本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種抗慢性炎癥的間充質(zhì)干細胞的制備方法，一種抗慢性炎癥的間充質(zhì)干細胞注射液及其用于抗慢性炎癥的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：慢性炎癥可以引起多種疾病，例如糖尿病、心血管疾病等，是很多疾病的共同發(fā)病機制。二型糖尿病的發(fā)病機制是肥胖導(dǎo)致的慢性炎癥而致的胰島素抵抗，造成的高血糖、以及持續(xù)的高血糖并進而導(dǎo)致的糖代謝與脂代謝紊亂，從而對胰島β細胞的進行性損傷。肥胖使細胞脹大，體內(nèi)免疫系統(tǒng)將它識別為異常細胞，對其進行修飾，給體內(nèi)造成過多的炎癥，從而導(dǎo)致糖尿病。心血管疾病中，血管內(nèi)皮細胞受到慢性炎癥的刺激，遭受損傷，引起血管壁的硬化。越來越多的研究證實間充質(zhì)干細胞(mscs)通過分泌的細胞因子可發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)與降低炎癥的作用。研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞可以緩解炎癥反應(yīng)，它的這種促進炎癥到增殖階段轉(zhuǎn)變的生物屬性，在嚴重的炎癥抑制治療中是非常重要的。在膿毒癥模型中，mscs可以分泌某些生長因子增加修復(fù)m2巨噬細胞的百分比和增加器官功能。研究顯示對干細胞進行預(yù)處理會增強其修復(fù)效應(yīng)。研究還發(fā)現(xiàn)把mscs暴露給藥理劑脂多糖(lps)可以增加mscs的營養(yǎng)作用和抵抗嚴酷的炎性環(huán)境的能力(yaoy,zhangf,wangl,zhangg,wangz,chenj,gaox.lipopolysaccharidepreconditioningenhancestheefficacyofmesenchymalstemcellstransplantationinaratmodelofacutemyocardialinfarction.jbiomedsci.200916:74；crisostomopr,wangy,markelta,wangm,lahmt,meldrumdr.humanmesenchymalstemcellsstimulatedbytnf-alpha,lps,orhypoxiaproducegrowthfactorsbyannfkappab-butnotjnk-dependentmechanism.amjphysiolcellphysiol.2008294:c675–82.)；已經(jīng)確定lps處理過的mscs比沒有處理過的mscs在糖尿病小鼠模型里對保存皮瓣存活方面有優(yōu)越的治療能力。因此脂多糖預(yù)處理mscs被運用于增強干細胞治療特性。在低氧條件下mscs活性增強，治療潛能也隨之增強，這些特點被用于治療缺血性疾病等(liujj，haohj，tongc，huangh，tidd，dongl，chendy，zhaoyl，liuhl，fuxb，hanwd.hypoxiaregulatesthetherapeuticpotentialofmesenchymalstemcellsthroughenhancedautophagy.intjlowextremwounds，2015；14(1)：63-72)。由于mscs受體內(nèi)環(huán)境的影響，治療效果不確定，因此目前干細胞對慢性炎癥的修復(fù)技術(shù)是仍是亟待解決的問題。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對mscs受體內(nèi)環(huán)境的影響，治療效果不確定，效率不高的問題，本發(fā)明提供了一種抗慢性炎癥的間充質(zhì)干細胞的制備方法，一種抗慢性炎癥的間充質(zhì)干細胞注射液及其用于抗慢性炎癥的應(yīng)用。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實現(xiàn)：一種抗慢性炎癥的間充質(zhì)干細胞的制備方法，其包括的步驟為：a)將間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)至70～80％的融合，抽掉間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用磷酸緩沖液沖洗間充質(zhì)干細胞；b)加入含50～200ng/ml脂多糖(lps)的無血清培養(yǎng)基；然后c)調(diào)節(jié)低氧狀態(tài)至氧含量5～10％，并將所述間充質(zhì)干細胞在低氧狀態(tài)下培養(yǎng)16～18小時。