本發(fā)明涉及生物
技術領域：
，具體涉及一種高效分離培養(yǎng)臍帶間充質干細胞的方法。
背景技術：
：人臍帶間充質干細胞(msc)是一群具有高度自我更新能力和分化潛能的成體干細胞，在適當?shù)恼T導條件下能向成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞和神經(jīng)細胞等多種組織細胞分化，加之其具有免疫調控、分泌細胞因子、取材方便等優(yōu)點，msc的分離、培養(yǎng)、分化、誘導植入等研究備受關注，在細胞治療、組織工程等領域顯示出日益廣闊的應用前景。自1995年首次報道m(xù)sc應用于臨床試驗，目前培養(yǎng)的msc已被廣泛地用于臨床試驗研究，如脊髓損傷、軟骨和骨損傷、充血性心衰、急性心梗、ⅱ型糖尿病等，而且在腎臟、肌肉和肺等組織損傷修復研究也有初步進展。研究表明msc能夠植入肌肉退化組織并向肌細胞分化，也能夠促進造血干細胞的植入，msc還可應用于軟骨組織重建等生物工程；也可能成為未來抗癌治療中攜帶自殺基因或抗癌腺病毒藥物的載體細胞。然而，要達到臨床應用的細胞數(shù)量級及應用效果，就對原始干細胞的數(shù)量、活力及分化能力要求很高，目前分離和培養(yǎng)人臍帶msc的方法大致有膠原酶ii消化法、組織塊貼壁法、臍靜脈內膜消化法，在培養(yǎng)應用或后期細胞性能檢測中，上述各方法操作步驟、分離效果及弊端凸顯。上述方法所初始分離的msc數(shù)量有限，致使達到細胞融合80-90％多需6-15天，而要達到臨床應用的細胞數(shù)量級則必須還要經(jīng)體外培養(yǎng)多次傳代，這些過程中，原代細胞生長時間過長、且傳代次數(shù)過多，最終細胞極易發(fā)生老化，活力大減，難以保證臨床應用時的效果。另一方面，培養(yǎng)擴增中細胞密度、培養(yǎng)環(huán)境的優(yōu)化關系msc培養(yǎng)效率和安全。目前，一般采用含10-20％胎牛血清(fbs)的dmem或α-mem培養(yǎng)基，但在培養(yǎng)過程中，血清含量高，一方面使得細胞易于分化為脂肪細胞從而改變干細胞特效，另一方面，較多的血清蛋白因細胞內化而殘留在胞漿中，有引發(fā)患者過敏的風險。近些研究有采用無血清條件下培養(yǎng)擴增，但這種培養(yǎng)方式需在培養(yǎng)基加大量的生長因子以維持細胞的生長繁殖，且這樣造成細胞不易貼壁，造成傳代培養(yǎng)中細胞損失嚴重，大量擴增困難較大。上述種種原因，給目前的新生兒臍帶血存儲用戶帶來了風險和應用缺失，還使其收到了較大的經(jīng)濟損失，更導致目前諸多用戶對該技術存在技術疑慮，臍帶血存儲難以推廣。綜上可見，獲得大量的活力充足、分化潛能高的干細胞進行凍存，才能保證廣大臍帶血存儲者應用時起到良好療效，為人類生命健康保駕護航，因此，臍帶干細胞分離培養(yǎng)及擴增技術是本領域一直亟需改進的技術難題。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種高效分離培養(yǎng)臍帶間充質干細胞的方法，用以解決現(xiàn)有臍帶間充質干細胞原代分離細胞數(shù)量少、增殖慢、擴增易老化的技術問題。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明方法通過調整消化酶的組成及消化時間、進一步借助細胞與組織上未脫落細胞之間的相互作用，最大程度的保護細胞、提高細胞貼壁效率和增殖效率，從而保證了細胞的活力、增殖、分化潛能，高效獲得大量間充質干細胞。