本發(fā)明涉及干細(xì)胞
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療角膜損傷的干細(xì)胞制劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：眼表損傷是全世界范圍內(nèi)致盲的主要原因之一，其中，最常見的原因是眼化學(xué)性燒傷(如堿、酸燒傷)和熱燒傷，這類損傷對眼表的損傷重，治療困難，預(yù)后較差，常導(dǎo)致傷眼失明，甚至喪失眼球。角膜堿燒傷在化學(xué)性燒傷中最嚴(yán)重，堿性物質(zhì)既能溶于脂肪又能溶于水，能迅速與細(xì)胞中的脂類物質(zhì)發(fā)生皂化反應(yīng)，其形成的化合物既能很快穿透親水的角膜基質(zhì)，又能迅速穿透親脂的結(jié)膜、角膜上皮和內(nèi)皮，會導(dǎo)致角膜組織液化壞死，造成角膜緣干細(xì)胞的嚴(yán)重破壞。角膜緣干細(xì)胞的嚴(yán)重缺失會導(dǎo)致持續(xù)的炎癥反應(yīng)，角膜結(jié)膜上皮化生，新生血管的長入及角膜基質(zhì)的瘢痕化。后續(xù)引起的免疫炎癥反應(yīng)比較容易向深層發(fā)展，并造成角膜潰瘍和穿孔、繼發(fā)性青光眼及并發(fā)性白內(nèi)障，嚴(yán)重破壞眼的解剖結(jié)構(gòu)和視功能。對于角膜堿燒傷的病理機(jī)制，近年研究己經(jīng)取得了一定的進(jìn)展。角膜堿燒傷是一個復(fù)雜的病理過程，涉及到多種細(xì)胞及分子的參與，除了堿性物質(zhì)直接損傷作用外，免疫系統(tǒng)的參與也起著至關(guān)重要的作用。在錯綜復(fù)雜的免疫炎癥網(wǎng)絡(luò)中，免疫炎性細(xì)胞(包括淋巴細(xì)胞、多形核白細(xì)胞、朗格罕斯細(xì)胞等)和免疫分子(如細(xì)胞因子、趨化因子、黏附因子等)相互影響及作用，介導(dǎo)角膜堿燒傷的病理變化。目前，對于嚴(yán)重的堿燒傷尚無有效的治療手段，角膜移植是仍然是主要治療手段，但是，角膜移植存在取材困難、遠(yuǎn)期植片存活率低、移植術(shù)后排斥反應(yīng)等諸多困難，限制了其應(yīng)用和療效。除了角膜移植手術(shù)外，其他的手術(shù)治療方法還包括：①自體角膜緣干細(xì)胞移植：自體角膜緣干細(xì)胞移植不存在免疫排斥反應(yīng)，移植片成活率很高，解決了供體來源不足的缺點，而相對于健眼，干細(xì)胞的部分缺失不會對正常的眼表功能造成影響，因此自體角膜緣干細(xì)胞移植術(shù)已經(jīng)成為一種臨床上日益成熟和比較可靠的治療方法之一，而且在角膜緣干細(xì)胞移植手術(shù)中成功率最高，對一部分患者有較好的效果。然而，由于嚴(yán)重角膜堿燒傷患者，自體角膜移植常需要較大的移植塊，且取自健側(cè)眼，從健眼取多少角膜緣組織才能保證既不影響健眼的眼表穩(wěn)定，又有效地治療患眼，仍然是一個沒有解決的問題。此外，對于雙眼均發(fā)生大面積眼表損害的傷者，就沒有可供移植的自體角膜緣干細(xì)胞；②異體角膜緣干細(xì)胞移植：雖然能提供足夠的角膜緣干細(xì)胞移植片，但來源受限，限制了它的應(yīng)用。不容忽視的是，由于該方法供體角膜緣干細(xì)胞移植片具有豐富的毛細(xì)血管，缺乏免疫赦免其移植后的排斥反應(yīng)常常較重；③羊膜移植：由于羊膜取材豐富、是一種目前在臨床上廣泛應(yīng)用的方法，但對于角膜堿燒傷等重度角膜損傷的患者，由于羊膜的透明度比角膜差，即使移植成功，角膜也不能恢復(fù)到原來的透明度，療效仍不佳。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明提供了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療角膜損傷的干細(xì)胞制劑中的應(yīng)用。研究表明臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可促進(jìn)角膜上皮的愈合，角膜渾濁程度低，減少角膜血管的生成，可更為有效的修復(fù)角膜上皮組織，可用于角膜堿燒傷的治療。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療角膜損傷的干細(xì)胞制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明通過在體動物實驗研究了人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，hUC-MSCs)對角膜上皮細(xì)胞的保護(hù)、誘導(dǎo)分化和促增殖作用，使得急性堿燒傷所造成的角膜上皮凋亡和缺損得以快速修復(fù)，從而恢復(fù)角膜上皮的完整性和透明性，重塑其正常的生理功能。而且，臍帶取材方便、來源充足、免疫原性弱、具有可移植性，具有廣泛的應(yīng)用前景。在本發(fā)明提供的實施例中，角膜損傷為角膜化學(xué)損傷。在本發(fā)明提供的實施例中，角膜損傷為角膜堿燒傷。在本發(fā)明中，治療角膜損傷的干細(xì)胞制劑包括臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。作為優(yōu)選，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞選自第2～5代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。