進一步的，所述步驟b)中所述無血清培養(yǎng)基中脂多糖濃度為50ng/ml、100ng/ml或200ng/ml；所述步驟c)中所述氧含量為5％或者10％。所述步驟a)中采用0.01m的磷酸緩沖液沖洗間充質(zhì)干細胞三次；所述步驟c)中無血清培養(yǎng)基為dmem培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)條件為37℃、5％的二氧化碳、飽和濕度培養(yǎng)箱；所述間充質(zhì)干細胞是臍帶間充質(zhì)干細胞。一種抗慢性炎癥的間充質(zhì)干細胞注射液，其包括以下組分：數(shù)量為5×105～2×106個/ml的抗慢性炎癥的間充質(zhì)干細胞，質(zhì)量體積比為1～5％的人血白蛋白、質(zhì)量體積比為1～5％的復(fù)方維生素、質(zhì)量體積比為1～8％的甘露醇、質(zhì)量體積比為0.5～2.5％的葡萄糖和余量的生理鹽水，其中所述抗慢性炎癥的間充質(zhì)干細胞為脂多糖和低氧預(yù)處理的間充質(zhì)干細胞。一種抗慢性炎癥的間充質(zhì)干細胞注射液，所述抗慢性炎癥的間充質(zhì)干細胞為脂多糖和低氧預(yù)處理的間充質(zhì)干細胞，其制備方法為：a)將間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)至70～80％的融合，抽掉間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用磷酸緩沖液沖洗間充質(zhì)干細胞；b)加入含50～200ng/ml脂多糖(lps)的無血清培養(yǎng)基；然后c)調(diào)節(jié)低氧狀態(tài)至氧含量5～10％，并將所述間充質(zhì)干細胞在低氧狀態(tài)下培養(yǎng)16～18小時。進一步的，所述抗慢性炎癥的間充質(zhì)干細胞的制備方法的步驟b)中所述無血清培養(yǎng)基中脂多糖濃度為50ng/ml、100ng/ml或200ng/ml；所述抗慢性炎癥的間充質(zhì)干細胞的制備方法的步驟c)所述氧含量為5％或者10％。所述間充質(zhì)干細胞是臍帶間充質(zhì)干細胞。上述抗慢性炎癥的間充質(zhì)干細胞在制備治療慢性炎癥等疾病中的應(yīng)用。上述抗慢性炎癥的間充質(zhì)干細胞注射液在治療慢性炎癥等疾病中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明采用lps和低氧的微環(huán)境對臍帶間充質(zhì)干細胞進行預(yù)處理，激活干細胞抗炎機制，明顯增強了間充質(zhì)干細胞發(fā)揮抗炎的效應(yīng)，降低炎性反應(yīng)中促炎因子的生成和增加抗炎因子的生成，讓預(yù)處理的mscs在慢性低濃度炎癥里面發(fā)揮更強的治療效應(yīng)。本發(fā)明制備的lps和低氧預(yù)處理的間充質(zhì)干細胞，經(jīng)過簡單的預(yù)處理，干細胞特性未見變化，本制備體系易于質(zhì)量控制，易于產(chǎn)業(yè)化。本發(fā)明采用激活的間充質(zhì)干細胞注射液優(yōu)化治療方案，采用多次輸注治療的策略，顯著降低了炎性反應(yīng)。詳細描述：作為炎癥組織損傷的主要效應(yīng)器，巨噬細胞根據(jù)微環(huán)境信號的不同可以分化成“傳統(tǒng)激活”的m1表型或者“選擇性激活”的m2表型。m1巨噬細胞的促炎反應(yīng)通常依賴樣受體(tlrs)和nfκb的激活，導(dǎo)致病原體吞噬作用，氧化破裂和細胞內(nèi)死亡。相反的，激活m2巨噬細胞導(dǎo)致stat3或者其他轉(zhuǎn)錄因子的聚集，從而抑制炎癥并且促進組織重建。之前的研究顯示在糖尿病小鼠模型中，高糖可以增強m1細胞，減少m2細胞的極化，產(chǎn)生大量的炎性因子和慢性炎癥，并且在糖尿病里特異性表達的炎癥用于m1巨噬細胞的超誘導(dǎo)和誘導(dǎo)的一氧化氮合成酶的異常產(chǎn)生，導(dǎo)致創(chuàng)新組織破壞和重現(xiàn)慢性創(chuàng)口(bannonp,woods,restivot,campbelll,hardmanmj,maceka.diabetesinducesstableintrinsicchangestomyeloidcellsthatcontributetochronicinflammationduringwoundhealinginmice.dismodelmech.2013；6:1434–47)。