察的DCs;D:DCs先與Cy5-AE36結(jié)合后12小時(shí)加入FITC-AE37后24小時(shí)觀察的DCs。[0027]二、殺傷細(xì)胞(cytokine-1nducedkillers,CIKs)的培養(yǎng)1、單核細(xì)胞(PBMC)的分離培養(yǎng)1)采取健康人的外周血50ml，檸檬酸鈉抗凝；2)取50ml離心管，加入Ficoll淋巴細(xì)胞分離液，靜脈血在距分層液界面上Icm處沿離心管壁緩慢加到淋巴細(xì)胞分離液上，切勿混勻;稀釋血與淋巴分離液的柱高之比為1.5:1，且兩者總柱高不超過(guò)試管2/3;3)將離心管置水平離心機(jī)內(nèi)，室溫中2000r/min離心20min。離心后，管內(nèi)可分為4層:①上層為血漿、大部分血小板和血液稀釋液;②下層為粒細(xì)胞和紅細(xì)胞;③中層為淋巴細(xì)胞分離液;④分離液與血漿交界部位的灰白色層為單個(gè)核細(xì)胞層；4)用毛細(xì)吸管輕輕插入灰白色層，沿管壁輕輕吸出灰白色單個(gè)核細(xì)胞，移入另一支無(wú)菌離心管；5)將所得到PBMC懸液用I倍體積PBS洗滌I次，1000r/min離心5min，棄上清；6)再加入2倍體積的PBS洗滌，懸浮細(xì)胞，手工計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，I000r/min離心5min，棄上清，獲取底層淋巴細(xì)胞；7)用無(wú)血清(FCS)培養(yǎng)液懸浮PBMC，獲得終濃度為5xl06/ml的懸浮細(xì)胞;8)用臺(tái)盼藍(lán)染液檢查所分離的細(xì)胞活性:取2滴細(xì)胞懸液加I滴2%臺(tái)盼藍(lán)染液，5min后高倍鏡檢，死細(xì)胞染成藍(lán)色，活細(xì)胞不著色，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算活細(xì)胞百分率，一般細(xì)胞活性應(yīng)在95%以上。[0028]2.CTLs細(xì)胞的培養(yǎng)外周血PBMCs經(jīng)過(guò)FicolI淋巴細(xì)胞分離液分離后得到PBMCs，用含2%BSA的生理鹽水洗滌2次后，用免疫磁珠分選CTLs細(xì)胞，離心后，調(diào)整細(xì)胞密度為106/ml，用含10%的FBS和IL-2(1000IU/ml)的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。CTLs培養(yǎng)后的第5天將培養(yǎng)好的DCs以5:1的比例共培養(yǎng)，培養(yǎng)基為用含10%的FBS和IL-2(1000IU/ml)的1640培養(yǎng)基，另外加入I3D-1的單克隆抗體，共培養(yǎng)到第10天，收獲細(xì)胞。用流式細(xì)胞儀分析CTLs的表面分子⑶3，⑶56，⑶4，⑶8等。[0029]3.鏡下觀察CTLs分離后增殖。[0030]顯微鏡下觀察CTLs細(xì)胞增殖成熟情況，如圖3所示，CTLs加入刺激因子培養(yǎng)24?48h開(kāi)始出現(xiàn)小的克隆團(tuán)，72h達(dá)高峰，如出現(xiàn)大量懸浮細(xì)胞克隆團(tuán)，需用滴管吹散，并補(bǔ)充培養(yǎng)液。每天觀察2次細(xì)胞生長(zhǎng)情況，根據(jù)細(xì)胞克隆團(tuán)生長(zhǎng)情況和培養(yǎng)液顏色補(bǔ)充培養(yǎng)液，該過(guò)程不換液，只加液，隨著細(xì)胞的擴(kuò)增，傳代分瓶。[0031]4.流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)DCs，CTLs表型在分離培養(yǎng)第3天至第8天，使用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)不成熟和成熟DCs細(xì)胞、CTLs細(xì)胞的表型。[0032]在上述不同時(shí)間收集DCs細(xì)胞I3BS洗滌一次，1000r/min離心1min收集細(xì)胞。每管105個(gè)細(xì)胞分裝5測(cè)定管，分別加入抗小鼠的單抗CD80(FITC)，CD83(FITC)，CD86(PE)。同型對(duì)照為鼠IgG，室溫孵育3011^11。？83洗滌1次，加入50(^1PBS上流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。利用軟件分析數(shù)據(jù)，如圖5所示。[0033]在上述不同時(shí)間收集CTLs細(xì)胞PBS洗滌I次，1000r/min離心1min收集細(xì)胞，每管105個(gè)細(xì)胞分裝5測(cè)定管，分別加入抗小鼠的單抗⑶3(FITC)/⑶4(PE)，⑶3(FITC)/CD8(PE)，CD3(FITC)/CD56(PE)。同型對(duì)照為鼠IgG，室溫孵育30miruPBS洗滌I次，加入500μ1PBS上流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析，利用軟件分析數(shù)據(jù)。[0034]結(jié)果表明用一組細(xì)胞因子可以在體外培養(yǎng)CTLs細(xì)胞和DCs細(xì)胞。DCs細(xì)胞成熟后其表面標(biāo)記分子⑶83和⑶80顯著增加，而⑶14則顯著減少，但⑶40和⑶86變化不明顯。CTLs的表型為CD3+CD4-CD8+。[0035]三、DC-CTLs共培養(yǎng)體系DCs細(xì)胞和CTLs細(xì)胞的培養(yǎng)按照前面的方法，在DCs細(xì)胞培養(yǎng)的第3天，AE37(lyg/ml)加至IjDCs細(xì)胞培養(yǎng)液24小時(shí)，隨后用TNF-α感染DCs過(guò)夜，而后與培養(yǎng)的CTLs細(xì)胞以I:50比例混合，繼續(xù)培養(yǎng)5天。