本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及藥用納米銀組合物DG-5的制備及其在抗耐藥菌藥物中的用途，包括對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-ResistantStaphylococcusAureus，MRSA)和耐萬(wàn)古霉素腸球菌(VRE)，尤其是對(duì)陰溝腸桿菌，銅綠假單胞菌，大腸埃希菌，肺炎克雷伯菌，鮑曼不動(dòng)桿菌等超級(jí)細(xì)菌(Superbugs)具有很強(qiáng)的抑制效果。
背景技術(shù)：
：近年來(lái)，抗生素耐藥菌株的不斷增加嚴(yán)重威脅著公眾的健康。早在上世紀(jì)40年代，青霉素作為第一種有效的抗生素，曾經(jīng)成功解決了臨床上金黃色葡萄球菌感染這一難題。隨后研發(fā)成功的各種抗生素如大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)，氨基甙類(lèi)抗生素等又使肺炎、肺結(jié)核等致命疾病的死亡率大為降低。然而，人類(lèi)戰(zhàn)勝細(xì)菌的時(shí)代遠(yuǎn)沒(méi)有到來(lái)。事實(shí)上，許多抗生素在應(yīng)用多年后出現(xiàn)了不同程度的藥效減低，天然青霉素在控制金葡菌感染方面早已失去藥用價(jià)值。在被稱(chēng)為抗生素″黃金時(shí)代″的上世紀(jì)五六十年代，全世界每年死于感染性疾病的人數(shù)約為700萬(wàn)，而這一數(shù)字到了1999年上升到2000多萬(wàn)。在號(hào)稱(chēng)世界上科技最發(fā)達(dá)國(guó)家的美國(guó)，1982至1992年間死于傳染性疾病的人數(shù)上升了40％，而死于敗血癥的人數(shù)上升了89％。造成病死率升高的主要原因是耐藥菌帶來(lái)的用藥困難。長(zhǎng)久以來(lái)，細(xì)菌的耐藥性并未引起足夠的重視，仍有醫(yī)生們相信現(xiàn)有藥物足以對(duì)付耐藥菌。如對(duì)天然青霉素耐藥的金葡菌，可以用氨芐青霉素，頭孢菌素等，甚至于對(duì)頭孢菌素耐藥的耐甲氧西林金葡菌(MRSA)，還可以用萬(wàn)古霉素。但是在1992年，美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)了萬(wàn)古霉素產(chǎn)生耐藥性的MRSA，美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心2016年5月證實(shí)：發(fā)現(xiàn)首例攜帶MCR-1基因的細(xì)菌，稱(chēng)之為“無(wú)敵細(xì)菌病例”，對(duì)現(xiàn)階段全部抗生素都具有耐藥性，包括對(duì)人體腎臟有損害，于上世紀(jì)七八十代停止用于人體被視為最后一道防線的粘菌素。為人類(lèi)濫用抗生素敲響了警鐘。在我國(guó)，由于濫用抗生素的情況十分普遍，抗生素應(yīng)用率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于各國(guó)平均水平，同時(shí)，醫(yī)生濫開(kāi)氨芐西林等廣譜抗菌類(lèi)藥物，導(dǎo)致人體內(nèi)菌群失調(diào)并誘發(fā)二次感染的情況更是屢見(jiàn)不鮮。近年中國(guó)和英國(guó)研究人員在英國(guó)《柳葉刀·傳染病》雜志上曾經(jīng)報(bào)告，在中國(guó)家禽和人類(lèi)身上發(fā)現(xiàn)攜帶MCR-1基因的細(xì)菌，而未引起足夠重視。時(shí)至今日，我國(guó)的耐藥菌問(wèn)題已變得十分突出，耐藥菌引起的醫(yī)院內(nèi)感染人數(shù)，已占到住院感染患者總?cè)藬?shù)的30％左右。