因此，巨噬細胞極化適當(dāng)?shù)钠胶庠谡{(diào)節(jié)炎癥和隨后加速組織修復(fù)和體內(nèi)平衡中起著至關(guān)重要的作用。本發(fā)明實施例中將巨噬細胞極化的平衡作為mscs治療效果的一個指標。nlrp3是最具良好表征的炎性小體。我們發(fā)現(xiàn)人體間充質(zhì)干細胞負調(diào)控nlrp3炎性小體在人體和暴露過lps的小鼠巨噬細胞的激活。人體mscs對nlrp3在mrna水平上的表達沒有影響，但是會顯著地抑制線粒體活性氧的產(chǎn)生，這對nlrp3炎性小體的激活起到至關(guān)重要的作用。因此本發(fā)明實施例中通過檢測nlrp3炎性小體來檢測lps低氧預(yù)處理的mscs是否產(chǎn)生作用。本發(fā)明以高糖創(chuàng)造慢性低濃度的炎癥環(huán)境。附圖說明：圖1.采用免疫印跡法測定的大鼠巨噬細胞中il-1β和胱冬肽酶-1的表達量。左圖為免疫印跡法測量的mscs共同培養(yǎng)的巨噬細胞培養(yǎng)上清中il-1β的表達量。右圖為免疫印跡法測定的mscs共同培養(yǎng)的巨噬細胞培養(yǎng)上清中胱冬肽酶-1的表達量。圖2：rt-pcr檢測的thp-1細胞與不同msc共同培養(yǎng)24h和48h后上清液中促炎因子(il-1，il-6，tnf-α)和抗炎因子(il-10，tgf-β)的相對表達量。具體實施方式下面以具體實施方式對發(fā)明作進一步詳細說明本發(fā)明參照特定的實施例進行了描述，但是，很顯然仍可以做出各種修改和變換而不違背本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明的說明書和附圖應(yīng)該認為是說明性的而非限制性的。實施例1.臍帶間充質(zhì)干細胞的制備在超凈工作臺中進行操作，取新鮮足月健康胎兒臍帶，用含2倍100u/ml青霉素和鏈霉素的生理鹽水沖洗去除血漬，將華爾通氏膠剝離，剪成1立方毫米以下塊狀，均勻涂布，緩慢加入10ml無血清培養(yǎng)基，置37℃、體積分數(shù)為5％的二氧化碳、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將原代細胞培養(yǎng)7天后，更換無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)至細胞達到70％的融合，移去無血清培養(yǎng)液，添加濃度分別為0.25％和0.1％的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸鈉(edta)消化1min，臍帶msc收縮脫離瓶壁，此時加入先前移去的培養(yǎng)上清液，中和胰蛋白酶-edta溶液，并使用移液管輕輕吹打，將臍帶msc懸液移入50ml離心管。1000rpm離心8min，去除上清液；重新加入無血清完全培養(yǎng)基將msc重懸，并計數(shù)。按照1傳1.5接種10cm培養(yǎng)皿。msc培養(yǎng)融合70％左右時參照上述方法傳代培養(yǎng)。選擇第四代培養(yǎng)的msc，在對數(shù)生長期，且細胞融合程度不超過80％時按照傳代的要求消化、中和、洗滌、收集細胞，采用細胞凍存液(90％胎牛血清和10％二甲亞砜(dmso))重懸msc，充分混勻，每管1ml分裝于凍存管密封。將凍存管置于裝有異丙醇的凍存盒中，于-80℃冰箱過夜，次日移入液氮罐保存。msc復(fù)蘇的步驟為：取出msc凍存管，立即浸入37℃溫水中溶解；取適量無血清培養(yǎng)基混懸細胞并離心，棄去上清液；細胞重懸于無血清培養(yǎng)基中，并接種于培養(yǎng)皿中，于37℃、體積分數(shù)為5％的二氧化碳、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實施例2.lps低氧預(yù)處理臍帶間充質(zhì)干細胞抗慢性炎癥的間充質(zhì)干細胞為lps低氧預(yù)處理的間充質(zhì)干細胞，所述抗慢性炎癥的間充質(zhì)干細胞的制備方法包括的步驟為：a)將間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)至70～80％的融合，抽掉間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用磷酸緩沖液沖洗間充質(zhì)干細胞；b)加入含50～200ng/ml脂多糖(lps)的無血清培養(yǎng)基；然后c)調(diào)節(jié)低氧狀態(tài)至氧含量5～10％，并將所述間充質(zhì)干細胞在低氧狀態(tài)下培養(yǎng)16-18小時，測量培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞數(shù)量，如果間充質(zhì)干細胞的數(shù)量能夠達到5×105～2×106個/ml，表明為有效的lps和低氧預(yù)處理的間充質(zhì)干細胞。