[0036]四、DC_CTLs在體內(nèi)和體外強(qiáng)化對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用為了證明AE37錨定的DCs能夠強(qiáng)化CTLs細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷，我們以對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7為研究對(duì)象。[0037]1.DCs細(xì)胞和CIKs細(xì)胞的培養(yǎng)同前。[0038]2.DCs細(xì)胞培養(yǎng)的第3天加入AE37(lyg/ml)，以HBsAg的R187(aal83-191)(FLLTRILTI)作為對(duì)照，加入多肽的濃度為lyg/ml，24小時(shí)后，用TNF-a刺激DC細(xì)胞成熟，然后與已培養(yǎng)5天的CTLs混合，比例為1:50，繼續(xù)培養(yǎng)5天，然后以不同比例的DC-CTLs細(xì)胞和靶細(xì)胞MCF-7細(xì)胞混合培養(yǎng)，混合比例為30:1;50:1和100:1，24小時(shí)后用試劑盒檢測(cè)乳酸脫氫酶(LDH)的活性。[0039]為了檢測(cè)自發(fā)的LDH活性，設(shè)培養(yǎng)孔中只有靶細(xì)胞沒(méi)有效應(yīng)細(xì)胞作為對(duì)照，檢測(cè)最大釋放的乳酸脫氫酶(LDH)的活性。培養(yǎng)孔中加TritonX-100(1%質(zhì)量百分含量)表示最大釋放活性。乳酸脫氫酶活性的計(jì)算公式為:(LDHtest-LDHspont)/(LDHtotal-LDHspont)]X10CShan,B.E.,J.S.Hao,Q.X..Li,andM.Tagawa.AntitumorActivityandImmuneEnhancementofMurineInterleukin-23ExpressedinMurineColonCarcinomaCellsCellular&MolecularImmunology.2006；3(I),49-57)。公式中LDHtest、LDHspont和LDHtotal分別代表試驗(yàn)孔、自發(fā)釋放孔和最大釋放孔。實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)復(fù)孔，具體結(jié)果如圖6所示，結(jié)果表明DC-CTL對(duì)靶細(xì)胞MCF-7的殺傷活性。從圖可以看出DC-CTL(ant1-PD-Ι)對(duì)MCF-7細(xì)胞的殺傷活性顯著高于其他對(duì)照組，DC-CTL組比單純的CTL對(duì)靶細(xì)胞殺傷也存在顯著性差異(P〈0.05).效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例為50:I。[0040]以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，其架構(gòu)形式能夠靈活多變，可以派生系列方法或產(chǎn)品。只是做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明由所提交的權(quán)利要求書確定的專利保護(hù)范圍。【主權(quán)項(xiàng)】1.一種新的DC-CTLs細(xì)胞培養(yǎng)體系，其特征在于，在CTLs細(xì)胞的培養(yǎng)體系中加入DCs細(xì)胞和ro-Ι單克隆抗體，ro-Ι單克隆抗體為GCP級(jí)別，濃度為0.5-5μg/ml。2.如權(quán)利要求1所述的DC-CTLs細(xì)胞培養(yǎng)體系，其特征在于，PD-1單克隆抗體濃度為1μg/mlο3.如權(quán)利要求1所述的DC-CTLs細(xì)胞培養(yǎng)體系，其特征在于，所述DCs細(xì)胞用IL-^PGM-CSF刺激培養(yǎng)得到。4.如權(quán)利要求1所述的DC-CTLs細(xì)胞培養(yǎng)體系，其特征在于，所述CTLs細(xì)胞用免疫磁珠分選后計(jì)數(shù)后用IL-2誘導(dǎo)得到。5.如權(quán)利要求1所述的DC-CTLs細(xì)胞培養(yǎng)體系，其特征在于，所述CTLs細(xì)胞和所述DCs細(xì)胞共培養(yǎng)的比例為50:1。6.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的DC-CTLs細(xì)胞培養(yǎng)體系用于高表達(dá)HER2+的腫瘤患者的免疫細(xì)胞治療。7.一種新的DC-CTLs細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，DCs細(xì)胞用IL-4和GM-CSF誘導(dǎo)制備，DCs細(xì)胞培養(yǎng)后的第3天用2yg/ml的AE37脈沖24小時(shí)，加入10ng/ml的TNF-al2小時(shí)，讓DCs細(xì)胞成熟后，然后與用IL-2誘導(dǎo)得到的CTLs細(xì)胞、PD-1單克隆抗體一起共培養(yǎng)，DCs和CTLs的比例為1:50?！疚臋n編號(hào)】C12N5/0784GK106047810SQ201610354867【公開(kāi)日】2016年10月26日【申請(qǐng)日】2016年5月26日【發(fā)明人】鄭義,李智龍,肖艷歸,唐文翠【申請(qǐng)人】深圳市金佳禾生物醫(yī)藥有限公司