本發(fā)明涉及一種簡易快速的收集豬復雜形態(tài)胚胎的方法，屬于獸醫(yī)學技術領域。

背景技術：

豬是重要的醫(yī)學模型動物。盡管目前對豬胚胎孵化后發(fā)育比較詳細的數(shù)據(jù)，但是相對模式生物小鼠來說，豬胚胎發(fā)育數(shù)據(jù)非常有限，構成了豬在生物醫(yī)學方面發(fā)展的瓶頸。豬孵化后胚胎已進入子宮腔，它們的發(fā)育經(jīng)歷較漫長的著床前時間，期間胚胎外觀形態(tài)發(fā)生了復雜的形態(tài)變化，包括圓形、卵圓形、管狀和長達近1米的線形形態(tài)。目前雖然有研究報道豬胚胎的形態(tài)，且給出了收集胚胎時所用沖胚液配方[Hassoun R,Schwartz P,Rath D,Viebahn C,J.Germ layer differentiation during early hindgut and cloaca formation in rabbit and pig embryos.J Anat.2010；217(6):665-78；du Puy L,Lopes SM,Haagsman HP,Roelen BA.Analysis of co-expression of OCT4,NANOG and SOX2in pluripotent cells of the porcine embryo,in vivo and in vitro.Theriogenology.2011；75(3):513-26.]，但是各個實驗室配方有差異。Hall VJ[Hall VJ,Christensen J,Gao Y,Schmidt MH,Hyttel P.Porcine pluripotency cell signaling develops from the inner cell mass to the epiblast during early development.Dev Dyn.2009；238(8):2014-24.]給出了胚胎收集的操作操作方法，但其方法是需要擠壓子宮，從而易破壞胚胎的胚外組織，不易分離單個胚胎。豬子宮是由子宮頸、子宮體和子宮角組成，闊韌帶把子宮角和子宮體連接成整體。子宮的形態(tài)特征是子宮體方向粗，子宮角在輸卵管方向細。基于豬孵化后胚胎形態(tài)的復雜性和子宮的特征，本發(fā)明在前期實驗摸索的基礎上，提出了一種能夠簡易快速的收集豬復雜形態(tài)胚胎的方法。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種簡易快速的收集豬復雜形態(tài)胚胎的方法。

為了達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術手段：

本發(fā)明的一種簡易快速的收集豬復雜形態(tài)胚胎的方法，包括以下步驟：

1)將屠宰后妊娠母豬的子宮頸位置結扎，然后取其子宮及附屬器官，置于預熱的沖胚液中，37℃保溫；

2)應用止血鉗分別在子宮體與子宮角相連的位置以及子宮角與輸卵管相連的位置處結扎，剔除子宮闊韌帶及附屬器官，用剪刀將兩側子宮角從子宮體上分離下來；

3)在子宮角與輸卵管相連的位置處以垂直于子宮角的方向用剪刀剪開小口；

4)用注射器裝滿沖胚液，然后在子宮角剪開小口位置，把沖胚液注入子宮角，提起子宮角兩端，晃動子宮角；

5)擺順子宮角后，將子宮體與子宮角相連的位置處的止血鉗去除，用移液器槍頭疏通，并使開口位于收集器皿中；

6)提起子宮角細端，根據(jù)重力使沖胚液及胚胎從子宮角的細端向粗端自動流出；此時，用手在液體流出位置控制液體流出量，收集液體于培養(yǎng)器皿中，完成沖胚；

7)每部分子宮角按照步驟4)-6)重復兩次。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的沖胚液為含有5％(v/v)FBS的0.02M pH7.2-7.6的磷酸緩沖液。

優(yōu)選的，每次沖胚時所用的沖胚液的體積為100-150ml。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，保溫時間不超過1小時，且沖胚時不擠壓子宮角。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，用手在液體流出位置控制液體流出量，流出量以覆蓋10cm培養(yǎng)皿皿底為宜，將液體收集于多個培養(yǎng)皿中。

豬胚胎發(fā)育至囊胚時期，胚胎已全部進入子宮。子宮內，囊胚孵化，孵化后胚胎形態(tài)會經(jīng)歷球形、卵圓形、管狀和線性的變化。在此過程中，胚胎也會在子宮內移動，最后在15天左右均勻分布到子宮角，與子宮建立聯(lián)系，發(fā)生著床。10天的胚胎呈現(xiàn)卵圓形，11天的胚胎出現(xiàn)管狀和線性，12天的胚胎以線性為主，13天的胚胎則全部形成長度上米的線性胚胎。

在方法改變之前，我們收集到第12.5天的胚胎如圖2A所示，胚胎呈現(xiàn)線團狀，纏繞在一起。在纏繞在一團的胚胎中進行單個完整胚胎分離難度大、耗費時間長，很難觀察到完整胚胎形態(tài)。經(jīng)過分離能得到如圖2B的線性胚胎，可見胚胎出現(xiàn)斷裂。

應用本發(fā)明方法收集第10.5天的胚胎，如圖3A所示，可獲得完整的球形和管狀胚胎。收集第12.5天的胚胎，利用本方法較容易的分離出單個完整的線性胚胎，如圖3B。利用新方法我們從16頭妊娠的母豬中收集了胎齡為第6-14天的胚胎，此階段胚胎形態(tài)有圓形、球形、管狀和線性胚胎。因此，說明利用本發(fā)明的方法可以獲得各個天數(shù)的完整形態(tài)胚胎。

