本發(fā)明涉及干細(xì)胞
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為紅母細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs)具有較高的分化潛能，可向多個(gè)方向進(jìn)行分化。它在骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、內(nèi)皮和心肌等組織工程方面具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，貼壁的UC-MSCs均表達(dá)CD166、CD44、CD29，CD105,CD90，CD73,低表達(dá)CD106，不表達(dá)造血細(xì)胞表型CD38、CD34、CD45和內(nèi)皮細(xì)胞表型CD31，也不表達(dá)HLA-DR：有報(bào)道從人臍帶中分離出UC-MSCs，且細(xì)胞含量、增殖能力優(yōu)于骨髓MSCs和脂肪MSCs，免疫原性比骨髓MSCs和脂肪MSCs低，并且具有取材方便，無倫理問題等優(yōu)點(diǎn)，因此越來越受到研究工作者們的關(guān)注。這種臍帶組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞不僅保持了間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性，而且還具備如下優(yōu)點(diǎn)：①臍帶中的干細(xì)胞更原始，有更強(qiáng)的增殖分化能力。②這些干細(xì)胞較為幼稚，功能活性低，不會(huì)觸發(fā)免疫反應(yīng)或引起移植物抗宿主反應(yīng)。③干細(xì)胞易于分離，純度高，無腫瘤細(xì)胞污染。④擴(kuò)增時(shí)培養(yǎng)體系能統(tǒng)一，便于質(zhì)控。⑤可制成種子細(xì)胞冷凍，多次使用，冷凍后細(xì)胞損失小。⑥潛伏性病毒和病原微生物的感染及傳播幾率比較低。⑦采集時(shí)對(duì)產(chǎn)婦及新生兒無任何危害及損傷。⑧采集方便，易于保存和運(yùn)輸，且無倫理問題。這種臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞有可能成為胚胎干細(xì)胞(ESC)和誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPS)的理想替代物，并具有更大的應(yīng)用潛能。鑒于間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能、能支持造血和促進(jìn)造血干細(xì)胞植入、調(diào)節(jié)免疫以及分離培養(yǎng)操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，正日益受到人們的關(guān)注。隨著間充質(zhì)干細(xì)胞及其相關(guān)技術(shù)的日益成熟，臨床研究已經(jīng)在許多國家開展。但至今尚不清楚這些間充質(zhì)干細(xì)胞是否能直接轉(zhuǎn)分化為造血干細(xì)胞(HSCs)、紅母細(xì)胞(Erythroblast,EBCs)，繼而發(fā)育成成熟的紅細(xì)胞(Redbloodcells,RBCs)。紅細(xì)胞是血液的重要成分，是人的生命之源，然而，血液很難儲(chǔ)存，而且經(jīng)常供應(yīng)短缺，有時(shí)還會(huì)給人們帶來致命的傳染病。據(jù)“中新網(wǎng)”消息，至2015年，我國每天需要約12萬人獻(xiàn)血才能滿足用血量。巨大的用血與獻(xiàn)血缺口使得有專家建議，或應(yīng)將我國《獻(xiàn)血法》規(guī) 定的獻(xiàn)血年齡由18～55歲放寬至17～60歲。因此，在實(shí)驗(yàn)室中研制出和在公司中生產(chǎn)出人造血變得比以前更為迫切和需要。2008年美國“先進(jìn)細(xì)胞科技”公司首席科學(xué)家羅伯特·蘭扎說：“血液供應(yīng)不足對(duì)大量失血的患者將產(chǎn)生致命的后果，而胚胎干細(xì)胞可能成為一個(gè)可以無限繁衍細(xì)胞的新源頭，使人類的醫(yī)療得到源源不絕的紅血球供應(yīng)。”他們誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞在10天后發(fā)育分化為造血干細(xì)胞，接著用15天到20天變?yōu)橄掠蔚募t母細(xì)胞與紅細(xì)胞，大多數(shù)胚胎干細(xì)胞能夠發(fā)育成造血細(xì)胞，其中只有65％的能分化為紅細(xì)胞，最重要的是大多數(shù)紅細(xì)胞只能合成胚胎樣的血紅蛋白(Changetal,2008；Changetal,2011)，只有大約60％的細(xì)胞能夠脫核成熟(Ltetal，2008)。2011年愛丁堡大學(xué)和布里斯托大學(xué)的教授馬克·特納表示利用胚胎干細(xì)胞制造出陰性O(shè)型血，這樣的人造血液不容易感染，可以給98％的人口進(jìn)行輸血。安全人造血液的產(chǎn)生意義重大，將會(huì)給戰(zhàn)場(chǎng)傷員和需要接受心臟移植等大手術(shù)的病人以及產(chǎn)后大出血的產(chǎn)婦帶來生命保障。馬克教授指出，在大約兩年的時(shí)間內(nèi)，他就將把人造血液注射進(jìn)健康的人體內(nèi)，完成英國首例人工血液試驗(yàn)。隨后，人造血液就投入工業(yè)化的大批量生產(chǎn)，預(yù)計(jì)10年內(nèi)可能即將普及到日常應(yīng)用中。20年內(nèi)，每年的人造血液產(chǎn)量可達(dá)到200萬品脫(合約95萬升)，足夠滿足英國全部的醫(yī)用需求。最近世界上幾個(gè)研究小組采用成年人皮膚的成纖維細(xì)胞或者血細(xì)胞經(jīng)過導(dǎo)入能表達(dá)OCT4,NANOG,LIN28,andSOX的慢病毒誘導(dǎo)成干細(xì)胞，叫做“誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞(iPS)”。