本發(fā)明屬于納米材料領(lǐng)域，具體涉及羧基化多壁碳納米管在制備抗腫瘤藥物中的新用途。

背景技術(shù)：

腫瘤是威脅人類生命的頭號殺手。據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查表明，全世界每年新發(fā)現(xiàn)癌癥患者近1410萬人，占總死亡數(shù)的1/5。腫瘤轉(zhuǎn)移是指癌細(xì)胞從原來的部位轉(zhuǎn)移到其他部位并形成新的病灶的過程，有超過90%的腫瘤病人死于轉(zhuǎn)移，是癌癥治療困難、失敗和癌癥病人高死亡率的主要原因。因此，防治腫瘤轉(zhuǎn)移已成為一項(xiàng)迫在眉睫的艱苦任務(wù)。

治療腫瘤轉(zhuǎn)移的傳統(tǒng)方法有放療和化療。但放療存在局限性和對正常組織的損傷性；化療普遍存在細(xì)胞毒性作用，特別對肝、腎、骨髓和消化系統(tǒng)的毒副作用非常嚴(yán)重，因此，大大制約了它們在臨床上的應(yīng)用。新興的分子靶向治療降低了傳統(tǒng)藥物的毒副作用，但引入的配體蛋白會增加藥物的免疫原性，同時(shí)藥物控釋問題亦難以解決，難以達(dá)到理想的臨床應(yīng)用效果；基因治療給腫瘤患者帶來曙光，但其載體構(gòu)建、載體與彈頭的交聯(lián)及其在機(jī)體分布、代謝過程中的變化等諸多問題還在探討之中。

腫瘤轉(zhuǎn)移離不開腫瘤微環(huán)境。腫瘤微環(huán)境包括腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、細(xì)胞間質(zhì)和生物分子等，其中，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境的重要組分，其功能狀態(tài)和密度與腫瘤的惡性程度之間有著緊密的相關(guān)性。在微環(huán)境因子的刺激下，巨噬細(xì)胞可以極化為抑制腫瘤的M1型和促進(jìn)腫瘤的M2型。M1型巨噬細(xì)胞直接殺傷腫瘤并提呈腫瘤的相關(guān)抗原，清除腫瘤；M2型巨噬細(xì)胞促進(jìn)血管新生和免疫抑制，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞主要為M2型，如何誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞由M2向M1型極化是治療腫瘤轉(zhuǎn)移的研究熱點(diǎn)和重要靶點(diǎn)。

碳納米管是一種由單層或多層石墨片層卷曲而成的空心柱狀碳納米材料，其優(yōu)良的理化性質(zhì)日益引起人們的關(guān)注。碳納米管在多個(gè)科技領(lǐng)域如電子器件、復(fù)合材料和催化劑載體等方面均具有巨大的應(yīng)用潛力。在醫(yī)學(xué)生物領(lǐng)域，碳納米管主要作為一種藥物載體用于腫瘤治療研究。此外，還可以利用碳納米管獨(dú)特的光熱學(xué)性質(zhì)直接殺滅腫瘤細(xì)胞，但碳納米管光電轉(zhuǎn)化效率較低且難以提升，是制約其治療效果的一大瓶頸。研究表明，碳納米管易被單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬并在其中聚集。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的發(fā)明人在對羧基化多壁碳納米管進(jìn)行肺損傷的研究時(shí)，偶然發(fā)現(xiàn)羧基化多壁碳納米管可顯著性抑制Lewis肺癌和黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，羧基化多壁碳納米管可以顯著性促進(jìn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞由M2重編程為M1型。因此，羧基化多壁碳納米管可以作為抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供羧基化多壁碳納米管的一種新用途，具體涉及羧基化多壁碳納米管在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。

所述的羧基化多壁碳納米管是外徑20-30 nm，長500 nm，純度高于98 %的納米材料。

上述腫瘤包括但不限于肺癌、黑色素瘤。

具體應(yīng)用時(shí)，可以直接將羧基化多壁碳納米管作為治療藥物用于腫瘤治療，治療方式為局部給藥或靜脈注射。

本發(fā)明通過以下實(shí)驗(yàn)證明羧基化多壁碳納米管抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用：