(1)每15cm的細胞培養(yǎng)皿接種1.5×106個臍帶mscs，培養(yǎng)約24小時達到70～80％的融合；抽掉mscs培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，然后使用0.01m的磷酸緩沖液(pbs)沖洗臍帶mscs三次；用含50ng/mllps的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)；然后調(diào)節(jié)低氧狀態(tài)至氧含量5％，并將所述間充質(zhì)干細胞在低氧狀態(tài)下培養(yǎng)16小時，培養(yǎng)條件為37℃、5％的二氧化碳、飽和濕度培養(yǎng)箱，間充質(zhì)干細胞的數(shù)量為7×105個/ml，表明終濃度50ng/mllps和氧含量5％的低氧預(yù)處理，能夠獲得有效的lps和低氧預(yù)處理的間充質(zhì)干細胞，即抗慢性炎癥的間充質(zhì)干細胞。(2)每15cm的細胞培養(yǎng)皿接種1.5×106個臍帶mscs，培養(yǎng)約24小時達到70～80％的融合；抽掉mscs培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，然后使用0.01m的磷酸緩沖液(pbs)沖洗臍帶mscs三次；加入含100ng/mllps的dmem培養(yǎng)基；然后調(diào)節(jié)低氧狀態(tài)至氧含量10％，并將所述間充質(zhì)干細胞在低氧狀態(tài)下培養(yǎng)17小時，培養(yǎng)條件為37℃、5％的二氧化碳、飽和濕度培養(yǎng)箱，間充質(zhì)干細胞的數(shù)量為8×105個/ml，表明終濃度100ng/mllps和氧含量10％的低氧預(yù)處理，能夠獲得有效的lps和低氧預(yù)處理的間充質(zhì)干細胞，即抗慢性炎癥的間充質(zhì)干細胞。(3)每15cm的細胞培養(yǎng)皿接種1.5×106個臍帶mscs，培養(yǎng)約24小時達到70～80％的融合；抽掉mscs培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，然后使用0.01m的磷酸緩沖液(pbs)沖洗臍帶mscs三次；用含200ng/mllps的dmem無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；然后調(diào)節(jié)低氧狀態(tài)至氧含量10％，并將所述間充質(zhì)干細胞在低氧狀態(tài)下培養(yǎng)18小時，培養(yǎng)條件為37℃、5％的二氧化碳、飽和濕度培養(yǎng)箱，間充質(zhì)干細胞的濃度為1×106個/ml，表明終濃度200ng/mllps和氧含量10％的低氧共同處理，能夠獲得有效的lps和低氧共同處理的間充質(zhì)干細胞，即抗慢性炎癥的間充質(zhì)干細胞。實施例3.抗慢性炎癥的間充質(zhì)干細胞注射液的制備一種抗慢性炎癥的間充質(zhì)干細胞注射液，其包括以下組分：數(shù)量為5×105～2×106個/ml的lps低氧預(yù)處理的間充質(zhì)干細胞，質(zhì)量體積比為1～5％人血白蛋白，質(zhì)量體積比為1～8％甘露醇注射液，質(zhì)量體積比為1～5％復(fù)方維生素注射液，質(zhì)量體積比為1～5％的50％葡萄糖注射液和余量為生理鹽水，其中所述抗慢性炎癥的間充質(zhì)干細胞為脂多糖和低氧預(yù)處理的間充質(zhì)干細胞。如配制100ml抗慢性炎癥的間充干細胞注射液，該注射液包括人血白蛋白原液5ml(質(zhì)量體積比終濃度為1％)、甘露醇注射液2ml、復(fù)方維生素注射液3ml、50％葡萄糖注射液5ml、生理鹽水85ml、lps低氧預(yù)處理的msc。除lps低氧預(yù)處理的msc外，注射液其余成分需提前配制，并4℃預(yù)冷備用。msc最終重懸注射液中，制成單細胞懸液，每毫升注射液中l(wèi)ps低氧預(yù)處理的msc的數(shù)量為5×105～2×106個。該制備好的lps低氧預(yù)處理的msc在2～10℃條件中，2小時內(nèi)細胞保持為單細胞懸液狀態(tài)，且細胞活力(臺盼藍染色計活力)保持在95％以上。本發(fā)明所述質(zhì)量體積比均代表質(zhì)量(g)與體積(ml)的比例。