具體地，本發(fā)明高效分離培養(yǎng)臍帶間充質干細胞的方法，包括以下步驟：(1)將離體臍帶以生理鹽水沖洗至無血塊，浸沒至pbs或生理鹽水中剪至0.25-0.35cm3碎塊，2500-3000rpm離心1min得臍帶組織塊沉淀，棄上清；(2)向臍帶組織塊沉淀加入等體積的ⅱ型膠原酶，吹打均勻，密封置于37℃搖床20-40min，吹打均勻后靜置，移液槍收集含msc的ⅱ型膠原酶液轉移至mem培養(yǎng)液中，2500-3000rpm離心3min，棄上清，以完全培養(yǎng)基重懸細胞，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱，剩余臍帶組織塊轉入步驟(3)；(3)向剩余臍帶組織塊加入等體積的混合酶溶液進行二次消化20-40min，至臍帶組織塊剩余30-40％體積，一并轉移至步驟(2)中的完全培養(yǎng)基中，吹打均勻，以0.5～1×106cells/cm2的密度種于t75培養(yǎng)瓶，37℃、5％co2培養(yǎng)箱36-48h，其中混合酶溶液由0.05-0.1％ⅱ型膠原酶溶液和0.05-0.1％ⅰ型膠原酶溶液以體積比6-8：2-4均勻混合組成；(4)吸除舊培養(yǎng)基，更換為含有10％fbs、1％雙抗、3萬u單位慶大霉素的改良培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48-72h；(5)輕輕晃動培養(yǎng)瓶去除組織及漂浮細胞，pbs或生理鹽水再次沖洗后，加入胰蛋白酶37℃消化至70～80％細胞脫落，加入改良培養(yǎng)基終止消化，吸管吹打培養(yǎng)瓶底部，轉移至離心管，2500-3000rpm離心3-5min，棄上清，重懸計數(shù)，按照3000～5000cells/cm2的密度種于培養(yǎng)瓶傳代；(6)每3天換液一次，培養(yǎng)3-5天待細胞長至70～80％融合度，重復步驟(5)，傳代擴增到第5或第6代，即可得足量間充質細胞用于實驗或凍存。優(yōu)選的，所述步驟(3)中，二次消化20-40min后，首先以移液槍收集含msc的混合酶溶液并以100目篩過濾后，再與所剩余的30-40％體積臍帶組織塊一并轉移至步驟(2)中的完全培養(yǎng)基中。更優(yōu)選的，所述步驟(3)中培養(yǎng)36-48h過程中，在培養(yǎng)瓶周邊施加100-150gs的靜磁場作用10-15h。更優(yōu)選的，混合酶溶液由0.05-0.1％ⅱ型膠原酶溶液和0.05-0.1％ⅰ型膠原酶溶液以體積比6-8：2-4均勻混合組成；更優(yōu)選的，所述改良培養(yǎng)基由mem基礎培養(yǎng)基添加10％fbs、1％雙抗、3萬u單位慶大霉素和抗壞血酸、膽固醇、木糖醇組成。優(yōu)選的，所述抗壞血酸、膽固醇、木糖醇的濃度分別為10-20μg/ml、15-40μg/ml、60-100μg/ml。更優(yōu)選的，所述抗壞血酸、膽固醇、木糖醇的含量比例為1：1.5-2：4-5。本發(fā)明方法具有如下優(yōu)點：(1)本發(fā)明分離msc時才有兩步消化法并控制消化時間段，對細胞損傷小，更大程度的保護間充質干細胞的活性和分化潛能，有利于其高成活率，二步消化時采用特定比例的兩種酶，無需離心，有效提高了細胞貼壁成活率；(2)進一步改進的技術方案中，二步消化細胞過篩破損少量細胞，在提高單細胞數(shù)量的同時，獲得了有利于細胞信號傳導的胞漿，大大提高了殘余組織上細胞的爬出，提高了細胞的原代分離量和貼壁效率；加入靜磁場，改善細胞周期，有利于細胞的生長和增殖能力，利于高效快速獲得大量干細胞；(3)改良培養(yǎng)基中加入并控制三種添加成分的含量及比例，對提高臍帶間充質干細胞的貼壁生長、活力保持、增殖能力具有協(xié)同促進功效，有利于高效獲得大量成活率高、活力好、分化能力好的間充質干細胞。