解決細(xì)菌耐藥性問(wèn)題已經(jīng)是迫在眉睫。在加強(qiáng)對(duì)臨床醫(yī)生的在職教育，嚴(yán)格杜絕濫用抗生素和建立細(xì)菌耐藥性的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)等監(jiān)管措施之外，加快新型抗生素的研制步伐已是刻不容緩。近年來(lái)，隨著耐藥菌的抗藥能力越來(lái)越強(qiáng)，甚至出現(xiàn)所謂超級(jí)耐藥菌(Superbugs)，全球各大藥物公司又開(kāi)始在新型抗生素的研發(fā)方面加強(qiáng)投入。研究開(kāi)發(fā)結(jié)構(gòu)新穎的，毒性較低的，具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型抗耐藥菌藥物有著十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。近年來(lái)我國(guó)也有少量發(fā)明專(zhuān)利涉及抗耐藥菌領(lǐng)域：CN101584694A，CN101195627A，CN101428026A，CN100586433C，CN100441580C，CN1308047A，CN101074235A，CN100519533C，CN101786979A，CN102464603B。其中CN102464603B報(bào)道吲哚滿(mǎn)二酮類(lèi)衍生物及其在制備抗耐藥菌藥物中的用途，特別是對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌等耐藥細(xì)菌有很強(qiáng)的抑制效果。另一方面，金屬銀的廣譜殺菌作用早已為人們所知。銀離子和含銀化合物可以殺死或者抑制細(xì)菌、病毒、藻類(lèi)和真菌。銀有對(duì)抗疾病的效果，所以又被稱(chēng)為親生物金屬。銀對(duì)人體正常細(xì)胞無(wú)害。銀的抗菌性能早在16世紀(jì)就被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥界，我國(guó)明代著名醫(yī)藥家李時(shí)珍所著《本草綱目》中也記載銀可抗菌。如用銀片覆蓋傷口預(yù)防潰爛，用銀絲織成紗布包裹皮膚創(chuàng)傷，嬰兒出生時(shí)滴上硝酸銀溶液可防止黏膜感染。20世紀(jì)30年代，抗生素的發(fā)現(xiàn)一度使人們忽視了對(duì)銀抗菌性能的利用。然而，隨著抗生素等化學(xué)藥物的濫用，越來(lái)越多的微生物通過(guò)變異產(chǎn)生了耐藥性，使得一些由耐藥性細(xì)菌引起的疾病無(wú)法醫(yī)治。近年來(lái)，金屬銀作為生物安全性高、穩(wěn)定性好的金屬材料引起廣泛關(guān)注，也使具備高效、廣譜及不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)的銀系殺菌劑再次引起人們的重視。由于金屬銀具有廣譜抗菌、長(zhǎng)效抗菌、強(qiáng)效殺菌、滲透性強(qiáng)且無(wú)任何的耐藥性，對(duì)皮膚也未發(fā)現(xiàn)任何刺激反應(yīng)，并能夠促進(jìn)傷口的愈合、細(xì)胞的生長(zhǎng)及受損細(xì)胞的修復(fù)，無(wú)任何毒性反應(yīng)的特性，含銀的醫(yī)療器械成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。新型的納米銀抗菌纖維、納米銀敷料、納米銀凝膠、納米銀抗菌導(dǎo)管，納米銀避孕套不斷地被開(kāi)發(fā)出來(lái)。2004年以來(lái)，已有29種含納米銀的醫(yī)療產(chǎn)品取得了省級(jí)食品藥品監(jiān)督管理局的注冊(cè)批件，進(jìn)入臨床應(yīng)用。