之后這些iPS細(xì)胞在模擬人體生物條件下進(jìn)行培育，最終分化發(fā)育成血紅細(xì)胞，但大多數(shù)紅細(xì)胞只能合成胚胎樣的血紅蛋白(Changetal,2010；Papapetrotetal,2011)。目前該技術(shù)增大了轉(zhuǎn)變過程的有效性，但并不是所有細(xì)胞都能成為血紅細(xì)胞。最大的問題是只有10-40％的紅細(xì)胞能排核成熟(Lapillonneetal,2010)。愛丁堡大學(xué)一支研究小組需用一個(gè)多月的時(shí)間，使iPS細(xì)胞來源的人造血液成功率達(dá)到五成。血紅細(xì)胞在離心器中可與其它剩余細(xì)胞相分離，下一步將于2016年對(duì)臨床患者測(cè)試人造血液。這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)最有可能先用地中海貧血癥患者進(jìn)行測(cè)試，因?yàn)檫@些患者需要定期輸血。近年來，世界上多個(gè)發(fā)達(dá)國家都在尋找新的血源，最為看好的是使用人干細(xì)胞來體外造血。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為紅母細(xì)胞的方法。該方法解決了現(xiàn)有人工造血技術(shù)中能合成成體血紅蛋白和能脫核的紅母細(xì)胞產(chǎn)生困難(如胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞)、數(shù)量限制(不能獲得臨床級(jí)的成熟紅細(xì)胞)、 定向分化(分化成較高比例的其它類型的血細(xì)胞)效率低的技術(shù)瓶徑問題。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為紅母細(xì)胞的方法，其包括下列步驟：S1，分離和純化均質(zhì)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；S2，選取可用于干細(xì)胞表觀遺傳調(diào)控的小RNA分子；S3，小核酸多肽納米粒的制備和細(xì)胞轉(zhuǎn)染；S4，轉(zhuǎn)染后的紅母細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)。其中，步驟S1中加入趨化液，所述的趨化液是指在無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中添加的間充質(zhì)干細(xì)胞從臍帶組織內(nèi)向臍帶組織外的培養(yǎng)環(huán)境遷移的趨化分子，優(yōu)選SDF-1/CXCL12、HGF、EGF、bFGF、PDGF-BB和IGF-1六種細(xì)胞趨化因子。步驟S2中所述的小RNA分子為多種，所述的多種小RNA分子包括ANTI-181b，ANTI-155，ANTI-10b，ANTI-24,ANTI-221和siR-EID3分子的序列。所述的多種小RNA分子組合的比例為：ANTI-181b，ANTI-155，ANTI-10b，ANTI-24,ANTI-221和siR-EID3干粉重量比為0.5:0.5:0.5:1:1:1.5。步驟S3中小核酸多肽納米粒的制備方法為：將步驟S2中1份干粉量的多種小RNA分子的組合混合物與50份干粉量的多肽轉(zhuǎn)染試劑分別溶于醫(yī)用級(jí)去離子水中，然后在攪拌狀態(tài)下將多肽轉(zhuǎn)染試劑溶液緩慢滴加至多種小RNA混合物溶液中，繼續(xù)攪拌使小RNA活性成分與多肽轉(zhuǎn)染試劑充分混合，靜置20分鐘，讓其充分自組裝成納米顆粒。所述的細(xì)胞轉(zhuǎn)染，即小核酸多肽納米粒轉(zhuǎn)染臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方式為第一天消化轉(zhuǎn)染一次，第二天非消化轉(zhuǎn)染一次。步驟4包括步驟S41和S42，其中，S41，制備誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化擴(kuò)增培養(yǎng)基；S42，激活多種指導(dǎo)紅母細(xì)胞發(fā)育和分化的相關(guān)基因。所述的轉(zhuǎn)染后的紅母細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)是指在紅母細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)基中以5×105/ml的細(xì)胞密度進(jìn)行培養(yǎng)至少5-7天來實(shí)現(xiàn)的。所述的擴(kuò)增培養(yǎng)基是指在無血清的高糖DMEM/F12培養(yǎng)基中添加bFGF,shh，SCF，TPO，VEGF,Flt3L，Delta1，IGFBP，EPO，IGF-1,IL-3,GM-CSF，IL-6,LIF，TGF-β,dmPGE2,dexamethasone,和lenalidomide十八種分子制成的。所述的擴(kuò)增培養(yǎng)基配方包括0-1μg/mlbFGF，0-1μg/mlSonichedgehog，0-1μg/mlDelta1，0-1μg/mlIGF-1，0-1μg/mlIGFBP，0-1μg/mlSCF，0-1μg/mlIL-3，0-1μg/mlIL-6,0-1μg/mlGM-CSF,0-1μg/mlFlt3L,0-1μg/mlEPO，0-1μg/mlTPO，0-1 μg/mlVEGF，0-1μg/mlLIF，0-1μg/mlTGF-β，0-100μMdmPGE2，0-100μMdexamethasone和0-100μMlenalidomide。所述的激活多種紅母細(xì)胞發(fā)育和分化的相關(guān)的基因包括Runx1,Tal1,Gata1,NFE2,PU.1,Gfi1B,State5,Fog1,DNMT3b，BMI1，CHD8，EKLF,BCL11A,Fop,Sox1,Klf1,FOXO,NFkB,JAK2,GAB1/2,ERB1/2,LYN,EPO-R,IGF1-R,IL3-R,c-kit-R,AKT和Mill。