本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)最早發(fā)現(xiàn)于骨髓，現(xiàn)已被證實(shí)存在于機(jī)體的多種組織器官中，是一群具有多向分化潛能的多能干細(xì)胞。目前間充質(zhì)干細(xì)胞的主要來源為成人骨髓，但成人骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量及增殖分化潛能隨年齡的增大而逐漸減弱，且病毒感染率較高、來源受到限制。

與其他來源MSCs相比，而來源于人臍帶的間充質(zhì)干細(xì)胞(Umbilicalcord Mesenchymal Stem Cells，UMSCs)是一種非常有潛力的干細(xì)胞資源，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，其資源豐富，不存在倫理道德問題，免疫原性弱，已應(yīng)用于臨床移植研究。

但在目前實(shí)際應(yīng)用過程中，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)存在擴(kuò)增能力有限、遷移性差等問題。干細(xì)胞的遷移性已被證實(shí)與干細(xì)胞的分化能力和損傷修復(fù)能力密切相關(guān)，因此，尋找一種新的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法以促進(jìn)其增殖、提高其遷移能力是非常有必要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明實(shí)施例的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，以解決現(xiàn)有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)存在擴(kuò)增能力有限、遷移性差等技術(shù)問題。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，作為本發(fā)明提供了一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法包括如下步驟：

將獲取的臍帶組織塊置于干細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)處理，其中，所述干細(xì)胞培養(yǎng)基中含有干細(xì)胞因子和白介素6因子，且所述干細(xì)胞因子與白介素6因子的含量比為(5-20μmol/L):(5-20ug/ml)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法通過在干細(xì)胞培養(yǎng)基中添加干細(xì)胞因子和白介素6因子，并控制兩因子含量比，使得兩細(xì)胞因子產(chǎn)生對臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生長和增殖的協(xié)效作用，從而提高臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增能力，并獲得較高的遷移能力，有效解決了傳統(tǒng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法存在的干細(xì)胞擴(kuò)增能力有限、遷移性差的問題，為臨床應(yīng)用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行組織損傷修復(fù)提供了優(yōu)良的種子。

在干細(xì)胞因子和白介素6因子協(xié)效作用的基礎(chǔ)上，通過在培養(yǎng)方法中增設(shè)的含有纖連蛋白包被液的包被處理，使得纖連蛋白與干細(xì)胞因子和白介素6因子之間進(jìn)一步產(chǎn)生協(xié)效作用，從而提高臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖以及遷移能力。

附圖說明

下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，附圖中：

圖1為實(shí)施例1重組質(zhì)粒pET-30a-rhIL-6酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，M:DNA ladder；1～3：質(zhì)粒pET-30a-rhIL-6用Nde I和Xho I進(jìn)行酶切；

圖2為實(shí)施例1中rhIL-6在菌株BL21(DE3)pET-30a-rhIL-6中誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果的SDS-PAGE檢測圖；其中，1：IPTG誘導(dǎo)后的BL21(DE3)pET-30a-rhIL-6菌體總蛋白；2：未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的BL21(DE3)pET-30a-rhIL-6菌體總蛋白；3：購買的商業(yè)化IL-6樣本；M：蛋白質(zhì)Marker；

圖3為實(shí)施例1中離子交換層析后的目的IL-6重組蛋白的SDS-PAGE檢測圖；其中，M：蛋白Marker；1：300mmol NaCl洗脫物(10ug/ml)；2：300mmol NaCl洗脫物(140ug/ml)；3：PB平衡緩沖液洗脫物；

圖4為實(shí)施例1-2和對比實(shí)施例1-3各實(shí)施例培養(yǎng)的UMSC生長曲線圖；

圖5為實(shí)施例1和對比實(shí)施例3培養(yǎng)的UMSC表型流式檢測圖；其中圖A為間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原表達(dá)流式圖，圖B為造血細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)流式圖；

