本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言，涉及間充質(zhì)干細胞聯(lián)合維生素E在制備用于腎臟組織細胞修復(fù)藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
急性腎衰竭是臨床的常見重大疾病，是指由各種原因引起的腎臟功能在短期內(nèi)急劇降低，腎小球過濾迅速下降至正常的50％，血尿素氮及血肌酐迅速增高，導(dǎo)致體內(nèi)代謝紊亂、水、電解質(zhì)、酸堿平衡失調(diào)的臨床綜合征，臨床死亡率達50％-80％。
急性腎衰竭的治療原則主要包括：①一般治療，臥床休息、充分補充營養(yǎng)和熱量；②維持水、電解質(zhì)及酸堿平衡，恢復(fù)有效循環(huán)血容量，預(yù)防多臟器的損傷及并發(fā)癥的出現(xiàn)；③控制感染選用感染抗生素；④透析治療包括血液透析、血液濾過或腹膜透析，及早清除毒素對機體各系統(tǒng)的損害，有利于損傷細胞的修復(fù)；⑤積極治療原發(fā)病，及早發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致急性腎衰竭的危險因素，并迅速去除，促進腎小管上皮細胞再生修復(fù)。
在過去的數(shù)十年，盡管血液凈化技術(shù)和危重醫(yī)學(xué)有了很大的發(fā)展，在急性腎衰竭的發(fā)病機制和治療上也進行了諸多研究，但治療的手段仍然有限，導(dǎo)致臨床上缺乏行之有效的治療方法。近年來，隨著生物療法的涌現(xiàn)，為急性腎衰竭的治療提供了新的思路，如何促進壞死后的腎組織上皮細胞再生與休復(fù)，降低急性腎衰竭的病死率，是治療急性腎衰竭疾病的新的研究方向。因此，細胞治療方法，有可能成為提高急性腎衰竭治愈率的有效方法之一。
干細胞是生物個體生長和發(fā)育的先驅(qū)，是具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細胞群體。干細胞分為胚胎干細胞和成體干細胞兩類。胚胎干細胞是一種全能的干細胞，具有分化為成體動物不同類型細胞和各種組織器官的能力，由于存在倫理學(xué)、致瘤性及免疫排斥等因素的影響，胚胎干細胞在臨床應(yīng)用中受到限制。成體干細胞是一種或多種組織器官的起源細胞，來源于骨髓、臍帶、胎盤和脂肪等組織。
近年來的研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞作為成體干細胞的一種，其仍具有分化潛能，只是失去了發(fā)育成完整個體的能力，從而成功避開了使用胚胎干細胞的諸多限制，成為干細胞領(lǐng)域的研究熱點。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供間充質(zhì)干細胞聯(lián)合維生素E在制備用于腎臟組織細胞修復(fù)藥物中的應(yīng)用，所述的間充質(zhì)干細胞可實現(xiàn)對腎臟受損組織的功能修復(fù)，對急、慢性腎衰竭均有一定的治療作用，特別是在某些特殊環(huán)境中或某些生物因子的作用下，其自身活性會進一步增強；維生素E通過抗氧化作用抑制腎臟損害因素，其經(jīng)濟性、實用性使其具有廣闊的應(yīng)用范圍，但兩者單一使用都很難達到理想的治療效果。
為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：
本發(fā)明將維生素E作為優(yōu)化劑與間充質(zhì)干細胞聯(lián)合使用于腎臟組織細胞修復(fù)，從而實現(xiàn)作用效果的進一步優(yōu)化。