2016年2月，國(guó)家食品藥品管理局首次批準(zhǔn)了7種產(chǎn)品進(jìn)入臨床應(yīng)用。然而，目前市場(chǎng)上的納米銀粉末多以化學(xué)方法制備，各種粒徑、形狀混存，其純度、性能和分布的精確性、穩(wěn)定性均難確定，納米粉末的收集、存放、運(yùn)輸?shù)燃夹g(shù)研究尚待加強(qiáng)，生物、藥物應(yīng)用的安全性更難保障。市場(chǎng)上已有的納米銀產(chǎn)品，受現(xiàn)有納米銀制備技術(shù)的限制，絕大部分是將單質(zhì)金屬銀或其他含銀化合物利用物理或化學(xué)的方法，制成納米級(jí)別的金屬銀粉末。在制備過(guò)程中通常的物理方法(如球磨法)難以達(dá)到納米級(jí)。電解法產(chǎn)量低，成本高，又不宜于工業(yè)化應(yīng)用。而化學(xué)方法的制備一直為獲取高純度的納米粉末產(chǎn)品所困惑，特別在產(chǎn)業(yè)化過(guò)程中，其各種“酸根”的分離、雜質(zhì)的清除極難實(shí)現(xiàn)，另外，還存在還原劑的影響。從而限制了納米銀材料在各個(gè)領(lǐng)域尤其是生物、醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。目前尚未見(jiàn)到有關(guān)納米銀抗超級(jí)耐藥菌的報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種新的藥用納米材料組合物DG-5及其在抗耐藥菌藥物中的用途。所述藥用納米銀組合物DG-5能夠用于抗耐藥菌的醫(yī)療應(yīng)用，包括對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和耐萬(wàn)古霉素腸球菌(VRE)，尤其是對(duì)陰溝腸桿菌，銅綠假單胞菌，大腸埃希菌，肺炎克雷伯菌，鮑曼不動(dòng)桿菌等超級(jí)細(xì)菌(Superbugs)有很強(qiáng)的抑制效果。本發(fā)明提供了所述藥用納米材料組合物用于抗耐藥菌的醫(yī)藥應(yīng)用，包括在相應(yīng)藥物制備中的用途。本發(fā)明提供了一種藥用納米材料組合物DG-5在藥物制備中的用途，其中所述藥物用于抗耐藥菌，所述組合物由下述成分組成：球形納米銀粉末1-2g/L，葡萄糖1-2g/L，其余為水；所述球形納米銀粉末粒徑為0.1～5m(購(gòu)自湖南光谷納米科技有限公司)，球形納米銀粉末中銀的純度≥99.99％。所述耐藥菌包括肺炎克雷伯桿菌、乙酸鈣不動(dòng)桿菌、糞腸球菌、肺炎鏈球菌或金黃色葡萄球菌。所述耐藥菌還可包括超級(jí)耐藥菌，例如陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌或鮑曼不動(dòng)桿菌。根據(jù)不同的實(shí)施方式，所述藥用納米材料組合物可以是單獨(dú)使用或與其它藥劑聯(lián)合使用。本發(fā)明還提供了一種抗菌藥物，含有所述藥用納米材料組合物以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。根據(jù)不同的實(shí)施方式，所述載體為例如稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤(rùn)滑劑或它們的組合。根據(jù)需要，所述抗菌藥物的劑型為例如注射劑、片劑、丸劑、膠囊、懸浮劑或乳劑。利用納米技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，本發(fā)明人對(duì)納米材料進(jìn)行了深入的研究。