一種間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為紅母細(xì)胞的誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)基試劑盒，所述的試劑盒包括紅母細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)基，所述紅母細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)基包括紅母細(xì)胞增殖所需要的細(xì)胞增殖因子和其他血細(xì)胞分化抑制劑；所述紅母細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)基的配方為：80-100％(v/v)的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，0-1μg/mlbFGF、0-1μg/mlSonichedgehog、0-1μg/mlDelta1、0-1μg/mlIGF-1、0-1μg/mlIGFBP、0-1μg/mlSCF、0-1μg/mlIL-3、0-1μg/mlIL-6、0-1μg/mlGM-CSF、0-1μg/mlFlt3L、0-1μg/mlTPO、0-5μg/mlEPO、0-1μg/mlVEGF、0-1μg/mlLIF、0-1μg/mlTGF-β、0-100μMdmPGE2、0-100μMdexamethasone和0-100μMlenalidomide以及miR-146、miR-181a和miR-10以及anti-221和anti-23。通過上述本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明使用容易獲取、來源充足、無道德倫理問題和安全有效的新生兒臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞作為誘導(dǎo)對(duì)象，通過轉(zhuǎn)染6個(gè)小RNAs分子，在一種特制的無血清培養(yǎng)基的作用下大規(guī)模并快速直接轉(zhuǎn)分化成紅母細(xì)胞，解決了現(xiàn)有人工造血技術(shù)中紅母細(xì)胞的來源、數(shù)量限制和定向分化的技術(shù)瓶徑問題。附圖說明圖1為本發(fā)明的誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為紅母細(xì)胞的方法的流程框圖；圖2是人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)(A和B)和表面特征性抗原，(C)流式細(xì)胞儀分析顯示人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是CD29,CD44,CD90,CD105,CD73和CD166陽性的,CD33,CD38,CD31和CD45陰性的；圖3是ANTI-181b，ANTI-155，ANTI-10b，ANTI-24,ANTI-221，和siR-EID3的分子結(jié)構(gòu)以及與相應(yīng)靶基因序列的排比配對(duì)；圖4是不同的小RNA分子能夠有效地沉默它們的靶基因，從而導(dǎo)致相應(yīng)下游關(guān)鍵基因的高表達(dá)；圖5是人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成原紅細(xì)胞的集落形成和細(xì)胞形態(tài)的照片；圖6是臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成紅母細(xì)胞的各種表面特征標(biāo)志和這些標(biāo)志物各自所占的百分比；圖7是轉(zhuǎn)分化后的紅母細(xì)胞的爆發(fā)性集落和一般集落的形態(tài)；圖8是qPCR電泳分析比較人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，和轉(zhuǎn)染不同小RNA分子后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中的紅細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)差異；圖9紅母細(xì)胞在小鼠體內(nèi)能夠進(jìn)一步分化成表達(dá)CD235分子標(biāo)志物的成熟紅細(xì)胞。UC-MSC，是人體臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞組；CB-EPC,是人體臍血紅母細(xì)胞組；UC-EPC,是人體臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的紅母細(xì)胞組。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明：如圖1所示，一種誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為紅母細(xì)胞的方法，其包括下列步驟：S1，分離和純化均質(zhì)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；S2，選取可用于干細(xì)胞表觀遺傳調(diào)控的小RNA分子；S3，小核酸多肽納米粒的制備和細(xì)胞轉(zhuǎn)染；S4，轉(zhuǎn)染后的紅母細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)。其中，步驟S1中加入趨化液，所述的趨化液是指在無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中添加的間充質(zhì)干細(xì)胞從臍帶組織內(nèi)向臍帶組織外的培養(yǎng)環(huán)境遷移的趨化SDF-1/CXCL12、HGF、EGF、bFGF、PDGF-BB和IGF-1六種細(xì)胞趨化因子。步驟S2中所述的小RNA分子為多種，所述的多種小RNA分子包括ANTI-181b，ANTI-155，ANTI-10b，ANTI-24,ANTI-221和siR-EID3分子的序列。所述的多種小RNA分子組合的比例為：ANTI-181b，ANTI-155，ANTI-10b，ANTI-24,ANTI-221和siR-EID3干粉重量比為0.5:0.5:0.5:1:1:1.5。