維生素E(Vitamin E)是一種脂溶性維生素，又稱生育酚，是人體最主要的抗氧化劑之一。近些年還發(fā)現(xiàn)維生素E可抑制過氧化脂反應(yīng)，使末稍血管擴張，改善血液循環(huán)?，F(xiàn)有技術(shù)中，維生素E還可以通過抗氧化作用抑制腎臟損害因素，對急、慢性腎衰竭都有一定的治療效果，其經(jīng)濟性、實用性使其具有廣闊的應(yīng)用范圍，但是，單一維生素的使用，難以達到理想的治療效果。
本發(fā)明使用間充質(zhì)干細胞聯(lián)合維生素E對腎臟組織細胞進行修復(fù)，能夠減慢腎臟組織細胞凋亡的速度，提高腎臟組織的再生能力，兩者聯(lián)合使用時，利用維生素E和間充質(zhì)干細胞的協(xié)同效應(yīng)，其對腎臟組織細胞的修復(fù)效果明顯優(yōu)于兩者的單獨使用，克服了單一使用維生素E和間充質(zhì)干細胞的缺點。
進一步地，所述腎臟組織細胞修復(fù)包括腎小球細胞和腎小管上皮細胞的修復(fù)。
上述腎小球細胞是腎臟的過濾細胞，腎小管上皮細胞是指腎小管的外面的一層細胞。腎小球細胞和腎小管上皮細胞均為腎臟組織細胞。
進一步地，使用順鉑建立小鼠腎臟損傷模型，將間充質(zhì)干細胞聯(lián)合維生素E作用于小鼠腎臟損傷模型。
順鉑是二價鉑同兩個氯原子和兩個氨分子結(jié)合的重金屬絡(luò)合物，類似于雙功能烷化劑，可抑制DNA的復(fù)制過程，臨床上常用于癌癥化療，但其毒性極大，尤其是腎毒性極大。腎臟組織細胞對順鉑最為敏感，高濃度時可以抑制腎臟組織細胞的RNA及蛋白質(zhì)合成。
本發(fā)明中，利用順鉑的腎毒性構(gòu)造小鼠腎臟損傷模型，并控制劑量以免致死小鼠。
進一步地，本發(fā)明所采用的優(yōu)選技術(shù)方案，包括以下步驟：
步驟(1)將小鼠腎小管上皮細胞接種于培養(yǎng)板，隨后放入培養(yǎng)皿中用培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，然后加入順鉑建立小鼠腎臟損傷模型；
步驟(2)將間充質(zhì)干細胞接種于懸掛式多孔膜培養(yǎng)皿多孔膜內(nèi)側(cè)，然后將懸掛式多孔膜培養(yǎng)皿放入腎小管上皮細胞培養(yǎng)皿中的腎小管上皮細胞培養(yǎng)板的上方，并在培養(yǎng)液中加入維生素E；
上述接種于懸掛式多孔膜培養(yǎng)皿多孔膜內(nèi)側(cè)的間充質(zhì)干細胞與處在其下方的腎小管上皮細胞所分泌的細胞因子可以自由通過培養(yǎng)皿的多孔膜。
步驟(3)將小鼠腎小管上皮細胞和間充質(zhì)干細胞進行共培養(yǎng)，2～5天后檢測腎小管上皮細胞的增殖和凋亡情況。
優(yōu)選的，上述步驟(1)所使用的培養(yǎng)板為6孔培養(yǎng)板，所述培養(yǎng)液為2％FBS培養(yǎng)液。
本發(fā)明中使用的FBS培養(yǎng)液是無血清培養(yǎng)基的一種，被廣泛的應(yīng)用于培養(yǎng)哺乳動物和無脊椎動物細胞以制備單克隆抗體，病毒抗原和重組蛋白等。大多數(shù)的無血清培養(yǎng)基含有向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運離子的轉(zhuǎn)鐵蛋白和調(diào)節(jié)葡萄糖攝取量的胰島素，以及一些蛋白質(zhì)和清蛋白，纖維蛋白，胎球蛋白等，這些蛋白在細胞培養(yǎng)中發(fā)揮各種不同的功能，如提供細胞貼壁所需的基質(zhì)，抗生物反應(yīng)器剪切力，作為脂質(zhì)和其他生長分化因子的載體等。
優(yōu)選的，上述步驟(1)中小鼠腎小管上皮細胞接種于培養(yǎng)板的接種密度為1.5x103cells/cm2。