納米材料因其獨(dú)特的表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)，表現(xiàn)出很多特殊的物理和化學(xué)性質(zhì)，特別是在力學(xué)、熱學(xué)、磁學(xué)、光電、電子等方面與同質(zhì)的塊體材料呈現(xiàn)出巨大的差異。本發(fā)明人認(rèn)為納米技術(shù)的發(fā)展對(duì)抗感染研究提供了新的方向，許多納米材料表現(xiàn)出了潛在的抗菌活性。將金屬銀加工成納米銀后，其比表面積極大，顯示明顯的表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和宏觀隧道效應(yīng)。這些效應(yīng)的綜合作用大大地增強(qiáng)了銀的抗菌能力，特別是超細(xì)粒徑納米銀(粒徑小于5nm)使得納米銀抗菌的有效濃度可以達(dá)到納摩爾水平，遠(yuǎn)低于銀離子的微摩爾水平。本發(fā)明的納米銀就是利用前沿納米技術(shù)將銀納米化，將粒徑做到納米級(jí)(0.1～100nm)金屬銀。極少量的納米銀就可產(chǎn)生強(qiáng)大的殺菌作用，比如可在數(shù)分鐘內(nèi)殺死650多種細(xì)菌。關(guān)于納米銀及其制備方法可參考本發(fā)明人于2015年2月10日提交的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)CN201510066287.2，其內(nèi)容在此通過(guò)參考引用全部納入本文。本發(fā)明涉及藥用納米銀組合物DG-5選用湖南光谷納米科技有限公司的納米銀粉末(0.1～5nm)選擇了醫(yī)藥上可接受的葡萄糖、純水作為其穩(wěn)定劑和稀釋劑，一方面盡可能減少組合物品種，另一方面從材質(zhì)上確保其組合物的藥用安全性。附圖說(shuō)明圖1為試驗(yàn)板圖譜。其中，A行和B行：環(huán)丙沙星(CIP)，最高測(cè)試濃度64μg/ml，2倍倍比稀釋。C行和D行：DG-5，最高測(cè)試濃度30μg/ml，2倍倍比稀釋。生長(zhǎng)對(duì)照(Growthcontrol，GC)：化合物溶劑，含有細(xì)菌接種物的1.1xCAMHB或CAMHBII，無(wú)化合物。無(wú)菌對(duì)照(Sterilecontrol，SC)：化合物溶劑，1.1xCAMHB或CAMHBII，無(wú)化合物。具體實(shí)施方式本發(fā)明的技術(shù)方案可以通過(guò)下述實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述，但這些實(shí)施例僅作為說(shuō)明，而不是對(duì)本申請(qǐng)的保護(hù)范圍進(jìn)行限制。實(shí)施例1：藥用納米材料組合物DG-5，由如下濃度的成分組成：球形納米銀粉末1-2g/L，葡萄糖1-2g/L，其余為水；所述球形納米銀粉末粒徑為0.1～5nm(購(gòu)自湖南光谷納米科技有限公司)，球形納米銀粉末中銀的純度≥99.99％。實(shí)施例2：藥用納米材料組合物DG-5抗5株耐藥菌(肺炎克雷伯桿菌，乙酸鈣不動(dòng)桿菌，糞腸球菌，肺炎鏈球菌，金黃色葡萄球菌)的活性測(cè)定。本研究采用最小抑菌濃度作為抗菌活性指標(biāo)。最小抑菌濃度指可抑制某種微生物出現(xiàn)明顯生長(zhǎng)的最低化合物濃度(Minimuminhibitoryconcentration，MIC)。最小抑菌濃度參照臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所指南(ClinicalandLaboratoryStandardsInstituteGuidelines，CLSI)的微量培養(yǎng)基稀釋法加以測(cè)定。本研究檢測(cè)了一個(gè)測(cè)試樣品DG-5和一個(gè)對(duì)照抗生素環(huán)丙沙星對(duì)5株細(xì)菌的最小抑菌濃度。