圖6為實(shí)施例1和對比實(shí)施例3培養(yǎng)的UMSC周期的流式檢測圖；其中圖A為Ctr-UMSC細(xì)胞周期的流式檢測圖；圖B為F/S/I-UMSC細(xì)胞周期的流式檢測圖；圖C為Ctr-UMSC細(xì)胞和F/S/I-UMSC細(xì)胞周期流式檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖；

圖7為實(shí)施例1和對比實(shí)施例3培養(yǎng)的UMSC遷移性檢測圖；其中圖A為Ctr-UMSC細(xì)胞遷移軌跡跟蹤圖；圖B為F/S/I-UMSC細(xì)胞遷移軌跡跟蹤圖；圖C為Ctr-UMSC細(xì)胞和F/S/I-UMSC細(xì)胞遷移平均速度統(tǒng)計(jì)圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

相關(guān)專業(yè)詞匯說明：

纖連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)：高分子量(～440kDa)的糖蛋白細(xì)胞外基質(zhì)，和細(xì)胞膜內(nèi)稱為整合素的受體蛋白結(jié)合。

干細(xì)胞因子(Stem Cell Factor，SCF)：酪氨酸激酶受體c-Kit的配體。

白介素6(Interleukin 6，IL-6)：也被稱為B細(xì)胞刺激因子2，主要由單核巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及淋巴樣細(xì)胞產(chǎn)生，是一種多功能細(xì)胞因子。IL-6與細(xì)胞膜受體復(fù)合物相連接，該受體復(fù)合物是由可溶性的IL-6連接蛋白(IL-6R)和糖蛋白gp130組成。IL-6/IL-6R復(fù)合物誘導(dǎo)2分子gp130形成同型二聚體，從而引起細(xì)胞間的信號傳遞。。

IPTG：異丙基硫代半乳糖苷，是一種作用極強(qiáng)的誘導(dǎo)劑。

一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種能夠有效提高臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和遷移的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法。本實(shí)施例臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法含有如下步驟：

將獲取的臍帶組織塊置于干細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)處理，其中，所述干細(xì)胞培養(yǎng)基中含有干細(xì)胞因子和白介素6因子，且所述干細(xì)胞因子與白介素6因子的含量比為(5-20μmol/L):(5-20ug/ml)。

在步驟中，所述干細(xì)胞培養(yǎng)基中含有干細(xì)胞因子和白介素6因子，且控制所述干細(xì)胞因子與白介素6因子的含量比為(5-20μmol/L):(5-20ug/ml)。通過在培養(yǎng)基中添加干細(xì)胞因子與白介素6因子，并控制兩因子的含量比例，使得兩因子在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增中發(fā)揮協(xié)效作用，從而提高臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增能力，并獲得較高的遷移能力。

在一實(shí)施例中，控制干細(xì)胞因子在所述干細(xì)胞培養(yǎng)基中的濃度為5-20μmol/ml。當(dāng)然在干細(xì)胞因子和白介素6因子含量比例明確的前提下，明確了干細(xì)胞因子在所述干細(xì)胞培養(yǎng)基中的濃度，也就明確了白介素6在所述干細(xì)胞培養(yǎng)基中的濃度。通過優(yōu)化控制干細(xì)胞因子和白介素6在所述干細(xì)胞培養(yǎng)基中的濃度，能夠進(jìn)一步提高干細(xì)胞因子與白介素6因子的協(xié)效作用，從而進(jìn)一步提高臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增能力和遷移能力。

在上述實(shí)施例的基礎(chǔ)上，在一實(shí)施例中，白介素6因子為重組人IL-6，具體是以經(jīng)優(yōu)化后的人全長IL-6基因?yàn)榘谢蜻M(jìn)行誘導(dǎo)后的重組人IL-6。其中，人全長IL-6基因序列為GenBank數(shù)據(jù)庫記錄的人全長IL-6基因序列，所述優(yōu)化后的人全長IL-6基因序列是針對GenBank數(shù)據(jù)庫記錄的人全長IL-6基因序列進(jìn)行的優(yōu)化。在具體實(shí)施例中，所述優(yōu)化后的人全長IL-6基因序列如下：