步驟S3中小核酸多肽納米粒的制備方法為：將步驟S2中1份干粉量的多種小RNA分子的組合混合物與50份干粉量的多肽轉(zhuǎn)染試劑分別溶于醫(yī)用級(jí)去離子水中，然后在攪拌狀態(tài)下將多肽轉(zhuǎn)染試劑溶液緩慢滴加至多種小RNA混合物溶液中，繼續(xù)攪拌使小RNA活性成分與多肽轉(zhuǎn)染試劑充分混合，靜置20分鐘，讓其充分自組裝成納米顆粒。所述的細(xì)胞轉(zhuǎn)染，即小核酸多肽納米粒轉(zhuǎn)染臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方式為第一天消化轉(zhuǎn)染一次，第一天非消化轉(zhuǎn)染一次。多肽納米粒的制備(即組裝)是指不同的小RNA分子與多肽轉(zhuǎn)染試劑按有關(guān)配比、程序和時(shí)間的配制過程，通過第一天的消化轉(zhuǎn)染和第二天的非消化轉(zhuǎn)染以達(dá)到最佳的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化效率。步驟4包括步驟S41和S42，其中，S41，制備誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化擴(kuò)增培養(yǎng)基；S42，激活多種指導(dǎo)紅母細(xì)胞發(fā)育和分化的相關(guān)基因。所述的轉(zhuǎn)染后的紅母細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)是指在紅母細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)基中以5×105/ml的細(xì)胞密度進(jìn)行培養(yǎng)至少5-7天來實(shí)現(xiàn)的。作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述的轉(zhuǎn)染后(即轉(zhuǎn)分化后)的紅母細(xì)胞培養(yǎng)是指在紅母細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)基中以5×105/ml的細(xì)胞密度進(jìn)行培養(yǎng)至少4-6天。所述的擴(kuò)增培養(yǎng)基是指在無血清的高糖DMEM/F12培養(yǎng)基中添加bFGF,shh，SCF，TPO，VEGF,Flt3L，Delta1，IGFBP，EPO，IGF-1,IL-3,GM-CSF，IL-6,LIF，TGF-β,dmPGE2,dexamethasone,和lenalidomide十八種分子制成的。所述的擴(kuò)增培養(yǎng)基配方包括0-1μg/mlbFGF，0-1μg/mlSonichedgehog，0-1μg/mlDelta1，0-1μg/mlIGF-1，0-1μg/mlIGFBP，0-1μg/mlSCF，0-1μg/mlIL-3，0-1μg/mlIL-6,0-1μg/mlGM-CSF,0-1μg/mlFlt3L,0-1μg/mlEPO，0-1μg/mlTPO，0-1μg/mlVEGF，0-1μg/mlLIF，0-1μg/mlTGF-β，0-100μMdmPGE2，0-100μMdexamethasone和0-100μMlenalidomide。所述的激活多種紅母細(xì)胞發(fā)育和分化的相關(guān)的基因包括Runx1,Tal1,Gata1,NFE2,PU.1,Gfi1B,State5,Fog1,DNMT3b，BMI1，CHD8，EKLF,BCL11A,Fop,Sox1,Klf1,FOXO,NFkB,JAK2,GAB1/2,ERB1/2,LYN,EPO-R,IGF1-R,IL3-R,c-kit-R,AKT和Mill。一種間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為紅母細(xì)胞的誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)基試劑盒，所述的試劑盒包括紅母細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)基，所述紅母細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)基包括紅母細(xì)胞增殖所需要的細(xì)胞增殖因子和其他血細(xì)胞分化抑制劑；所述紅母細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)基的配方為：80-100％(v/v)的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，0-1μg/mlbFGF、0-1μg/mlSonichedgehog、0-1μg/mlDelta1、0-1μg/mlIGF-1、0-1μg/mlIGFBP、0-1μg/mlSCF、0-1μg/mlIL-3、0-1μg/mlIL-6、0-1μg/mlGM-CSF、0-1μg/mlFlt3L、0-1μg/mlTPO、0-5μg/mlEPO、0-1μg/mlVEGF、0-1μg/mlLIF、0-1μg/mlTGF-β、0-100μMdmPGE2、0-100μMdexamethasone和0-100μMlenalidomide以及miR-146、miR-181a和miR-10以及anti-221和anti-23間充干細(xì)胞培養(yǎng)基配方可制造成不同的培養(yǎng)試劑盒，其中包括不同間充質(zhì)干細(xì)胞(如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞)增殖所需要的細(xì)胞增殖因子、細(xì)胞分化抑制劑。紅母細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)基配方可制造成不同的培養(yǎng)試劑盒，其中包括紅母細(xì)胞增殖所需要的細(xì)胞增殖因子、細(xì)胞分化抑制劑。具體配方成分見表1。使用本發(fā)明的方法獲得的誘導(dǎo)紅母細(xì)胞，可用于血液病如地中海貧血和紅細(xì)胞缺少癥等的治療以及人工血液制品的生產(chǎn)。具體詳盡的技術(shù)方案描述如下：步驟1.間充質(zhì)干細(xì)胞分離、純化和擴(kuò)增臍帶的獲取在捐獻(xiàn)者同意的前提下進(jìn)行的。