測(cè)試樣品DG-5在96孔板中從最高檢測(cè)濃度30μg/ml進(jìn)行兩倍倍比稀釋。試驗(yàn)板放入普通培養(yǎng)箱35±2℃培養(yǎng)16-20小時(shí)后，觀察孔中細(xì)菌生長(zhǎng)情況并加以記錄。一同被檢測(cè)的參照物環(huán)丙沙星的最小抑菌濃度與歷史數(shù)據(jù)一致，最終判定測(cè)試樣品DG-5對(duì)5株細(xì)菌的最小抑菌濃度在1.875-15μg/ml之間。1.材料細(xì)菌菌株培養(yǎng)基：胰酶大豆瓊脂(Trypticasesoyagar，TSA)(BDBBL211043)TSA+5％綿羊血(TSAII)；離子校正的馬-欣二氏肉湯(Cation-adjustedMuellerHintonbroth，CAMHB)(BDBBL212322)；CAMHB+3％馬血(CAMHBII)；綿羊血(QuadFive630-500)；馬血(QuadFive205-500)。試劑和耗材：測(cè)試樣品DG-5(300μg/ml)由長(zhǎng)沙迪谷納米提供。環(huán)丙沙星(Sigma17850)。一次性搖瓶，250ml(Corning430183)。一次性平皿，100mm(VWR25384-302)。96孔微量滴定板(Greiner650162)。2.方法細(xì)菌復(fù)蘇：用于最小抑菌濃度測(cè)試的5株細(xì)菌凍存于-80℃低溫冰箱，提前2天復(fù)蘇。用無(wú)菌接種環(huán)刮取少許凍存的細(xì)菌在合適的固體培養(yǎng)基平皿上劃線接種，放入合適的氣體培養(yǎng)環(huán)境中35±2℃培養(yǎng)20-24小時(shí)(肺炎鏈球菌：TSAII，5％CO2糞腸球菌：TSAII，普通大氣環(huán)境，其余3株細(xì)菌：TSA，普通大氣環(huán)境)。用無(wú)菌接種環(huán)從上述培養(yǎng)皿中挑取5-10個(gè)形態(tài)相似的菌落，再次劃線接種于合適的固體培養(yǎng)基平皿上。隨后放入合適的氣體培養(yǎng)環(huán)境中35±2℃培養(yǎng)20-24小時(shí)。接種細(xì)菌準(zhǔn)備：將液體培養(yǎng)基從4℃冰箱取出放置室溫加熱。從上述固體培養(yǎng)皿中挑取5-10個(gè)細(xì)菌單菌落重懸于500μl的1.1xCAMHB中，用分光光度計(jì)調(diào)節(jié)OD600至0.1～0.13。用相應(yīng)的液體培養(yǎng)基(CAMHB或CAMHBII)將革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(G+)稀釋280倍，革蘭氏陰性細(xì)菌(G-)稀釋400倍(比如35.6μl的G+細(xì)菌培養(yǎng)物稀釋于10ml的CAMHB中或25μlG-細(xì)菌培養(yǎng)物稀釋于10ml的CAMHB中)。·肺炎鏈球菌：CAMHBII·其余4株細(xì)菌：CAMHB試驗(yàn)板準(zhǔn)備：試驗(yàn)板圖譜(見(jiàn)圖1)：A行和B行：環(huán)丙沙星(CIP)，最高測(cè)試濃度64μg/ml，2倍倍比稀釋。C行和D行：DG-5，最高測(cè)試濃度30μg/ml，2倍倍比稀釋。生長(zhǎng)對(duì)照(Growthcontrol，GC)：化合物溶劑，含有細(xì)菌接種物的1.1xCAMHB或CAMHBII，無(wú)化合物。無(wú)菌對(duì)照(Sterilecontrol，SC)：化合物溶劑，1.1xCAMHB或CAMHBII，無(wú)化合物?；衔锵♂?zhuān)恨D(zhuǎn)移120μl的化合物到稀釋板的起始孔中，再轉(zhuǎn)60μl的二甲亞砜(DMSO，用于稀釋環(huán)丙沙星)或DG-5的溶劑至其他孔中。