其中，上述重組人IL-6的誘導(dǎo)獲得方法是以優(yōu)化后的人全長IL-6基因序列為靶基因進(jìn)行設(shè)計(jì)引物和相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，然后按照常規(guī)的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化和表達(dá)，具體是將優(yōu)化后的人全長IL-6基因序列插入到原核表達(dá)載體中，獲得重組質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化獲得含有優(yōu)化后的人全長IL-6基因序列的菌株，最后實(shí)現(xiàn)重組人IL-6的表達(dá)。在具體實(shí)施例中，重組人IL-6的獲得方法可以但不僅僅如下文實(shí)施例1中的重組人IL-6的制備方法制備獲得。采用上述重組人IL-6，使得其與干細(xì)胞因子之間生產(chǎn)的協(xié)效作用更強(qiáng)，從而使得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增能力和遷移能力更強(qiáng)。

一實(shí)施例中，上述臍帶組織塊置于干細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)處理方法為：

先采用所述干細(xì)胞培養(yǎng)基浸潤所述培養(yǎng)器，去掉所述干細(xì)胞培養(yǎng)基，再將所述臍帶組織塊加入所述培養(yǎng)器中培養(yǎng)2-3小時后，加入新的所述干細(xì)胞培養(yǎng)基直至沒過所述臍帶組織塊進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)，直至有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞爬出，待所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞達(dá)到80-90％融合時，棄去所述臍帶組織塊，用胰酶-EDTA消化傳代。在具體實(shí)施例中，在所述繼續(xù)培養(yǎng)的過程中，前三天不要動培養(yǎng)皿，第四天開始每隔兩天換一次所述干細(xì)胞培養(yǎng)基，直至有所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞爬出。通過該培養(yǎng)方法使得干細(xì)胞因子和白介素6因子充分發(fā)揮作用，促進(jìn)臍帶組織塊中的臍帶間干細(xì)胞的增殖以及遷移能力。

在上述各實(shí)施例的基礎(chǔ)上，在優(yōu)選實(shí)施例中，上述培養(yǎng)處理是在被包被處理的培養(yǎng)器中進(jìn)行，所述包被處理的包被液含有纖連蛋白。通過事先采用含有纖連蛋白的包被液對培養(yǎng)器進(jìn)行包被處理，使得功能因子纖連蛋白分布在培養(yǎng)器的內(nèi)部中，當(dāng)將獲取的臍帶組織塊置于干細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)處理的過程中，該纖連蛋白會發(fā)揮作用，具體是其能夠參與到干細(xì)胞因子和白介素6因子的協(xié)效作用中，從而使得三因子產(chǎn)生協(xié)效作用，從而提高臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)過程中的增殖以及遷移能力。在此基礎(chǔ)上，一實(shí)施例中，所述纖連蛋白在所述包被液中的濃度為5-20μg/ml。在具體實(shí)施例中，包被處理的方法可以但不僅僅為將含有該濃度的纖連蛋白的緩沖溶液加入培養(yǎng)器中，于優(yōu)選4℃避光過夜。

在培養(yǎng)器被包被處理的前提下，一實(shí)施例中，上述臍帶組織塊置于干細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)處理方法：先采用所述干細(xì)胞培養(yǎng)基浸潤被所述包被處理的所述培養(yǎng)器，去掉所述干細(xì)胞培養(yǎng)基，再將所述臍帶組織塊加入所述培養(yǎng)器中培養(yǎng)2-3小時后，加入新的所述干細(xì)胞培養(yǎng)基直至沒過所述臍帶組織塊進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)，直至有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞爬出，待所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞達(dá)到80-90％融合時，棄去所述臍帶組織塊，用胰酶-EDTA消化傳代。在具體實(shí)施例中，在所述繼續(xù)培養(yǎng)的過程中，前三天不要動培養(yǎng)皿，第四天開始每隔兩天換一次所述干細(xì)胞培養(yǎng)基，直至有所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞爬出。