附圖說明

圖1為子宮結扎示意圖。

圖2為使用現(xiàn)有方法收集的妊娠12.5天(D12.5)的胚胎；

其中圖2A為分離前胚胎，圖2B為分離后胚胎；

圖3為采用本發(fā)明方法收集的胚胎；

其中圖3A為妊娠10.5天(D10.5)的胚胎，圖3B為分離后妊娠12.5天(D12.5)的胚胎。

具體實施方式

下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內。

實施例1

1、準備工作：

1)妊娠10.5天母豬；

2)沖胚液：2000ml 0.02M pH7.2-7.6磷酸緩沖液(Phosphate Buffered Saline)加100ml FBS(Fetal Bovine Serum)過濾滅菌，4度保存。用時提前37℃預熱。

3)器皿耗材：托盤、止血鉗、剪刀，注射器、10cm培養(yǎng)皿、移液槍槍頭

2、方法步驟：

1)將屠宰后妊娠10.5天母豬的子宮頸位置結扎，然后取其子宮及附屬器官，置于預熱的沖胚液中，37℃保溫；

2)應用止血鉗分別在子宮體與子宮角相連的位置以及子宮角與輸卵管相連的位置處結扎(子宮結扎示意圖如圖1所示)，剔除子宮闊韌帶及附屬器官，用剪刀將兩側子宮角從子宮體上分離下來；

3)在子宮角與輸卵管相連的位置處以垂直于子宮角的方向用剪刀剪開小口；

4)用100ml注射器裝滿沖胚液，然后在子宮角剪開小口位置，把沖胚液注入子宮角，提起子宮角兩端，輕柔的晃動子宮角；

5)擺順子宮角后，將子宮體與子宮角相連的位置處的止血鉗去除，用移液器槍頭疏通，并使開口位于收集器皿中；

6)提起子宮角細端，根據(jù)重力使沖胚液及胚胎從子宮角的細端向粗端自動流出；此時，用手在液體流出位置控制液體流出量，流出量以覆蓋10cm培養(yǎng)皿皿底為宜，將液體收集于多個培養(yǎng)皿中，完成沖胚；

7)每部分子宮角按照步驟4)-6)重復兩次。

3、效果：

應用本方法收集第10.5天的胚胎，如圖3A所示，可見采用該方法可獲得完整的球形和管狀胚胎。

注意事項：

1)屠宰到?jīng)_胚的時間，盡可能的縮短時間，保證在1h內進行；

2)避免擠壓子宮角，控制沖胚速度。

實施例2

1、準備工作：

1)妊娠12.5天母豬；

2)沖胚液：2000ml 0.02M pH7.2-7.6磷酸緩沖液(Phosphate Buffered Saline)加100ml FBS(Fetal Bovine Serum)過濾滅菌，4度保存。用時提前37℃預熱。

3)器皿耗材：托盤、止血鉗、剪刀，注射器、10cm培養(yǎng)皿、移液槍槍頭

2、方法步驟：

1)將屠宰后妊娠12.5天母豬的子宮頸位置結扎，然后取其子宮及附屬器官，置于預熱的沖胚液中，37℃保溫；

2)應用止血鉗分別在子宮體與子宮角相連的位置以及子宮角與輸卵管相連的位置處結扎(子宮結扎示意圖如圖1所示)，剔除子宮闊韌帶及附屬器官，用剪刀將兩側子宮角從子宮體上分離下來；

3)在子宮角與輸卵管相連的位置處以垂直于子宮角的方向用剪刀剪開小口；

4)用150ml注射器裝滿沖胚液，然后在子宮角剪開小口位置，把沖胚液注入子宮角，提子宮角兩端，輕柔的晃動子宮角；

5)擺順子宮角后，將子宮體與子宮角相連的位置處的止血鉗去除，用移液器槍頭疏通，并使開口位于收集器皿中；

6)提起子宮角細端，根據(jù)重力使沖胚液及胚胎從子宮角的細端向粗端自動流出；此時，用手在液體流出位置控制液體流出量，流出量以覆蓋10cm培養(yǎng)皿皿底為宜，將液體收集于多個培養(yǎng)皿中，完成沖胚；

7)每部分子宮角按照步驟4)-6)重復兩次。

同時采用以現(xiàn)有方法收集的12.5天的胚胎作為對照。步驟如下[Hall VJ,Christensen J,Gao Y,Schmidt MH,Hyttel P.Porcine pluripotency cell signaling develops from the inner cell mass to the epiblast during early development.Dev Dyn.2009；238(8):2014-24.]：

1)取屠宰后妊娠母豬子宮37℃保溫運輸至實驗室；

2)輸卵管傘部的末端加入150ml含有0.1％(v/v)FBS的0.02M pH7.2-7.6的磷酸緩沖液作為沖胚液，馬胚胎沖洗導管一端插入子宮角底端，一端連接37℃預熱滅菌瓶；

3)從輸卵管端向子宮角端按摩、擠壓子宮收集胚胎。

效果：

應用本方法收集第12.5天的胚胎，如圖3B所示，可見采用該方法可獲得完整的線性胚胎。

使用現(xiàn)有方法收集到的第12.5天的胚胎如圖2A所示，胚胎呈現(xiàn)線團狀，纏繞在一起。在纏繞在一團的胚胎中進行單個完整胚胎分離難度大、耗費時間長，很難觀察到完整胚胎形態(tài)。經(jīng)過分離能得到如圖2B的線性胚胎，可見胚胎出現(xiàn)斷裂。

注意事項：

1)屠宰到?jīng)_胚的時間，盡可能的縮短時間，保證在1h內進行；

2)避免擠壓子宮角，控制沖胚速度。