由于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞能高表達(dá)6種細(xì)胞因子的受體基因如CXCR4、IGF1R、HGFR、bFGFR、EGFR和PDGFR,并在細(xì)胞膜上呈現(xiàn)相關(guān)的受體蛋白，為了獲得最大量的活力優(yōu)質(zhì)的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs)，同時(shí)盡可能避免其它細(xì)胞的混入以及酶消化對(duì)細(xì)胞的損傷(尤其在膠原酶和透明質(zhì)酸酶聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，有可能造成細(xì)胞外膜的破壞，使分離的MSC不能貼壁。酶消化法獲得的細(xì)胞，除MSC外還含有其他類型的細(xì)胞)，本發(fā)明公開了一種新的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的采集、分離純化和擴(kuò)增培養(yǎng)的方法，具體方案如下：1)無菌條件下用消毒的鑷子從臍帶運(yùn)輸瓶中將臍帶取出置于無菌的培養(yǎng)皿中，在含有雙抗的PBS溶液中清洗2-3遍，用剪刀將臍帶等分成3cm長，再將臍帶管切開，取出大血管，剝出里面的華氏膠組織，用利剪將大塊的臍帶分成1-3mm見方的臍帶組織塊；2)，以低強(qiáng)度脈沖式超聲波處理臍帶組織塊10-20min，使臍帶間質(zhì)變得更為松散；3)用0.5％多聚賴氨酸預(yù)處理的100mm培養(yǎng)皿底表面，待其干后再讓其吸附多種間充質(zhì)干細(xì)胞的趨化因子的混合物，如用100ul的DMEM/F12培養(yǎng)基將20ng/mlSDF-1,10ng/mlHGF，10ng/mlbFGF,10ng/mlPDGF-BB，10ng/mlIGF-1和10ng/mlEGF混合均勻，滴加到多聚賴氨酸培養(yǎng)皿中形成誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞從臍帶中向培養(yǎng)基質(zhì)遷移的趨化層，再培養(yǎng)箱中放置30分鐘固型；4)按每個(gè)用多聚賴氨酸和趨化因子預(yù)處理的100mm培養(yǎng)皿中放置20-50個(gè)1-3mm見方的臍帶組織塊，再加入5mL無血清的高糖DMEM/F12培養(yǎng)基含100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素。置于37℃、5％的CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，臍帶組織培養(yǎng)5-7天后，可見有許多間充質(zhì)干細(xì)胞從組織塊周圍爬出，形態(tài)呈細(xì)小的梭形，細(xì)胞開始迅速增殖。10天后棄殘存的組織，換細(xì)胞培養(yǎng)液含有5-10％FBS和0.1-0.5ng/mlTGF-beta的高糖DMEM/F12培養(yǎng)基。培養(yǎng)期間可用相差顯微鏡觀察UC-MSCs逐漸從臍帶組織塊中遷移出來，在培養(yǎng)瓶中形成一層貼壁的均質(zhì)細(xì)胞群(圖2A)。從1cm長的臍帶中大約能獲得5-6萬個(gè)純凈的間充質(zhì)干細(xì)胞，而沒有其它種類的雜細(xì)胞如血管內(nèi)皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞等污染。相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)特征及增殖情況，以后每48h按30-50％換液1次。待細(xì)胞融合超過培養(yǎng)瓶底80-90％時(shí)，用0.25％胰蛋白酶消化傳代和檢測(cè)。總之，貼壁法操作簡(jiǎn)單，且傳代后的細(xì)胞形態(tài)及增殖活性更為穩(wěn)定。人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定：取第3或4代細(xì)胞以0.25％胰酶(含0.02％乙二胺四乙酸)消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，1000r/min離心5min，去上清，用PBS洗滌后重復(fù)再次離心、重懸。然后用體積分?jǐn)?shù)95％乙醇固定，分別加入FITC標(biāo)記的單抗如CD29、CD166、CD73、CD44、CD45、CD90、CD105和HLA-ABC等，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)。流式細(xì) 胞術(shù)分析研究發(fā)現(xiàn)UC-MSCs主要表達(dá)CD44、CD73、CD90、CD166、CD29、CD49e和HLA-ABC，而不表達(dá)CD34、CD45、CD14、CD33、和CD38(圖2B)。分析結(jié)果表明本發(fā)明提供的方法能夠分離純化出高質(zhì)量和高純度的間充質(zhì)干細(xì)胞，上述特征性標(biāo)志物的陽性率高達(dá)99.5％。這個(gè)結(jié)果和其他的MSCs幾乎一致。步驟2.miRNAs序列、結(jié)構(gòu)和合成通過生物信息學(xué)技術(shù)和相關(guān)的預(yù)測(cè)軟件以及大量的生物學(xué)篩選試驗(yàn)，最終我們篩選和鑒定了6個(gè)與紅母細(xì)胞的發(fā)生有關(guān)sRNAs，它們的核苷酸序列和相應(yīng)靶基因的核苷酸序列排比如圖3所示。根據(jù)它們的核苷酸序列，分別設(shè)計(jì)了相應(yīng)的反義核酸小RNA分子，這些小核酸分子是誘導(dǎo)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的關(guān)鍵活性分子。