另外，上述各實(shí)施例中的臍帶組織塊的大小可以是本領(lǐng)域常規(guī)的大小，如3-4mm²體積組織塊。

下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供了一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞及其培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

1. 重組人IL-6(rhIL-6)的制備

1.1 pET-30a-rhIL-6原核表達(dá)菌株的構(gòu)建

對來自GenBank數(shù)據(jù)庫的人全長IL-6基因進(jìn)行堿基密碼子的優(yōu)化，使其易于在大腸桿菌中表達(dá)。優(yōu)化后的堿基序列如下：

對優(yōu)化后的rhIL-6全長基因序列進(jìn)行合成，設(shè)計(jì)引物和酶切位點(diǎn)(其中5’端酶切位點(diǎn)為Nde I，3’端酶切位點(diǎn)為Xho I)，正向引物和反向引物的序列如下：

5'-CGCCATATGATGAACTCCTTCTCCA-3'；——SEQ ID NO 2

5'-CTCGAGCGGCTACATTTGACGAAGA-3'——SEQ ID NO 3。

將rhIL-6全長基因插入到原核表達(dá)載體pET-30a(+)載體中，得到重組質(zhì)粒pET-30a-rhIL-6，并將其轉(zhuǎn)化進(jìn)入BL21(DE3)中。在LB板上經(jīng)過卡那霉素(30μg/ml)抗性篩選后，挑取單菌落到LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，將酶切后的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，鑒定結(jié)果如圖1所示，由此可知，人工合成的rhIL-6全長序列(636bp)已成功插入原核表達(dá)載體pET-30a(+)(5422bp)中，并轉(zhuǎn)化進(jìn)入BL21(DE3)中，即得到的陽性表達(dá)菌株BL21(DE3)pET-30a-rhIL-6。

1.2 IL-6重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

按照1:50的比例接種BL21(DE3)pET-30a-rhIL-6菌種到LB培養(yǎng)基(含30ug/ml Kan)中，37℃、220-250rpm震蕩培養(yǎng)過夜。第二天早上按照1:100的比例接種前一天培養(yǎng)的細(xì)菌于LB培養(yǎng)液(含30ug/ml的Kan)中擴(kuò)大培養(yǎng)，至OD600＝0.5-0.6(一般接種培養(yǎng)2-3h)，加入IPTG至終濃度為1mM，30℃誘導(dǎo)表達(dá)3h，收獲菌體，用SDS-PAGE對目的rhIL-6蛋白進(jìn)行檢測，鑒定結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，泳道1的結(jié)果顯示，菌株BL21(DE3)pET-30a-rhIL-6在30℃用1mM IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)時能夠成功表達(dá)rhIL-6。

1.3 IL-6重組蛋白的純化

將上述收集的菌懸液5000g，4℃離心10min，棄上清，用預(yù)冷的裂解緩沖液(50mMPB，5mMEDTA，pH6.5)40-50倍濃縮菌體，置于50ml離心管或50ml燒杯內(nèi)，進(jìn)行超聲破碎。超聲條件：冰水浴，超聲4s，間隔5s，4min/次，重復(fù)至菌液變澄清為止。將裂解物12000g，4℃離心10min，收集上清，先后用0.8um、0.45μm的濾膜過濾后，利用離子交換層析法進(jìn)行上樣純化和濃縮，大概流程如下：

(1)用20mM PB洗柱子，隨洗脫進(jìn)行，280nm吸光度值先升高后降低，降至0.000-0.005時換下一洗脫液進(jìn)行洗脫；

(2)180mM NaCl的20mM PB洗柱子，280nm吸光度值先升高后降低，降至0.000-0.007時換用下一洗脫液；

(3)含300mM NaCl的20mM PB洗脫目的蛋白、分管收集。同時用SDS-PAGE對收集的目的蛋白進(jìn)行檢測；檢測的電泳圖見圖3。從圖3的1、2、3泳道可以看出，利用該方法可以很好地將目的蛋白和其它雜蛋白區(qū)分開來，獲得高純度的rhIL-6蛋白；