優(yōu)選的，上述步驟(1)中建立小鼠腎臟損傷模型時，順鉑的使用量為100μM。
優(yōu)選的，上述步驟(2)中培養(yǎng)液中維生素E的加入量為40μM/天。
優(yōu)選的，上述步驟(3)中所述培養(yǎng)時間優(yōu)選為2天、3天或5天。
進一步地，本發(fā)明所采用的優(yōu)選技術(shù)方案，包括以下步驟：將小鼠給予腹腔注射順鉑，建立小鼠腎臟損傷模型，隨后用尾靜脈注射的方式注入間充質(zhì)干細胞和維生素E，連續(xù)注射7～15天。
優(yōu)選的，所述培養(yǎng)時間優(yōu)選為7天、14天或21天。
優(yōu)選的，上述注射用順鉑為使用0.9％生理鹽水稀釋之后的順鉑，按18mg/kg體重的劑量腹腔注射小鼠，構(gòu)建小鼠腎臟損傷模型。
優(yōu)選的，上述每千克小鼠的間充質(zhì)干細胞應(yīng)用劑量為3.1×106Cells/天～3.5×106Cells/天。
進一步地，本發(fā)明中所述的間充質(zhì)干細胞為臍帶間充質(zhì)干細胞。
人臍帶間充質(zhì)干細胞取材于一直作為分娩廢棄物的臍帶組織，取材方便，易于收集、保存、冷凍，不受倫理道德及法律方面的限制。臍帶間充質(zhì)干細胞含量豐富，一根30cm的臍帶可得到107原代細胞，且細胞較為原始，分化能力強，生物性能穩(wěn)定，多次傳代擴增后仍能保持旺盛功能，可以為實驗和臨床提供充足的細胞來源。
目前為止，臍帶間充質(zhì)干細胞已經(jīng)在多方面被證明是自體和異體細胞移植、治療的理想細胞。和胚胎干細胞相比，臍帶間充質(zhì)干細胞在生物學(xué)特征和免疫學(xué)特性上與其相似，是細胞工程種子細胞的重要來源。
進一步地，每千克小鼠的順鉑應(yīng)用劑量為18mg。
本發(fā)明中，每千克小鼠的順鉑應(yīng)用劑量為18mg，該計量可以嚴重損傷小鼠的腎臟組織細胞，但不會致死小鼠。
進一步地，每千克小鼠的維生素E應(yīng)用劑量為40μM/天。
進一步地，每千克小鼠的間充質(zhì)干細胞應(yīng)用劑量為3.1×106Cells/天～3.5×106Cells/天。
更進一步地，每千克小鼠的間充質(zhì)干細胞應(yīng)用劑量為3.3×106Cells/天。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
本發(fā)明提供了間充質(zhì)干細胞聯(lián)合維生素E在制備用于腎臟組織細胞修復(fù)藥物中的應(yīng)用，現(xiàn)有技術(shù)中間充質(zhì)干細胞可實現(xiàn)對腎臟受損組織的功能修復(fù)，對急、慢性腎衰竭均有一定的治療作用，特別是在某些特殊環(huán)境中或某些生物因子的作用下，其自身活性會進一步增強。同時，現(xiàn)有技術(shù)中也記載了維生素E通過抗氧化作用抑制腎臟損害因素，但兩者單一使用雖然可以達到一定的修復(fù)效果，但效果都不十分理想。本發(fā)明將維生素E作為優(yōu)化劑與間充質(zhì)干細胞聯(lián)合使用于腎臟組織細胞修復(fù)，能夠減慢腎臟組織細胞凋亡的速度，提高腎臟組織的再生能力，兩者聯(lián)合使用時，利用維生素E和間充質(zhì)干細胞的協(xié)同效應(yīng)，其對腎臟組織細胞的修復(fù)效果明顯優(yōu)于兩者的單獨使用。
具體實施方式
下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
實施例1臍帶間充質(zhì)干細胞的制得
(1)將臍帶放入酒精浸泡消毒，隨后用PBS緩沖液進行沖洗，將沖洗后的臍帶分離臍靜脈及臍動脈，然后將臍帶剪成長度約5mm的組織塊；