第一個(gè)sRNA是miR-10b,它的反義核酸小RNA分子是ANTI-10b，其序列如下：ANTI-10b:5’-CACAAAUUCGGUUCUACAGGGUA-3’第二個(gè)是miRNA-155,它的反義核酸小RNA分子是ANTI-155，其序列如下：ANTI-155:5’-ACCCCUAUCACGAUUAGCAUUAA-3’第三個(gè)是miRNA-181B,它的反義核酸小RNA分子是ANTI-181B,其序列如下：ANTI-181B:5’-ACCCACCGACAGCAAUGAAUGUU-3’第四個(gè)是miRNA-24,它的反義核酸小RNA分子是ANTI-24,其序列如下：ANTI-24：5’-CUGUUCCUGCUGAACUGAGCCA-3’第五個(gè)是miRNA-221,它的反義核酸小RNA分子是ANTI-221,其序列如下：ANTI-221:5'-AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC-3'第六個(gè)是siRNA-EID3,其序列如下：5'-UCAGACAUUGUUUUACUGUGCTT-3'3'-TTAGUCUGUGGCAAAGUGACACG-5'這些miRNAs和反義核苷酸都可以通過化學(xué)合成的方法獲得，為了加強(qiáng)穩(wěn)定性這些小RNA的組成單體可進(jìn)行全部或部分不同的化學(xué)修飾，如甲氧或乙氧修飾。本發(fā)明中的miRNAs活性成分的制備方法如下：將上述6種不同的核苷酸單體經(jīng)RNA/DNA合成儀按特定的設(shè)計(jì)序列合成6種不同的小RNA單鏈，這些小RNA單鏈序列如上所示。合成好的小RNA單鏈再經(jīng)過分離純化除去其它成分，第六種小RNA單鏈進(jìn)行退火形成1個(gè)特征的sRNAs雙體，前5種均為單鏈。將這6種sRNA分子冷凍濃縮成干粉作為配方中的小核酸活性成分，在低溫下保存，干粉包括ANTI-10b,ANTI-181b，ANTI-155,ANTI-221,ANTI-24和siR-EID3,這些ANTIsRNAs均能與相應(yīng)的靶子miRNAs(如miR-10b，miR-181b，miR-155，miR-221和miR-24)的核苷酸序列相識(shí)別和結(jié) 合。同樣siR-EID3亦能與其靶基因EID3的核苷酸序列相識(shí)別和結(jié)合。所以，將它們轉(zhuǎn)染進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，48小時(shí)后用qPCR分析，結(jié)果顯示這些小RNA分子(包括siR-EID3)均能有效的下調(diào)它們的靶序列(圖4A)。利用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了不同小RNA分子(miR-136,miR-128,miR-218,siR-EID3)對(duì)靶基因EID3的抑制作用(圖4B)。這些小RNA的作用分別導(dǎo)致了相應(yīng)下游基因，如HOXA1,BCL2,SPI1，Kit，ACVR1B，CBP/P300表達(dá)增加(圖4C),最終誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為紅母細(xì)胞。為了加強(qiáng)小RNA的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化效應(yīng)，我們采用了這6種小RNA(sRNA)的結(jié)合戰(zhàn)略，最終的小核酸活性成分是在ANTI-181b，ANTI-155，ANTI-10b，ANTI-24,ANTI-221，和siR-EID3合成后根據(jù)干粉重量的0.5：0.5：0.5：1：1:1.5比例要求加以混合配制。步驟3.小核酸多肽納米粒的制備和細(xì)胞轉(zhuǎn)染分別將上述小核酸活性成分的混合物和轉(zhuǎn)染試劑如透皮穿膜肽/脂質(zhì)體Lipofectamine2000(從北京吉利奧生物技術(shù)發(fā)展有限公司或Lifetechnologies公司購買)分別溶解在醫(yī)用級(jí)去離子水中，混合均勻10min,根據(jù)核酸與多肽的重量百分比：即1：10到1：100，在攪拌狀態(tài)下再將小核酸活性成分的溶液緩慢滴加透皮穿膜肽的溶液中,繼續(xù)攪拌使小核酸活性成分和透皮穿膜肽能充分混合，靜止20分鐘，讓其充分自組裝成納米顆粒。同時(shí)，可用胰酶將2X106貼壁的臍帶間充干細(xì)胞消化離散，用舊培養(yǎng)基終止消化，PBS清洗2-3遍，用5ml的無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮，繼而加入上述的轉(zhuǎn)染納米顆粒，充分混勻后植入培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，6到8小時(shí)后加入含有多種細(xì)胞因子的無血清DMEM/F12培養(yǎng)液(表1)，第二天再次在培養(yǎng)板中加入上述轉(zhuǎn)染劑，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)5-6天，用于FACS檢測(cè)。表1.紅母細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增用培養(yǎng)基配方成分含量DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基80-100％(v/v)Sonichedgehog(shh)0-1μg/mlDelta10-1μg/mlbFGF0-1μg/mlIGFBP0-1μg/mlSCF0-1μg/mlEPO0-1μg/mlTPO0-1μg/mlIGF-10-1μg/mlLIF0-1μg/mlTGF-β0-1μg/mldmPGE20-100μMIL-30-1μg/mlFlt3L0-1μg/mlVEGF0-1μg/mldexamethasone,0-100μMlenalidomide0-100μMAnti-240-100nMAnti-10b0-100nMAnti-2210-100nMAnti-181b0-100nMAnti-1550-100nMsiR-EID30-100nM為了大大提高小RNA誘導(dǎo)人間質(zhì)干細(xì)胞向紅母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的效率，本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)化了具體的誘導(dǎo)方案，這里公開的8種誘導(dǎo)配方見表2。從中可見方案4中的第二種誘導(dǎo)配方的效率最高，即通過每天一次共二次轉(zhuǎn)染，能使90％以上的人間質(zhì)干細(xì)胞在6天中轉(zhuǎn)分化成紅母細(xì)胞。