(4)取50ml收集的目的蛋白樣品加入100ml不含NaCl的PB緩沖液，在4℃冰箱中進(jìn)行超濾，當(dāng)超濾杯內(nèi)液體剩余20ml左右時停止超濾，在超凈臺內(nèi)打開超濾杯，吸出少量樣品溶液，檢測蛋白濃度，將樣品濃縮至1mg/ml，用0.22um的濾器過濾，并分裝備用。

2. 原代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

2.1 Day 0：

細(xì)胞培養(yǎng)板的包被：取1個10cm培養(yǎng)皿，加入4ml含10ug/ml FN的DPBS溶液，4℃避光過夜放置。

1#完全培養(yǎng)基的配制：高糖DMEM+2％Ultroser G+10μmol/L SCF+10ug/ml IL-6+1％青鏈霉素。其中，IL-6為步驟1中獲得的重組人IL-6(rh IL-6)。

2.2 Day 1：將新鮮的臍帶組織用4度預(yù)冷的無鈣鎂hank’s液沖洗，用眼科剪盡量去除肉眼可見的血管，沖洗血液后，將臍帶組織剪成3-4mm²大小組織塊；

2.3 將包被的10cm培養(yǎng)皿取出，吸棄包被液，加入4ml 1#完全培養(yǎng)基潤濕后，吸棄完全培養(yǎng)基。

2.4 分別將剪好的臍帶組織塊用眼科鑷轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中均勻擺放，放置于37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.5 2-3小時后，取出10cm培養(yǎng)皿，向皿內(nèi)空白處滴入相應(yīng)的完全培養(yǎng)基潤濕組織塊，以稍微沒過組織塊為宜。繼續(xù)放入37度、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.6 前三天不要動培養(yǎng)皿，第四天開始每隔兩天換一次液，直至有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞爬出。

2.7 細(xì)胞達(dá)到80-90％融合時，棄去組織塊，用0.25％胰酶-EDTA消化傳代。培養(yǎng)獲得的細(xì)胞標(biāo)記為F/S/I-UMSC。

實(shí)施例2

本實(shí)施例提供了一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞及其培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

1. 重組人IL-6(rhIL-6)的制備，參照實(shí)施例1的步驟1；

2. 原代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

2.1 Day 0：

細(xì)胞培養(yǎng)板：取1個10cm培養(yǎng)皿，不進(jìn)行包被處理。

1#完全培養(yǎng)基的配制：高糖DMEM+2％Ultroser G+10μmol/L SCF+10ug/ml IL-6+1％青鏈霉素。其中，IL-6為步驟1中獲得的重組人IL-6(rh IL-6)。

2.2 Day 1：將新鮮的臍帶組織用4度預(yù)冷的無鈣鎂hank’s液沖洗，用眼科剪盡量去除肉眼可見的血管，沖洗血液后，將臍帶組織剪成3-4mm²大小組織塊；

2.3 將10cm培養(yǎng)皿用4ml 1#完全培養(yǎng)基潤濕后，吸棄完全培養(yǎng)基。

步驟2.4至步驟2.7參照實(shí)施例1的步驟2.4至步驟2.7；培養(yǎng)獲得的細(xì)胞標(biāo)記為S/I-UMSC。

對比實(shí)施例1

本實(shí)施例提供了一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

1. 重組人IL-6(rhIL-6)的制備：參照實(shí)施例1中的步驟1。

2. 原代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

2.1 Day 0：

細(xì)胞培養(yǎng)板：取1個10cm培養(yǎng)皿，不進(jìn)行包被處理。

2#完全培養(yǎng)基的配制：高糖DMEM+2％Ultroser G+10ug/ml IL-6+1％青鏈霉素。

步驟2.2至步驟2.7參照實(shí)施例2的步驟2.2至步驟2.7；采用2#完全培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的細(xì)胞標(biāo)記為I-UMSC.