附圖說明圖1是實施例3成骨細胞分化測試中a1組的代表性示例照片；圖2是實施例3成骨細胞分化測試中b2組的代表性示例照片；圖3是實施例4成脂肪細胞分化測試中a2組的代表性示例照片；圖4是實施例4成脂肪細胞分化測試中b2組的代表性示例照片；圖5是實施例4成脂肪細胞分化測試中c2組的代表性示例照片；圖6是實施例4成脂肪細胞分化測試中d2組的代表性示例照片。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1本實施例具體說明本發(fā)明所提供的高效分離培養(yǎng)臍帶間充質干細胞的方法，同時設置平行實驗與目前常規(guī)分離比較所獲得干細胞的數(shù)量，下述方法及試劑，如無特殊說明，均為常規(guī)操作和配制方法。(一)實驗前，對實驗環(huán)境進行如下無菌處理：1、用84消毒液按說明書配制水溶液擦拭細胞房(包括緩沖間、儲存間)各暴露面及地面，用0.5％過氧乙酸重復擦拭一遍；用75％酒精浸透紗布，擦拭操作臺、培養(yǎng)箱內外壁、及移液槍，水浴箱洗干凈用75％酒精擦拭過后，換上已滅菌的去離子水；2、紫外照射或臭氧熏30min。(二)試劑的配制及器械預處理1、剪刀、鑷子、取臍帶用的瓶子滅菌：高壓蒸汽滅菌箱滅菌20～30min，烘箱中烘干；2、ⅱ型膠原酶溶液(濃度0.05-0.1％為質量體積濃度，0.05％即0.05g/100ml)、ⅰ型膠原酶溶液、胰蛋白酶溶液用前先用0.45μm濾膜抽濾。(三)分離培養(yǎng)臍帶間充質干細胞1、將新鮮采集的離體臍帶以pbs或生理鹽水沖洗至無血塊，置于裝有生理鹽水的10cm培養(yǎng)皿中，剪刀剪碎至0.25-0.35cm3碎塊，將碎塊移至50ml離心管，加生理鹽水懸勻，均勻分為4份，分別裝入離心管，并標號為a、b、c和d，4個離心管同時裝入離心機，以2600rpm離心1min，分別得a、b、c和d組臍帶組織塊沉淀，棄上清，；2、臍帶組織塊沉淀的處理2.1a、b、c組臍帶組織塊沉淀的消化處理向a、b和c組臍帶組織塊沉淀中分別加入與臍帶組織等體積的ⅱ型膠原酶溶液，混勻，以封口膜將蓋子處密封好，置于37℃搖床，a組臍帶組織塊一直以ⅱ型膠原酶溶液消化，等待b、c組二次消化后同一之間轉入培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)；b、c組搖30min后，分別以吸管吹打均勻，然后靜置5min，或低速離心1min，再以移液槍收集含有msc的ⅱ型膠原酶液，并轉移至mem培養(yǎng)液中，2600rpm離心3min，去除上清后，以完全培養(yǎng)基分別重懸細胞，并裝入t25細胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，此時，b、c組離心管中還有剩余臍帶組織塊；2.2d組臍帶組織塊沉淀以組織塊貼壁法分離mscd組臍帶組織塊放置于培養(yǎng)瓶中，向培養(yǎng)瓶內加入完全培養(yǎng)基，放置在37℃、5％co2的細胞培養(yǎng)箱中，先倒置4h，再正置培養(yǎng)44h，更換培養(yǎng)基時去除組織塊；3、b、c組剩余臍帶組織塊的二次消化向b、c組離心管中分別加入與臍帶組織塊體積相當?shù)幕旌厦溉芤?