比我們?cè)瓉淼恼T導(dǎo)方法大為改進(jìn)，使通過此技術(shù)能快速獲得臨床級(jí)的紅母細(xì)胞成為可能。進(jìn)一步將可用于各種貧血的治療和工業(yè)化制造血液。表2.3X106人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞向紅母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的誘導(dǎo)方案步驟4.小核酸-多肽納米粒誘導(dǎo)間質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成紅母細(xì)胞用小RNA混合物(包括ANTI-181a,ANTI-24,ANTI-10b,siR-EID3以及ANTI-221和ANTI-155)轉(zhuǎn)染消化離散后的人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞1天后，第二天再繼續(xù)貼壁轉(zhuǎn)染1次，轉(zhuǎn)然后絕大部分(》90％)細(xì)胞變成圓形的懸浮的細(xì)胞，再培養(yǎng)3天這些懸浮的細(xì)胞就顯示出原紅細(xì)胞的形態(tài)特征，如在1％甲基纖維素上培養(yǎng)5-7天可形成原紅細(xì)胞的集落(圖5)。在紅母細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)基中(配方見表1)以2X106/ml細(xì)胞密度于3-5L的生物反應(yīng)器中,在3％氧，5％二氧化碳，和92％氮，pH為7.1-7.3,攪拌器轉(zhuǎn)速為30-60轉(zhuǎn)/分的條件下培養(yǎng)3天，這些懸浮的細(xì)胞丟失了間充質(zhì)干細(xì)胞的特征性抗原(如CD44、CD73、CD105、CD166、CD29、CD90、Flk-1)和同時(shí)獲得了紅母細(xì)胞的表面抗原(如CD34、CD235、CD71、CD38、CD45和CD36)(圖6)。并得到快速的擴(kuò)增。對(duì)這些轉(zhuǎn)化后的紅母細(xì)胞進(jìn)行FACS雙抗標(biāo)記分析，結(jié)果顯示這些紅母細(xì)胞中，80％的細(xì)胞表達(dá)CMP祖細(xì)胞和CEMP紅母細(xì)胞的表面標(biāo)志性抗原如CD36、CD38、CD71、CD235、CD45、和CD34，只有大約20％的細(xì)胞表達(dá)長期造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志性抗原如CD105和CD90(圖6)。步驟5.轉(zhuǎn)分化的紅母細(xì)胞在體外能形成B-CFU和E-CFU。為了明確證實(shí)這些轉(zhuǎn)化的單一細(xì)胞通過培養(yǎng)能夠自我更新，將轉(zhuǎn)染過的單一干細(xì)胞分離出來再接種到涂有1％甲基纖維素的24孔培養(yǎng)板(購于Corning公司)的中，并向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)紅母細(xì)胞細(xì)胞擴(kuò)增的細(xì)胞因子和其它必需成分(配方見表1)，培養(yǎng)條件為37℃和5％CO2，這是本發(fā)明首次公開的紅母細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)基的配方。第15日在顯微鏡下觀察，可以看到有B-CFU和E-CFU細(xì)胞集落的形成(圖7)。該方法較目前廣泛使用的紅母細(xì)胞集落培養(yǎng)方法更有效更快速。目前通常使用的培養(yǎng)方法容易導(dǎo)致向其他造血細(xì)胞的分化，如粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板、NK細(xì)胞，樹突細(xì)胞等，和較低的擴(kuò)增倍數(shù)。步驟6.轉(zhuǎn)分化的紅母細(xì)胞能高表達(dá)一些紅細(xì)胞的特征基因用RT-PCR方法對(duì)這些轉(zhuǎn)化的紅母細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)它們能高表達(dá)許多與紅細(xì)胞發(fā)育有關(guān)的重要基因如Runx1,Tal1,Gata1,NFE2,Gfi1B,State5,Fog1,DNMT3b，BMI1，CHD8，EKLF,FOXO,NFkB,JAK2,GAB1/2,LYN,EPO-R,AKT,和Mill。從而使它們?cè)诨虮磉_(dá)方面更加相似于自然發(fā)生的紅母細(xì)胞，而不同于它們來自的間充質(zhì)干細(xì)胞(圖8)。這些調(diào)控紅母細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵基因的激活使間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成紅母細(xì)胞成為現(xiàn)實(shí)。步驟7.移植實(shí)驗(yàn)表明這些轉(zhuǎn)化的紅母細(xì)胞能夠在小鼠體內(nèi)發(fā)育成成熟的紅細(xì)胞將轉(zhuǎn)染有小RNA分子的臍帶間質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)5天后，分別移植到經(jīng)臨界致死劑量的 放射處理的免疫缺陷的小鼠體內(nèi)。4周后能夠檢測(cè)到由臍帶間質(zhì)干細(xì)胞分化成的紅細(xì)胞。利用抗人源性單克隆抗體對(duì)鼠的有關(guān)組織進(jìn)行FACS分析，發(fā)現(xiàn)在經(jīng)臨界致死輻射劑量的放射處理的小鼠的骨髓、肝臟和脾臟中能夠檢測(cè)到人紅細(xì)胞基因標(biāo)志分子的表達(dá)，這些紅母細(xì)胞能夠進(jìn)一步分化成以特征表達(dá)CD235分子標(biāo)志物的紅細(xì)胞(圖9)。