對比實(shí)施例2

本實(shí)施例提供了一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

1. 原代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

1.1 Day 0：

細(xì)胞培養(yǎng)板：取1個10cm培養(yǎng)皿，不進(jìn)行包被處理。

3#完全培養(yǎng)基的配制：高糖DMEM+2％Ultroser G+10μmol/L SCF+1％青鏈霉素。

步驟2.2至步驟2.7參照實(shí)施例2的步驟2.2至步驟2.7；采用3#完全培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的細(xì)胞標(biāo)記為S-UMSC。

對比實(shí)施例3

本實(shí)施例提供了一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

1. 原代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

1.1 Day 0：

細(xì)胞培養(yǎng)板：取1個10cm培養(yǎng)皿，不進(jìn)行包被處理。

4#完全培養(yǎng)基的配制：高糖DMEM+2％Ultroser G+1％青鏈霉素。

步驟2.2至步驟2.7參照實(shí)施例2的步驟2.2至步驟2.7；采用4#完全培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的細(xì)胞標(biāo)記為Ctr-UMSC。

相關(guān)實(shí)驗(yàn)測試和測試結(jié)果

將上述實(shí)施例1-2獲得的F/S/I-UMSC、S/I-UMSC和對比實(shí)施例1-3分別獲得的I-UMSC、S-UMSC、Ctr-UMSC分別進(jìn)行下述相關(guān)實(shí)驗(yàn)：

1. 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生長曲線繪制

分別取各實(shí)施例中P4代后各UMSC細(xì)胞，以1×10⁴/孔的密度接種24孔板，每隔兩天，取兩孔細(xì)胞，胰酶消化后收集細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取兩孔細(xì)胞數(shù)均值，繪制不同組的細(xì)胞生長曲線。經(jīng)測試，實(shí)施例1-2獲得UMSC細(xì)胞的增殖能力強(qiáng)于對比實(shí)施例1-3中所培養(yǎng)的UMSC，其中對比實(shí)施例3獲得的Ctr-UMSC細(xì)胞的增殖能力最弱，具體UMSC的生長曲線如圖4所示。由此證明了SCF與重組人IL-6之間、SCF與重組人IL-6和FN三者之間具有對UMSC的增殖和生長的協(xié)效作用。

2. 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表型鑒定

2.1 消化各實(shí)施例中P4代后對數(shù)生長期的UMSC細(xì)胞，計(jì)數(shù)；

2.2 分別取10⁶個細(xì)胞于流式管中，DPBS洗兩遍，離心去上清；

2.3 100ul DPBS重懸后，分別單獨(dú)加入CD90-FITC、CD105-FITC、CD45-PE、CD34-PE抗體，常溫避光孵育30min；

2.4 DPBS洗兩遍，離心去上清；

2.5 0.5ml DPBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型，Cell-Quest軟件分析，每個樣本至少分析10000個細(xì)胞。

經(jīng)過分別取各實(shí)施例中P4代后對數(shù)生長期的UMSC細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面CD90、CD105、CD45、CD34抗原的表達(dá)，流式檢測結(jié)果顯示，各實(shí)施例中UMSC細(xì)胞表面均低表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)志物CD34，CD45，高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原CD90，CD105。其中，以實(shí)施例1的F/S/I-UMSC細(xì)胞和對比實(shí)施例3的Ctr-UMSC細(xì)胞為例，其各自流式檢測結(jié)果如圖5所示，兩組UMSC細(xì)胞表面均低表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)志物CD34，CD45(<2％)，高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原CD90，CD105(>95％)。