依次從第1列到第11列對(duì)每個(gè)化合物進(jìn)行2倍倍比稀釋(即從第1列吸取60μl化合物至第2列并混勻，再?gòu)牡?列吸取60μl化合物到第3列并混勻，再?gòu)牡?列吸取60μl化合物到第4列并混勻，以此類(lèi)推稀釋至第11列)。從稀釋板中轉(zhuǎn)移2μl的環(huán)丙沙星和10μl的DG-5到5塊試驗(yàn)板每塊板的相應(yīng)孔中，同時(shí)加入2μl的100％DMSO或10μl的DG-5溶劑到無(wú)化合物孔中(GC和SC孔)。加入98μl的細(xì)菌接種物至試驗(yàn)板的A1-A12和B1-B11孔中，同時(shí)加入90μl的細(xì)菌接種物至試驗(yàn)板的C1-C12和D1-D11孔中。加入98μl的培養(yǎng)基至試驗(yàn)板的B12孔中，同時(shí)加入90μl的培養(yǎng)基至試驗(yàn)板的D12孔中。體系加完后用無(wú)菌蓋蓋住5塊試驗(yàn)板，放入離心機(jī)1000rpm離心30秒，再放入普通培養(yǎng)箱35±2℃培養(yǎng)16-20小時(shí)。菌落計(jì)數(shù)：將接種細(xì)菌用液體培養(yǎng)基從10-1稀釋至10-7(比如100μl的細(xì)菌接種物+900μl的1.1xCAMHB)。將100μl上述細(xì)菌稀釋液均勻涂布于TSA平皿中，每個(gè)稀釋度2個(gè)重復(fù)。待培養(yǎng)基被TSA吸收10分鐘后，反轉(zhuǎn)平皿在培養(yǎng)箱中35±2℃培養(yǎng)24小時(shí)。細(xì)菌接種物通常每毫升含有1-2x108個(gè)菌落，所以換算下來(lái)通常試驗(yàn)板每孔含有2.5-5x104個(gè)菌落。最小抑菌濃度記錄及菌落數(shù)統(tǒng)計(jì)：打開(kāi)化合物管理系統(tǒng)檢查每塊試驗(yàn)板的條形碼和化合物排布是否正確。將試驗(yàn)板置于讀板設(shè)備上，調(diào)節(jié)反射鏡觀察記錄每個(gè)孔中細(xì)菌生長(zhǎng)情況。同時(shí)用QCount軟件對(duì)每塊試驗(yàn)板拍照。參照臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所指南記錄每個(gè)化合物的最小抑菌濃度。統(tǒng)計(jì)不同稀釋度細(xì)菌接種物在TSA平皿的菌落數(shù)并計(jì)算細(xì)菌接種量。3.結(jié)果本研究參照臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所指南的微量培養(yǎng)基稀釋法檢測(cè)了一個(gè)測(cè)試樣品DG-5和一個(gè)對(duì)照抗生素環(huán)丙沙星對(duì)5株細(xì)菌的最小抑菌濃度。測(cè)試樣品DG-5在96孔板中從最高檢測(cè)濃度30μg/ml進(jìn)行兩倍倍比稀釋。試驗(yàn)板中的細(xì)菌接種物從不同的固體培養(yǎng)基平皿復(fù)蘇并稀釋于CAMHB或CAMHBII中，同時(shí)在試驗(yàn)板中設(shè)置了生長(zhǎng)對(duì)照和無(wú)菌對(duì)照。試驗(yàn)板在普通培養(yǎng)箱35±2℃培養(yǎng)16-20小時(shí)后觀察并記錄每個(gè)化合物對(duì)不同細(xì)菌的最小抑菌濃度。表1和表2分別記錄了2次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)的最小抑菌濃度值。對(duì)照化合物環(huán)丙沙星的最小抑菌濃度值與文獻(xiàn)中報(bào)道的一致。試驗(yàn)板細(xì)菌接種量統(tǒng)計(jì)并記錄于表3。表1.第1次試驗(yàn)的最小抑菌濃度值表2.