在本發(fā)明提供的實施例中，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞為第2代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。作為優(yōu)選，治療角膜損傷的干細(xì)胞制劑的劑型為注射劑。作為優(yōu)選，治療角膜損傷的干細(xì)胞制劑的給藥劑量為(1～10)×106cell。在本發(fā)明提供的實施例中，治療角膜損傷的干細(xì)胞制劑的給藥劑量為2×106cell。在本發(fā)明提供的實施例中，治療角膜損傷的干細(xì)胞制劑的給藥方式為角鞏膜緣結(jié)膜下注射給藥。作為優(yōu)選，治療角膜損傷的干細(xì)胞制劑還包括藥學(xué)上可接受的輔料。本發(fā)明提供了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療角膜損傷的干細(xì)胞制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明至少具有如下優(yōu)勢之一：1、本發(fā)明研究表明臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可促進(jìn)角膜上皮的愈合，角膜渾濁程度低，減少角膜血管的生成，可更為有效的修復(fù)角膜上皮組織，可用于角膜堿燒傷的治療；2、本發(fā)明制劑中的干細(xì)胞來自臍帶，采集方便，為無創(chuàng)性操作；所得間充質(zhì)干細(xì)胞比其他的間充質(zhì)干細(xì)胞更幼稚，增殖和分化潛能更大；臍帶來源豐富，可以進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)；不受倫理限制，免疫原性低，在治療角膜損傷領(lǐng)域具有非常廣闊的應(yīng)用前景。附圖說明圖1示UC-MSCs細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果(40×)；圖2示UC-MSCs細(xì)胞表面標(biāo)記流式檢測結(jié)果；其中2-1～2-8分別示CD73、CD90、CD105、CD11b、CD34、CD45、CD19、HLA-DR的表達(dá)情況；圖3示UC-MSCs生長曲線；圖4示UC-MSCs成脂分化效果(200×)；圖5示UC-MSCs成骨分化效果(100×)；圖6示兔角膜堿燒傷模型；其中6-1示角膜NaOH化學(xué)燒傷情況，6-2示堿燒傷后熒光素鈉染色情況；圖7示各組兔角膜熒光素鈉染色第7天的結(jié)果；圖8示各組兔角膜HE染色結(jié)果(100×)；圖9示不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞移植后第1、3、5、7天的角膜上皮愈合率(n＝15)；圖10示不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療兔角膜堿燒傷模型后第7天的角膜切片HE染色結(jié)果(100×)。具體實施方式本發(fā)明公開了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療角膜損傷的干細(xì)胞制劑中的應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明提供的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療角膜損傷的干細(xì)胞制劑中的應(yīng)用中所用生物材料、試劑或儀器均可由市場購得。下面結(jié)合實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：實施例1：臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞制劑的制備在超凈工作臺中操作，將新鮮獲取的臍帶用乙醇進(jìn)行消毒，再用生理鹽水清洗臍帶，分離剝除臍帶血管，獲得華通氏膠部分，將華通氏膠剪碎，稀釋后種瓶，在二氧化碳培養(yǎng)箱中采用組織貼壁法培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，可以看到細(xì)胞貼壁生長，呈長梭形，胞漿透亮，胞體較小，有立體感，通過全量換液逐漸去除未貼壁細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)到70-80％即可收獲原代細(xì)胞；將所得原代細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以達(dá)到純化和擴(kuò)增培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的目的，結(jié)果見圖1。實施例2：臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)記研究利用流式細(xì)胞儀檢測實施例1獲得的第2代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)記，結(jié)果見表1和圖2。同MSCs相關(guān)的細(xì)胞表面標(biāo)記CD73、CD90、CD105高表達(dá)，各個代次的表達(dá)都穩(wěn)定，均高于95％；同造血細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞表面標(biāo)記CD11b、CD34、CD45、CD19以及同免疫排斥相關(guān)的HLA-DR表達(dá)低，均低于3％。