、ⅱ型膠原酶溶液，其中混合酶溶液由ⅱ型膠原酶溶液和ⅰ型膠原酶溶液以體積比7:3均勻混合組成，進行二次消化，至臍帶組織塊最終量僅為剩余臍帶組織塊體積的30-40％時，停止二次消化，將含msc的消化液加臍帶組織塊最終量一并轉移至2.1中的對應組的完全培養(yǎng)基中，吸管吹打均勻，37℃、5％co2培養(yǎng)箱48h；4、原代分離msc初次換液分離48h后，吸除舊培養(yǎng)基，更換為含有10％fbs、1％雙抗、3萬u單位慶大霉素的改良培養(yǎng)基，鏡檢發(fā)現(xiàn)b組中殘留的臍帶組織塊周邊有大量細胞爬出，并繼續(xù)培養(yǎng)48h；5、將上述a、b、c和d組培養(yǎng)瓶的msc吸除舊培養(yǎng)基，以pbs輕輕晃動洗滌，去懸浮細胞，顯微鏡下觀察各組的細胞密度，發(fā)現(xiàn)a、c和d組細胞總體數(shù)量較b組偏少，原因分析為a組膠原酶消化時間偏長，細胞損傷較大，導致貼壁少，換液損失等；d組組織塊爬出細胞效率較低，在同樣的時間上細胞爬出較少導致所得細胞少；b組細胞呈形態(tài)均一的長梭形、貼壁效果好，與二次消化時含有ⅰ型膠原酶密切相關，適量量的ⅰ型膠原酶有利于細胞黏附，同時不影響ⅱ型膠原酶對細胞的消化能力，提高了分離細胞在短時間貼壁的細胞數(shù)量，保證了細胞密度和成活率，有利于細胞增殖，形狀及細胞綜合分析優(yōu)于c組；進一步以等體積的0.1％胰蛋白酶-edta(質量體積比，0.1g/100ml)消化液37℃消化至70～80％細胞脫落，加入等體積改良培養(yǎng)基終止消化，并計數(shù)，結果顯示a、b、c和d組細胞密度分別為7×104個/ml、8×105個/ml、2×105個/ml和3×104個/ml。實施例2本實施例具體說明本發(fā)明所分離培養(yǎng)的msc的細胞增殖能力。以實施例1中所得細胞，借助離心、重懸步驟調整細胞密度，并至5000cells/孔的密度種于48孔細胞培養(yǎng)板，a、b、c和d組，各組接種10孔，其中5孔以含10％fbs、1％雙抗的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)(標記為a完全、b完全、c完全和d完全)，另5孔以改良培養(yǎng)基培養(yǎng)(標記為a改良、b改良、c改良和d改良)，所述改良培養(yǎng)基由mem基礎培養(yǎng)基添加10％fbs、1％雙抗、3萬u單位慶大霉素和抗壞血酸、膽固醇、木糖醇組成，所述抗壞血酸、膽固醇、木糖醇的濃度分別為15μg/ml、30μg/ml、70μg/ml。以后每2天換液一次，在接種72h時后以mtt法測定細胞增殖比例，測定并計算平均吸光度，結果如下：a改良/a完全＝1.18，b改良/b完全＝1.27，c改良/c完全＝1.21，d改良/d完全＝1.20，b改良/a改良＝1.36，b改良/c改良＝1.13，b改良/d改良＝1.23，可見，本方法分離和培養(yǎng)的msc配合本培養(yǎng)方法中所用的培養(yǎng)基，更利于細胞活力的保持和增強，細胞增殖能力更好。上述培養(yǎng)方法中，改良培養(yǎng)基中添加有抗壞血酸、膽固醇、木糖醇，其中，抗壞血酸參與細胞的諸多氧化還原反應，促氧化反應，提高細胞磷酸酶活性，還有利于細胞生長增殖過程中骨架建立，對細胞的活力、增殖具有有利作用；膽固醇有利于增強msc細胞在生長和增殖過程中細胞膜功能和結構；木糖醇可直接透過細胞膜，為細胞生長、增殖等生理過程提供能量，三者協(xié)同大大促進了細胞的生長和增殖，并保證了細胞的活力和結構，保持了干細胞功能，進一步通過多種濃度的探索，結論是需精確控制抗壞血酸、膽固醇、木糖醇的濃度及比例，本實施例中控制抗壞血酸、膽固醇、木糖醇的濃度分別為15μg/ml、30μg/ml和70μg/ml，其培養(yǎng)的細胞形狀形態(tài)好，增殖能力強，活力旺盛。