3. 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞周期檢測

3.1 消化各實(shí)施例中P4代后對數(shù)生長期的UMSC細(xì)胞，計(jì)數(shù)；

3.2 分別取10⁶個細(xì)胞于流式管中，DPBS洗兩遍，離心去上清；

3.3 一邊震蕩一邊向細(xì)胞沉淀中加入70％預(yù)冷乙醇混勻，4℃固定18h以上；

3.4 離心，棄去乙醇上清，加入預(yù)冷的DPBS洗沉淀2次，離心去上清；

3.5 0.5ml DPBS重懸細(xì)胞，加入5ul的5mg/ml RNA酶(終濃度50ug/ml)，37℃下孵育30min；

3.6 加入25ul 1mg/ml PI(終濃度50ug/ml)，混勻后室溫、避光反應(yīng)30min；

3.7 流式細(xì)胞儀進(jìn)行DNA檢測，用Modifit軟件分析各時相細(xì)胞周期的比例。

經(jīng)過分別取各實(shí)施例中P4代后對數(shù)生長期的UMSC細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行DNA檢測，用Modifit軟件分析各時相細(xì)胞周期的比例，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示處于G2-M期的實(shí)施例1-2培養(yǎng)的F/S/I-UMSC、S/I-UMSC細(xì)胞細(xì)胞比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對比實(shí)施例1-3中I-UMSC、S-UMSC、Ctr-UMSC，且差異有顯著性(P<0.05)，進(jìn)一步證實(shí)了SCF與重組人IL-6之間、SCF與重組人IL-6和FN三者之間具有對UMSC的增殖和生長的協(xié)效作用，經(jīng)過SCF和IL-6兩因子或SCF、IL-6和FN三因子處理的UMSC細(xì)胞的增殖能力要強(qiáng)于傳統(tǒng)方法所培養(yǎng)的Ctr-UMSC細(xì)胞。以實(shí)施例1的F/S/I-UMSC和對比實(shí)施例3的Ctr-UMSC為例，實(shí)施例1中處于G2-M期的F/S/I-UMSC細(xì)胞比例為15.3％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對比實(shí)施例3的Ctr-UMSC細(xì)胞G2-M期的細(xì)胞比例(4.9％)，且兩者的差異有顯著性(P<0.05)，如圖6所示。

4. 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞遷移能力檢測

4.1 分別取各實(shí)施例中P4代后UMSC細(xì)胞，以5x10³/的密度接種于玻底皿中，，置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h以使細(xì)胞貼壁；

4.2 取出玻底皿，更換二氧化碳非依賴性的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞加入10ug/ml IL-3，對照組加入等量DPBS。將其置于leica倒置顯微鏡的活細(xì)胞工作室內(nèi)，用顯微鏡配備的Leica DFC 360FX照相機(jī)對細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時拍照，拍照間隔10min，持續(xù)拍24h。

4.3 對獲得的活細(xì)胞電影用ImageJ軟件及其插件MTrackJ進(jìn)行離線分析，對單個細(xì)胞的運(yùn)動軌跡進(jìn)行人工追蹤，計(jì)算單個細(xì)胞的遷移速度(mm/天)；

經(jīng)過分別統(tǒng)計(jì)各實(shí)施例中P4代后UMSC細(xì)胞運(yùn)動速率差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)施例1-2培養(yǎng)的F/S/I-UMSC、S/I-UMSC細(xì)胞遷移性要強(qiáng)于對比實(shí)施例1-3中I-UMSC、S-UMSC、Ctr-UMSC，且差異有顯著性(P<0.05)，進(jìn)一步證實(shí)了SCF與重組人IL-6之間、SCF與重組人IL-6和FN三者之間具有促進(jìn)UMSC遷移能力的協(xié)效作用，經(jīng)過SCF和IL-6兩因子或SCF、IL-6和FN三因子處理的UMSC細(xì)胞的遷移能力要強(qiáng)于傳統(tǒng)方法所培養(yǎng)的Ctr-UMSC細(xì)胞。以實(shí)施例1的F/S/I-UMSC和對比實(shí)施例3的Ctr-UMSC為例，實(shí)施例1的F/S/I-UMSC遷移能力與對比實(shí)施例3的Ctr-UMSC相比，兩者的遷移速度有顯著性差異(P<0.05)，如圖7所示。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。