第2次試驗(yàn)的最小抑菌濃度值表3.五株細(xì)菌接種菌落數(shù)(第1次試驗(yàn)和第2次試驗(yàn))實(shí)施例3：藥用納米材料組合物DG-5抗5株超級(jí)耐藥菌的活性測(cè)定。采用實(shí)施例2同樣的方法，對(duì)藥用納米材料組合物DG-5抗5株超級(jí)耐藥菌(陰溝腸桿菌，肺炎克雷伯菌，大腸埃希菌，銅綠假單胞菌，鮑曼不動(dòng)桿菌)的活性進(jìn)行了測(cè)定。一同被檢測(cè)的參照物環(huán)丙沙星的最小抑菌濃度與歷史數(shù)據(jù)一致，最終判定測(cè)試樣品DG-5對(duì)5株細(xì)菌的最小抑菌濃度在1.875-3.75μg/ml之間，遠(yuǎn)優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥物環(huán)丙沙星的抗菌活性。1.材料細(xì)菌菌株細(xì)菌種屬革蘭氏染色分類(lèi)編號(hào)陰溝腸桿菌G-EC9866肺炎克雷伯菌G-KP30006大腸埃希菌G-EC30026銅綠假單胞菌G-PA9347鮑曼不動(dòng)桿菌G-AB2810565培養(yǎng)基：胰酶大豆瓊脂(Trypticasesoyagar，TSA)(BDBBL211043)離子校正的馬-欣二氏肉湯(Cation-adjustedMuellerHintonbroth，CAMHB)(BDBBL212322)試劑和耗材：測(cè)試樣品DG-5(300μg/ml)由長(zhǎng)沙迪谷納米提供。環(huán)丙沙星(Sigma17850)。一次性搖瓶，250ml(Corning430183)。一次性平皿，100mm(VWR25384-302)。96孔微量滴定板(Greiner650162)。2.方法細(xì)菌復(fù)蘇：用于最小抑菌濃度測(cè)試的5株細(xì)菌凍存于-80℃低溫冰箱，提前2天復(fù)蘇。用無(wú)菌接種環(huán)刮取少許凍存的細(xì)菌在合適的固體培養(yǎng)基平皿上劃線接種，放入普通培養(yǎng)箱中35±2℃培養(yǎng)20-24小時(shí)。用無(wú)菌接種環(huán)從上述培養(yǎng)皿中挑取5-10個(gè)形態(tài)相似的菌落，再次劃線接種于合適的固體培養(yǎng)基平皿上。隨后放入普通培養(yǎng)箱中35±2℃培養(yǎng)20-24小時(shí)。接種細(xì)菌準(zhǔn)備：將液體培養(yǎng)基從4℃冰箱取出放置室溫加熱。從上述固體培養(yǎng)皿中挑取5-10個(gè)細(xì)菌單菌落重懸于500μl的1.1xCAMHB中，用分光光度計(jì)調(diào)節(jié)OD600至0.1～0.13。再用1.1xCAMHB將細(xì)菌稀釋400倍。準(zhǔn)備好的細(xì)菌接種物在15分鐘內(nèi)接種于96孔試驗(yàn)板中。接種的細(xì)菌數(shù)量通過(guò)平皿菌落計(jì)數(shù)獲得。試驗(yàn)板準(zhǔn)備：試驗(yàn)板圖譜(見(jiàn)圖1)，A行和B行：環(huán)丙沙星(CIP)，最高測(cè)試濃度64μg/ml，2倍倍比稀釋。C行和D行：DG-5，最高測(cè)試濃度30μg/ml，2倍倍比稀釋。生長(zhǎng)對(duì)照(Growthcontrol，GC)：含有細(xì)菌接種物的1.1xCAMHB或DG-5溶劑，無(wú)化合物。無(wú)菌對(duì)照(Sterilecontrol，SC)：1.1xCAMHB或DG-5溶劑，無(wú)化合物?；衔锵♂?zhuān)恨D(zhuǎn)移120μl的化合物到稀釋板的起始孔中(A1、B1、C1和D1)，再轉(zhuǎn)60μl的二甲亞砜(DMSO，用于稀釋環(huán)丙沙星)或DG-5的溶劑至其他孔中。依次從第1列到第11列對(duì)每個(gè)化合物進(jìn)行2倍倍比稀釋(即從第1列吸取60μl化合物至第2列并混勻，再?gòu)牡?