由于采用了上述技術(shù)方案，一種能夠大規(guī)模并快速高純度地誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成紅母細(xì)胞的方法，包括下列步驟：1)分離和純化了均質(zhì)的間充質(zhì)干細(xì)胞的趨化液；2)精選了多種可用于干細(xì)胞表觀遺傳調(diào)控的小RNA分子；3)采用了核酸多肽納米粒的高效傳遞系統(tǒng)和優(yōu)化了干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)化效率；4)創(chuàng)制了高效的誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化擴(kuò)增培養(yǎng)基；5)激活了多種指導(dǎo)紅母細(xì)胞發(fā)育和分化的相關(guān)基因，解決了現(xiàn)有人工造血技術(shù)中紅母細(xì)胞的來源、數(shù)量限制和定向分化的技術(shù)瓶徑問題。本發(fā)明的方法提供了一些內(nèi)源性miRNAs及其它們的衍生物，他們分別針對(duì)不同的靶mRNAs和miRNAs，從而調(diào)節(jié)它們的表達(dá)水平，最終改變?cè)燃?xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)類型和細(xì)胞形態(tài)及標(biāo)志物的類型，使這些間充質(zhì)干細(xì)胞獲得了向紅母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的潛能，在一組優(yōu)化的誘導(dǎo)因子的作用下，產(chǎn)生了一種全新的紅母細(xì)胞群。這種方法具有高的多的轉(zhuǎn)化效率，比我們?cè)葘＠薪榻B的方法提高了8-10倍(如從間充質(zhì)來源的造血干細(xì)胞進(jìn)一步分化成紅母細(xì)胞的方法)，使臨床應(yīng)用成為可能。消化轉(zhuǎn)染方法有效解決了高效將小RNA轉(zhuǎn)染進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的瓶頸問題，有效防止了造血干細(xì)胞擴(kuò)增中極易分化為下游其它血細(xì)胞(粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，血小板等)的事態(tài)發(fā)生，高效地激活了與紅母細(xì)胞發(fā)生有關(guān)的多種基因。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下的有益效果：1、能夠大規(guī)模(1-3X109-12細(xì)胞)并快速(5-7天)地誘導(dǎo)期待間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成紅母細(xì)胞。解決了現(xiàn)有誘導(dǎo)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化技術(shù)中轉(zhuǎn)化率不高、需要時(shí)間長和轉(zhuǎn)化后紅母細(xì)胞數(shù)量少和純度低的技術(shù)瓶徑問題。2、轉(zhuǎn)分化后的紅母細(xì)胞與人體中天然產(chǎn)生的紅母細(xì)胞一樣，具有增殖和分化為成熟紅細(xì)胞的潛能，可用于人體紅系再障或其它原因的紅細(xì)胞發(fā)育障礙如地中海貧血治療。使用本發(fā)明的方法獲得的紅母細(xì)胞還可進(jìn)一步的大規(guī)模分化為成熟的紅細(xì)胞作為人造血液，用于輸血手術(shù)方面，從而彌補(bǔ)長期以來血庫的血液存量不足的問題。本發(fā)明通過體外多次試驗(yàn)研究和反復(fù)的檢測(cè)論證，證明了本發(fā)明在誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向紅母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化方面有著比目前在研的同類技術(shù)更好的效果。進(jìn)一步的，對(duì)附圖做更詳盡的說明如下：圖2是人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)和鑒定。流式細(xì)胞儀分析顯示人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的表面特征性抗原是CD29,CD44,CD90,CD105,CD73和CD166陽性的,CD33,CD38,CD31 和CD45陰性的。圖3是不同小RNA分子的核苷酸序列和它們相應(yīng)靶基因的核苷酸序列的結(jié)構(gòu)和排比配對(duì)。圖4是不同的ANTI-RNA分子能夠有效地沉默它們的靶子miRNA基因,從而導(dǎo)致下游的關(guān)鍵基因的高表達(dá)。圖5是人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成原紅細(xì)胞的集落和細(xì)胞形態(tài)；圖6是臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成紅母細(xì)胞的表面特征性標(biāo)志和它們各自所占的百分比；圖7是轉(zhuǎn)分化后的紅母細(xì)胞的爆發(fā)性集落和一般集落的形態(tài)；圖8是qPCR電泳分析比較人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，和轉(zhuǎn)染不同小RNA分子后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中的紅細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)差異；圖9紅母細(xì)胞在小鼠體內(nèi)能夠進(jìn)一步分化成表達(dá)CD235分子標(biāo)志物的成熟紅細(xì)胞。UC-MSC，是人體臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞組；CB-EPC,是人體臍血紅母細(xì)胞組；UC-EPC,是人體臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的紅母細(xì)胞組。以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁1 2 3