實施例4.lps低氧預(yù)處理的mscs抑制巨噬細胞中nlrp3炎性小體的激活一、nlrp3炎性小體的激活將大鼠巨噬細胞(raw264.7細胞)在添加10％的熱滅活牛血清(fbs)和1％的青-鏈霉素高糖細胞培養(yǎng)基(dmem)中在37℃，5％二氧化碳條件下培養(yǎng)；然后將巨噬細胞以5000個/cm2的濃度接種在六孔盤上，2小時以后，用2μg/ml的lps在包含2％熱滅活fbs的高糖(約4.5g/l)細胞培養(yǎng)基(dmem)里處理細胞5個小時，以此來創(chuàng)造炎性的環(huán)境，激活nlrp3炎性小體，誘導(dǎo)nlrp3的表達；用0.01mpbs沖洗巨噬細胞三遍并且在5mmatp里孵化30min來激活nlrp3炎性小體；再次在用0.01m的pbs沖洗之后，將細胞用2％熱滅活的fbs和1％青霉素-鏈霉素雙抗(ps)在37℃、5％二氧化碳環(huán)境下在dmem培養(yǎng)液里培養(yǎng)約48h直到進一步分析。二、lps低氧預(yù)處理的mscs和巨噬細胞聯(lián)合培養(yǎng)將lps低氧預(yù)處理的mscs以10,000個/cm2的濃度接種在六孔盤上并用完全培養(yǎng)液(ccm)培養(yǎng)24小時；用0.01m的pbs沖洗lps低氧預(yù)處理的mscs三遍，然后與巨噬細胞在巨噬細胞培養(yǎng)基中一起聯(lián)合培養(yǎng)約16h。三、結(jié)果：lps低氧預(yù)處理的mscs抑制巨噬細胞里nlrp3炎性小體介導(dǎo)的胱冬肽酶-1(caspase-1)的激活和il-1β的分泌。采用免疫印跡法測定胱冬肽酶-1的表達量，如圖1右圖所示，lps低氧預(yù)處理的mscs共同培養(yǎng)的巨噬細胞培養(yǎng)上清液中胱冬肽酶-1(caspase-1)的激活被明顯抑制了。通過elisa測量發(fā)現(xiàn)在上清液中的il-1β的水平也明顯降低(圖1左圖)。為了排除il-1β可能從lps低氧預(yù)處理mscs分泌的可能，采用lps和atp刺激了lps低氧預(yù)處理mscs，但在上清中沒有檢測到il-1β。這表明nlrp3炎性小體在lps低氧預(yù)處理mscs沒有被激活。所有這些數(shù)據(jù)表明lps低氧預(yù)處理mscs抑制巨噬細胞里nlrp3炎性小體的激活。實施例5.lps低氧預(yù)處理的mscs促進thp-1細胞向m2巨噬細胞表型的轉(zhuǎn)變一、thp-1細胞的培養(yǎng)和處理從美國標準菌庫購買人體單核細胞系thp-1。在添加10％的fbs的rpmi1640培養(yǎng)基里培養(yǎng)thp-1細胞。細胞在3×105–6×105cells/ml的密度下生長。之后，thp-1細胞在六孔板上和兩種不同濃度(5和30mm)的葡萄糖一起培養(yǎng),并且通過佛波醇(phorbol)12-豆蔻酸(12-myristate)13-醋酸鹽(13-acetate)處理來分化誘導(dǎo)。三天后，用0.01m的pbs沖洗掉未粘連細胞三次。粘連細胞與lps低氧預(yù)處理的mscs(干細胞數(shù)量為5×105～2×106個/ml)進一步培養(yǎng)48小時。為了用熒光顯微檢查術(shù)追蹤lps低氧預(yù)處理的mscs，細胞被dil染色標記、在0.01m的pbs里4℃以100,000×g的速度離心一個小時。之后，dil標記的lps低氧預(yù)處理的mscs和thp-1細胞一起共同培養(yǎng)。6小時后，用hoechst33342給細胞染色8分鐘并且用0.01m的pbs沖洗。二、結(jié)果：lps低氧預(yù)處理的mscs可以促進thp-1細胞向m2巨噬細胞表型的轉(zhuǎn)變高糖誘導(dǎo)巨噬細胞成為促炎型的狀態(tài)，我們檢測了lps低氧預(yù)處理的mscs對thp-1細胞的在高糖環(huán)境下的影響。如圖2所示，rt-pcr結(jié)果顯示在用lps低氧預(yù)處理mscs處理之后，thp-1細胞明顯的產(chǎn)生了更多的抗炎細胞因子(il-10,tgf-β)和m2巨噬細胞表面標記物cd163，并且減少了包括il-1、il-6和tnfα在內(nèi)的促炎細胞因子的產(chǎn)生。不僅如此，熒光染色顯示m2巨噬細胞的密度和分布明顯增多，在lps低氧預(yù)處理mscs組，m1巨噬細胞顯著減少。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明lps低氧預(yù)處理的mscs是巨噬細胞極化的平衡調(diào)節(jié)器并且促進巨噬細胞向m2而不是m1分化。當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12