列吸取60μl化合物到第3列并混勻，再?gòu)牡?列吸取60μl化合物到第4列并混勻，以此類(lèi)推稀釋至第11列)。從稀釋板中轉(zhuǎn)移2μl的環(huán)丙沙星和10μl的DG-5到5塊試驗(yàn)板每塊板的相應(yīng)孔中，同時(shí)加入2μl的100％DMSO或10μl的DG-5溶劑到無(wú)化合物孔中(GC和SC孔)。加入98μl的細(xì)菌接種物至試驗(yàn)板的A1-A12和B1-B11孔中，同時(shí)加入90μl的細(xì)菌接種物至試驗(yàn)板的C1-C12和D1-D11孔中。加入98μl的培養(yǎng)基至試驗(yàn)板的B12孔中，同時(shí)加入90μl的培養(yǎng)基至試驗(yàn)板的D12孔中。體系加完后用無(wú)菌蓋蓋住5塊試驗(yàn)板，放入離心機(jī)1000rpm離心30秒，再放入普通培養(yǎng)箱35±2℃培養(yǎng)16-20小時(shí)。菌落計(jì)數(shù)：將接種細(xì)菌用液體培養(yǎng)基從10-1稀釋至10-7(比如100μl的細(xì)菌接種物+900μl的1.1xCAMHB)。將100μl上述細(xì)菌稀釋液均勻涂布于TSA平皿中，每個(gè)稀釋度2個(gè)重復(fù)。待培養(yǎng)基被TSA吸收10分鐘后，反轉(zhuǎn)平皿在培養(yǎng)箱中35±2℃培養(yǎng)24小時(shí)。最小抑菌濃度記錄及菌落數(shù)統(tǒng)計(jì)：打開(kāi)化合物管理系統(tǒng)確認(rèn)每塊試驗(yàn)板的條形碼和化合物排布正確后，將試驗(yàn)板置于讀板設(shè)備上，調(diào)節(jié)反射鏡觀察記錄每個(gè)孔中細(xì)菌生長(zhǎng)情況。同時(shí)用QCount軟件對(duì)每塊試驗(yàn)板拍照。參照臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所指南記錄每個(gè)化合物的最小抑菌濃度。統(tǒng)計(jì)不同稀釋度細(xì)菌接種物在TSA平皿的菌落數(shù)并計(jì)算細(xì)菌接種量。3.結(jié)果本研究參照臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所指南的微量培養(yǎng)基稀釋法檢測(cè)了一個(gè)測(cè)試樣品DG-5和一個(gè)對(duì)照抗生素環(huán)丙沙星對(duì)5株細(xì)菌的最小抑菌濃度。測(cè)試樣品DG-5在96孔板中從最高檢測(cè)濃度30μg/ml進(jìn)行兩倍倍比稀釋。試驗(yàn)板中的細(xì)菌接種物從TSA復(fù)蘇并稀釋于CAMHB中，同時(shí)在試驗(yàn)板中設(shè)置了生長(zhǎng)對(duì)照和無(wú)菌對(duì)照。試驗(yàn)板在普通培養(yǎng)箱35±2℃培養(yǎng)16-20小時(shí)后觀察并記錄每個(gè)化合物對(duì)不同細(xì)菌的最小抑菌濃度。表1和表2分別記錄了2次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)的最小抑菌濃度值。結(jié)果表明，組內(nèi)重復(fù)和組間重復(fù)數(shù)據(jù)一致，對(duì)照化合物環(huán)丙沙星的最小抑菌濃度值與歷史數(shù)據(jù)一致。試驗(yàn)板細(xì)菌接種量統(tǒng)計(jì)后記錄于表3。表1.第1次試驗(yàn)的最小抑菌濃度值表2.第2次試驗(yàn)的最小抑菌濃度值表3.五株細(xì)菌接種菌落數(shù)(第1次試驗(yàn)和第2次試驗(yàn))當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3