(2)在剪好的臍帶組織塊中加入細胞分離液，在37℃、5％CO2和95％空氣的條件下分離消化12h；
(3)將分離消化后的臍帶塊以1500rpm離心10min，棄上清，用含10％胎牛血清的DMEM/F12液體培養(yǎng)基懸浮細胞，分離得到臍帶間充質(zhì)干細胞,細胞含量為5×104cells/ml。
實施例2臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)擴增過程
(1)原代培養(yǎng)：將所分離的臍帶間充質(zhì)干細胞以5×104cells/ml的密度接種在37℃、5％的CO2、95％的空氣氣相下培養(yǎng)48h后換液，先用PBS溶液輕輕沖洗3次，以去除大部分的未貼壁細胞，換上基礎(chǔ)培養(yǎng)液，37℃、5％的CO2、95％的空氣條件下繼續(xù)培養(yǎng)。
本發(fā)明中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液是指含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液。
(2)傳代培養(yǎng)是指將待臍帶間充質(zhì)干細胞生長至占培養(yǎng)皿底面的80％時傳代，先吸去舊培養(yǎng)液，PBS緩沖液沖洗2次，用細胞分離液消化至大部分細胞胞質(zhì)回縮，將要從培養(yǎng)皿底壁脫落時，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止消化，用吸管輕輕吹打制成單細胞懸液，以1:3的比例將細胞接種在另一培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。
(3)凍存是指當傳代培養(yǎng)后的臍帶間充質(zhì)干細胞生長至占培養(yǎng)皿底面的80％時，消化并收集細胞懸液，1000rpm離心5min，棄上清液，以5×106cells/ml的比例加入預(yù)冷凍存液，充分混勻后置預(yù)冷的凍存管中。按4℃30min,-20℃30min,-80℃過夜的程序進行凍存。最后置于液氮罐中保存。長期凍存后應(yīng)間隔一定時間復(fù)蘇細胞，觀察細胞生長情況。
(4)復(fù)蘇是指從液氮罐中取出凍存管，迅速投入37℃水浴中快速晃動，直至凍存液完全溶解，要在1-2min內(nèi)完成復(fù)溫。然后吸出細胞懸液接種在培養(yǎng)皿中，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液，于37℃、5％CO2、95％的空氣氣相下培養(yǎng)，第二天換液。
實施例3體外細胞培養(yǎng)實驗
步驟(1)：進行細胞分組
將小鼠腎臟組織細胞細胞分為以下5組：
1)小鼠腎臟組織細胞正常對照組
2)小鼠腎臟組織細胞順鉑損傷組
3)小鼠腎臟組織細胞順鉑損傷+間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)組
4)小鼠腎臟組織細胞順鉑損傷+維生素E共培養(yǎng)組
5)小鼠腎臟組織細胞順鉑損傷+間充質(zhì)干細胞+維生素E共培養(yǎng)組
步驟(2)：將小鼠腎小管上皮細胞接種于6孔培養(yǎng)板，接種密度為1.5x103cells/cm2。隨后放入培養(yǎng)皿中用2％FBS培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，然后加入順鉑100μM建立小鼠腎臟損傷模型；