證明多次傳代后臍帶來源的MSCs含有能穩(wěn)定增殖的干細(xì)胞，細(xì)胞高表達(dá)MSCs相關(guān)的標(biāo)記，不表達(dá)或低表達(dá)造血細(xì)胞和與移植排斥相關(guān)的細(xì)胞表面標(biāo)記，提示此類MSCs細(xì)胞是一類低免疫原性的干細(xì)胞。表1.UC-MSCs細(xì)胞表面標(biāo)記流式檢測結(jié)果實施例3：臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖研究取P5代UC-MSC接種于24孔板，1×104cells/孔。每天隨機(jī)收集3孔計數(shù)，連續(xù)7天，制作生長曲線。結(jié)果見表2和圖3。結(jié)果顯示：P5代細(xì)胞接種后0～4天為生長潛伏期；4～7天左右，細(xì)胞增長活躍，為對數(shù)增長期；此后細(xì)胞增長進(jìn)入平臺期，細(xì)胞生長曲線呈S形。表2.UC-MSCs細(xì)胞計數(shù)結(jié)果實施例4：臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化潛能研究將待檢測細(xì)胞(實施例1獲得的第2代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞)接種在12孔板中，分別使用對照培養(yǎng)基及成骨誘導(dǎo)分化、成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，之后持續(xù)觀察，待細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變，進(jìn)行染色鑒定。成脂誘導(dǎo)至第21天左右，進(jìn)行油紅O染色，結(jié)果見圖4。成骨誘導(dǎo)至第28天左右，進(jìn)行茜素紅染色，結(jié)果見圖5。實驗結(jié)果表明間充質(zhì)干細(xì)胞具有向成骨方向分化和向成脂方向分化的多向分化潛能。實施例5：對兔移植臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的實驗造模：取合格新西蘭大白兔，雌雄各半，體重2.5-3.0kg，檢查眼前段無病變。造模前一天，實驗動物術(shù)眼(統(tǒng)一為右眼)于結(jié)膜囊內(nèi)氧氟沙星滴眼液常規(guī)點眼。造模前，利用速眠新行實驗兔后腿肌注麻醉(0.1ml/kg)。將動物麻醉后，在實驗眼的角膜表面滴表面麻醉藥。置開瞼器，暴露角膜，用棉簽拭去眼表多余水分，將1mol/L的NaOH溶液30μl滴于直徑為8.0mm的單層濾紙片上，然后放置于兔右眼角膜中央，30s后取下，立即用生理鹽水快速持續(xù)沖洗眼表面及結(jié)膜囊1分鐘，以保證殘留的NaOH溶液被徹底去除。觀察兔角膜損傷范圍為：累積2/3范圍的角膜緣干細(xì)胞；損傷深度為：角膜上皮全層，即造模成功。將熒光素鈉染液滴入造模眼表面，裂隙燈觀察眼表角膜上皮缺損范圍，并拍照記錄，結(jié)果見圖6。將60只體重為2.5-3.0kg的新西蘭大白兔，雌雄各半，平均分為3組：模型對照組、陽性對照組、移植組，每組20只，其中10只于第7天解剖后進(jìn)行HE染色，另外10只于1～15天分別進(jìn)行角膜上皮愈合率、角膜混濁程度及角膜新生血管情況的觀察記錄。模型對照組注射生理鹽水；陽性對照組給予貝復(fù)舒滴眼液(每次1～2滴，每日4～6次)；移植組注射臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的移植方式為角鞏膜緣結(jié)膜下注射：取統(tǒng)一的兩個注射位點，總體積細(xì)胞數(shù)為2×106個，200μl，給藥1次。治療情況鑒定方法及結(jié)果如下：1、角膜上皮愈合情況：堿燒傷后隔天行角膜上皮熒光素鈉染色，觀察上皮愈合情況。分別于第1、3、5、7天觀察角膜表面著色面積，即為角膜上皮損傷的面積，利用ImageJ圖像分析軟件進(jìn)行計算。角膜上皮愈合率按以下公式計算：角膜上皮愈合率＝(第1天著色面積-觀察時著色面積)/第1天著色面積×100％結(jié)果見表3和圖7。結(jié)果顯示：移植組的角膜上皮愈合率高于模型對照組和陽性對照組，具有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.05)。表3.熒光素鈉著色面積和角膜上皮愈合率2、角膜混濁程度觀察及評估：分別在造模后的第1、3、5、7天使用裂隙燈觀察角膜透明情況并進(jìn)行角膜混濁程度評分(結(jié)果見表4)。結(jié)果顯示：移植組的角膜混濁程度評分低于對照組，具有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.05)。角膜混濁程度評分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分：角膜透明，無混濁；1分：極輕度角膜表淺混濁；2分：輕度角膜基質(zhì)混濁，可見瞳孔緣及虹膜血管；3分：中度角膜基質(zhì)混濁，僅見瞳孔緣；4分：重度角膜基質(zhì)混濁，僅見前房；5分：極重度角膜基質(zhì)混濁，前房不可見。表4.角膜混濁程度評分組別第1天第3天第5天第7天模型對照組3333陽性對照組3332移植組32113、角膜新生血管情況：處理后第7、11、15天分別利用裂隙燈顯微鏡觀察角膜新生血管情況，角膜新生血管通過計算新生血管長入的扇形區(qū)域面積來衡量，面積計算公式為：Area＝C/12×3.1416[R2-(R-r)2]，其中Area為面積，C為新生血管區(qū)域占角膜周長的鐘點數(shù)，r是從角膜中央到血管生長邊緣的半徑，R是角膜半徑。