實施例3本實施例具體說明本發(fā)明所分離培養(yǎng)的msc向成骨細胞分化的能力。以實施例1中各組所得細胞，分別以普通的完全培養(yǎng)基(后綴標1)和本申請中的改良培養(yǎng)基(后綴標2)培養(yǎng)傳代，以p3代細胞考察各組msc向成骨細胞分化的能力。借助離心、重懸步驟調整細胞密度，以10000個/孔接種于48孔細胞培養(yǎng)板(美國康寧公司生產(chǎn))，48孔板的分布如下：8列分別為a1、a2、b1、b2、c1、c2、d1、d2，6行分布為第1、2行為空白對照組(完全培養(yǎng)基或改良培養(yǎng)基500μl)，第3-6行為添加成骨誘導劑的培養(yǎng)基(添加50μl成骨誘導劑加450μl完全培養(yǎng)基或改良培養(yǎng)基，成骨誘導劑為含10-8mol/l地塞米松，10.0mmol/lβ-甘油磷酸鈉，50μg/ml抗壞血酸的對應培養(yǎng)基)誘導18天，期間每3天換液，在顯微鏡下觀察，并以茜素紅染色測定礦化結節(jié)，示例性鏡檢照片參見圖1和圖2，可見b2組相比于a1組中礦化結節(jié)更多、密集、大，定量計算礦化結節(jié)率，od誘導/od空白×100％，結果如下表所示：表1各組msc向成骨細胞分化的礦化結節(jié)率(平均值)a1a2b1b2c1c2d1d2礦化結節(jié)率(％)114120122128119124120122上述結果看見，總體比較以b2組細胞成骨分化性能最強，即以本發(fā)明的方法佩儀添加成骨誘導劑的改良培養(yǎng)基誘導成骨分化時，能最大程度的分化；比較各組中后綴標1的a1、b1、c1和d1，即以添加成骨誘導劑的普通完全培養(yǎng)基培養(yǎng)時，仍是本發(fā)明分離的msc其成骨分化性能以微弱優(yōu)勢領域于其他方法分離的msc；比較a2、b2、c2和d2可見在本發(fā)明分離方法有優(yōu)勢的基礎上，配合本發(fā)明的改良培養(yǎng)基，更是保證了細胞的活力和分化能力，本發(fā)明的分離方法中通過分次消化、縮短消化時間、改良二次消化消化液組分并借助分離的單細胞于組織相互作用進一步增加分離細胞量，在大大保證了細胞分離及貼壁能力的同時，對細胞特性的保持程度最好。實施例4本實施例具體說明本發(fā)明所分離培養(yǎng)的msc向脂肪細胞分化的能力。以實施例1中各組所得細胞，分別以普通的完全培養(yǎng)基(后綴標1)和本申請中的改良培養(yǎng)基(后綴標2)培養(yǎng)傳代，以p3代細胞考察各組msc向脂肪細胞分化的能力。借助離心、重懸步驟調整細胞密度，以10000個/孔接種于48孔細胞培養(yǎng)板(美國康寧公司生產(chǎn))，48孔板的分布如下：8列分別為a1、a2、b1、b2、c1、c2、d1、d2，6行分布為第1、2行為空白對照組(完全培養(yǎng)基或改良培養(yǎng)基500μl)，第3-6行為添加成脂誘導劑的培養(yǎng)基(添加50μl成脂誘導劑加450μl完全培養(yǎng)基或改良培養(yǎng)基，成脂誘導劑為含0.1μmol地塞米松和10μg/ml胰島素的對應培養(yǎng)基)誘導14天，期間每3天換液一次，14天后，脂肪細胞有不同程度的分化出，在顯微鏡下觀察，并以油紅o