步驟(3)：將間充質(zhì)干細胞接種于懸掛式多孔膜培養(yǎng)皿多孔膜內(nèi)側(cè)，然后將懸掛式多孔膜培養(yǎng)皿放入腎小管上皮細胞培養(yǎng)皿中的腎小管上皮細胞培養(yǎng)板的上方，并在培養(yǎng)液中加入維生素E40μM/天。上述接種于懸掛式多孔膜培養(yǎng)皿多孔膜內(nèi)側(cè)的間充質(zhì)干細胞與處在其下方的腎小管上皮細胞所分泌的細胞因子可以自由通過培養(yǎng)皿的多孔膜。
步驟(4)：將小鼠腎小管上皮細胞和間充質(zhì)干細胞進行共培養(yǎng)，3天后檢測腎小管上皮細胞的增殖和凋亡情況。
實施例4體內(nèi)動物實驗7天
步驟(1)：選用6-8周齡清潔級裸小鼠30只，根據(jù)尾靜脈注射物質(zhì)的不同，隨機分成5組，每組6只：
組l：正常對照組；
組2：生理鹽水治療組；
組3：間充質(zhì)干細胞+維生素E共培養(yǎng)組細胞治療組；
組4：間充質(zhì)干細胞細胞治療組；
組5：維生素E細胞治療組。
步驟(2)：將分組后的小鼠給予腹腔注射順鉑100μM，建立小鼠腎臟損傷模型。
步驟(3)：隨后用尾靜脈注射的方式向各組小鼠分別注入間充質(zhì)干細胞和維生素E，連續(xù)注射7天，并處死各組動物。而后測定各項治療指標，從而評估實驗動物的腎臟的功能狀態(tài)。其中：
組l：正常對照組，該組不進行順鉑的注射，以進行正常小鼠腎臟組織細胞的對照；
組2：生理鹽水治療組，該組進行順鉑的注射，用以作為不經(jīng)間充質(zhì)干細胞和/或維生素E治療的小鼠腎臟組織細胞的對照；
組3：間充質(zhì)干細胞+維生素E共培養(yǎng)組細胞治療組，該組進行順鉑的注射，尾靜脈注射過程中，每千克小鼠的間充質(zhì)干細胞應(yīng)用劑量為3.3×106Cells/天，每千克小鼠的維生素E應(yīng)用劑量為40μM/天。
組4：間充質(zhì)干細胞細胞治療組，該組進行順鉑的注射，尾靜脈注射過程中，每千克小鼠的間充質(zhì)干細胞應(yīng)用劑量為3.3×106Cells/天；
組5：維生素E細胞治療組，該組進行順鉑的注射，尾靜脈注射過程中，每千克小鼠的維生素E應(yīng)用劑量為40μM/天。
實施例5體內(nèi)動物實驗15天
步驟(1)：選用6-8周齡清潔級裸小鼠30只，根據(jù)尾靜脈注射物質(zhì)的不同，隨機分成5組，每組6只：
組l：正常對照組；
組2：生理鹽水治療組；
組3：間充質(zhì)干細胞+維生素E共培養(yǎng)組細胞治療組；
組4：間充質(zhì)干細胞細胞治療組；
組5：維生素E細胞治療組。
步驟(2)：將分組后的小鼠給予腹腔注射順鉑100μM，建立小鼠腎臟損傷模型。
步驟(3)：隨后用尾靜脈注射的方式向各組小鼠分別注入間充質(zhì)干細胞和維生素E，連續(xù)注射15天，并處死各組動物。而后測定各項治療指標，從而評估實驗動物的腎臟的功能狀態(tài)。其中：
組l：正常對照組，該組不進行順鉑的注射，以進行正常小鼠腎臟組織細胞的對照；
組2：生理鹽水治療組，該組進行順鉑的注射，用以作為不經(jīng)間充質(zhì)干細胞和/或維生素E治療的小鼠腎臟組織細胞的對照；
組3：間充質(zhì)干細胞+維生素E共培養(yǎng)組細胞治療組，該組進行順鉑的注射，尾靜脈注射過程中，每千克小鼠的間充質(zhì)干細胞應(yīng)用劑量為3.3×106Cells/天，每千克小鼠的維生素E應(yīng)用劑量為40μM/天。
組4：間充質(zhì)干細胞細胞治療組，該組進行順鉑的注射，尾靜脈注射過程中，每千克小鼠的間充質(zhì)干細胞應(yīng)用劑量為3.3×106Cells/天；
組5：維生素E細胞治療組，該組進行順鉑的注射，尾靜脈注射過程中，每千克小鼠的維生素E應(yīng)用劑量為40μM/天。
盡管已用具體實施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。