半徑和新生血管區(qū)域用ImageProPlus6.0圖像分析軟件來測量，結(jié)果見表5。結(jié)果顯示：移植組的新生血管面積低于模型對照組和陽性對照組，具有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05)表5.角膜新生血管面積(單位：mm2，平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)組別第7天第11天第15天模型對照組17.59±1.7819.21±1.6422.56±1.56陽性對照組12.58±1.6316.28±1.6417.33±1.62移植組7.37±1.658.38±1.899.08±1.924、HE染色檢測：各組于處理后第7天時處死10只兔子，進(jìn)行HE染色檢測，取燒傷眼角膜標(biāo)本，置于4％多聚甲醛固定液中固定標(biāo)本，常規(guī)脫水包埋、切片、HE染色，并于熒光顯微鏡下觀察拍照。主要觀察各組角膜在堿燒傷后各時間點各層組織的修復(fù)和變化情況，是否上皮完整等。結(jié)果見圖8。病理結(jié)果顯示：移植組在第7天生長出新的角膜上皮組織(箭頭所示)，修復(fù)情況較其它組好。實施例6：臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞與骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行療效的比較造模情況：將60只體重為2.5-3.0kg的新西蘭大白兔進(jìn)行造模，雌雄各半，方法如上述所示，造模成功。將60只新西蘭大白兔，平均分為4組：空白對照組、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞組、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞組。各種來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的移植方式均為角鞏膜緣結(jié)膜下注射：取統(tǒng)一的兩個注射位點，總體積細(xì)胞數(shù)為2×106個，200μl，給藥1次。治療效果鑒定方法及結(jié)果如下：1、角膜上皮愈合情況：方法如上述所示，結(jié)果顯示：角膜上皮愈合率在4組之間存在差別(P＜0.05)，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞組的角膜上皮愈合率較其它組高(結(jié)果見圖9)。2、角膜混濁程度觀察及評估：方法如上述所示，結(jié)果顯示：角膜混濁程度評分在4組之間存在差別(P＜0.05＝，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞組的角膜混濁程度評分較其它組低(結(jié)果見表6)。表6.不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞移植后第1、3、5、7天的角膜混濁程度評分(n＝15)組別第1天第3天第5天第7天空白對照組4333臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞組3221骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組3332脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞組43323、角膜新生血管情況：方法如上述所示，結(jié)果顯示：各組之間的角膜新生血管面積具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞組的角膜新生血管面積較其它組小(結(jié)果見表7)。表7.角膜新生血管面積(單位：mm2，平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)4、HE染色檢測：方法如上述所示，結(jié)果顯示：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞組和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組在第7天生長出新的角膜上皮組織(箭頭所示)，修復(fù)情況較其它組好(結(jié)果見圖10)。綜上所述，不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞移植后的角膜上皮愈合率、角膜混濁程度評分及新生血管長度均具有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.05)，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞組的療效較其它組的療效好。病理結(jié)果顯示，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞組和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組在第7天生長出新的角膜上皮組織(箭頭所示)，修復(fù)情況較其它組好。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3