染色測定并定量計算成脂肪分化率，od誘導/od空白×100％，結果如下表所示：表1各組msc向脂肪細胞分化的礦化結節(jié)率(平均值)a1a2b1b2c1c2d1d2脂肪分化率(％)118123130136124128122128綜上可以看出，以本發(fā)明提供的方法相比于其他分離方法分離培養(yǎng)的msc，首先，分離數(shù)量最多，貼壁效果最好，保證了原代初始細胞量；第二，所分離的細胞活力好、增殖能力強，不易老化，配合本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基有效保持了干細胞的分化特性，更有望成為理想的人臍帶間充質干細胞分離、擴增培養(yǎng)的方法。實施例5為進一步提高原代分離后貼壁效果，從而最大限度的保留原代細胞，本實施例在實施例1的基礎上進一步改進如下：參照對b組的處理，所述步驟3中，二次消化至臍帶組織塊最終量僅為剩余臍帶組織塊體積的30-40％時，停止二次消化，首先以移液槍收集含msc的混合酶溶液并以100目篩過濾后，再與所剩余的30-40％體積的臍帶組織塊一并轉移至步驟2.1中的對應組的完全培養(yǎng)基中，吸管吹打均勻，37℃、5％co2培養(yǎng)箱48h，48h后鏡檢，本實施例的細胞培養(yǎng)瓶中與實施例1中b組培養(yǎng)瓶比較，貼壁msc數(shù)量有10％-15％的提高，其原理是利用篩網(wǎng)過濾時對二次消化所得細胞中微少量細胞的破壞，在細胞培養(yǎng)基中包括了胞漿內各種因子等，促進了組織上殘留細胞的爬出和貼壁，從而大大提高了最終原代細胞的獲得數(shù)量。實施例6為進一步提高原代分離后貼壁效果及改善細胞周期，從而最大限度的保留原代細胞并改善細胞的，本實施例在實施例1的基礎上進一步改進如下：參照對b組的處理，所述步驟3中培養(yǎng)48h的過程中，在培養(yǎng)瓶周邊施加100gs的靜磁場作用10-15h，增加該強度的靜磁場利于培養(yǎng)基中離子及細胞的分布，還有利于培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質及因子的相互作用和信號傳導，48h后鏡檢發(fā)現(xiàn)，本實施例的細胞培養(yǎng)瓶中與實施例1中b組培養(yǎng)瓶比較，貼壁msc數(shù)量有10％-15％的提高，進一步的，采用流式細胞儀檢測細胞周期發(fā)現(xiàn)，本實施例中的msc與實施例1中b組的比較，處于s期和g0期的細胞數(shù)量增加10％-15％，可以預期，這些處于s期和g0期的細胞會迅速生長，在經(jīng)過傳代后，其增殖速率更快，可見，采用靜磁場處理后有效改善細胞的周期，對細胞的生長增殖及分戶潛能的激發(fā)更有利，同時凍存儲運復蘇后其細胞成活率更高。綜上，本發(fā)明通過綜合優(yōu)化消化時間、消化液配比，尤其是進一步改進的技術方案中，采用部分過篩和/或加靜磁場的措施，大大提高了原代msc的分離數(shù)量，更提高了貼壁數(shù)量，保證了成活率，另一方面，配合本發(fā)明的改良培養(yǎng)基并選擇出最優(yōu)接種密度，保證了細胞的活力和密度依賴性的增殖，使細胞快速生長，高效達到臨床應用級，對臍帶干細胞的分離培養(yǎng)和儲存具有重要意義。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施例對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。當前第1頁12