顯著抑制荷瘤小鼠肺部轉(zhuǎn)移點(diǎn)數(shù)，明顯提高荷瘤小鼠體重；②促進(jìn)肺部腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞由M2重編程為M1型，增加肺部腫瘤微環(huán)境M1型巨噬細(xì)胞，同時(shí)降低M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量；③化學(xué)性剔除小鼠肺部巨噬細(xì)胞后，碳納米管抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用被逆轉(zhuǎn)。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1）本發(fā)明采用的羧基化多壁碳納米管制備工藝成熟可靠，原料來源廣泛且質(zhì)量優(yōu)良。

2）羧基化多壁碳納米管具有較好的生物相容性，在正常組織中經(jīng)原型快速代謝，一般不會引起毒性反應(yīng)，研究報(bào)道，5-10 mg/kg羧基化多壁碳納米管基本上不會引起小鼠毒性反應(yīng)。（曲廣波. 羧基化多壁碳納米管在小鼠體內(nèi)的急性毒性研究[D]. 山東大學(xué), 2008.）

3）由于實(shí)體瘤組織血管豐富、血管壁間隙較寬以及淋巴回流缺失，羧基化多壁碳納米管容易到達(dá)和滯留于腫瘤組織。同時(shí)，碳納米管易被單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬從而在其中聚集。因此，羧基化多壁碳納米管對腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞具有高靶向性。

4）羧基化多壁碳納米管可通過誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞由M2向M1型極化，增加抗腫瘤炎癥因子的分泌，提高機(jī)體的抗腫瘤免疫功能。

5）羧基化多壁碳納米管可有效抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。

6）羧基化多壁碳納米管進(jìn)入腫瘤微環(huán)境后，降解周期較長，藥效持久。

7）將羧基化多壁碳納米管本身作為藥物，可避免連接配基帶來的免疫原性問題，同時(shí)大幅度降低制藥成本。

8）腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞具有固定的特化方向，基因穩(wěn)定，不易產(chǎn)生耐藥性，通過靶向巨噬細(xì)胞實(shí)現(xiàn)腫瘤治療具有持久、高效的優(yōu)良特性。

9）本發(fā)明采用常規(guī)給藥劑型，技術(shù)成熟，生產(chǎn)工藝簡單易行。

10）本發(fā)明采用常規(guī)給藥方式，給藥方便，無痛苦。

附圖說明

圖1羧基化多壁碳納米管劑量依賴性抑制Lewis肺癌肺轉(zhuǎn)移。

圖2羧基化多壁碳納米管抑制黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移。

圖3羧基化多壁碳納米管處理Lewis肺癌模型、B16F10黑色素瘤模型肺組織蘇木精-伊紅（HE）染色圖。

圖4羧基化多壁碳納米管在Lewis肺癌模型和B16F10黑色素瘤模型中對各組動物體重的影響。

圖5化學(xué)性剔除小鼠肺部巨噬細(xì)胞逆轉(zhuǎn)碳納米管抗腫瘤作用。

圖6免疫熒光染色檢測羧基化多壁碳納米管對腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞極化影響。

圖7 RT-PCR檢測羧基化多壁碳納米管對腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞極化影響。

具體實(shí)施方式

通過以下詳細(xì)說明結(jié)合附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。所提供的實(shí)施例僅是對本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。

以下實(shí)施例所用的羧基化多壁碳納米管是外徑20-30 nm，長500 nm，純度高于98 %的納米材料。

【實(shí)施例1】羧基化多壁碳納米管對腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用

（一）小鼠藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.制備羧基化多壁碳納米管混懸液

將羧基化多壁碳納米管溶于羧甲基纖維素鈉溶液中，濃度1 mg/ml，每次使用前超聲波震蕩。

2.動物模型一

1）接種腫瘤細(xì)胞

六周齡雄性C57BL/6小鼠36只，體重18-22g，實(shí)驗(yàn)第一天，每只小鼠均尾靜脈注射Lewis肺癌細(xì)胞1×10⁵個(gè)。

2）分組

將接種后的小鼠隨機(jī)分為3組（模型對照組、低劑量碳納米管組、高劑量碳納米管組），每組12只。

3）分組處理

①模型對照組：接種24小時(shí)后，氣管滴注80 μl羧甲基纖維素鈉溶液；

②低劑量碳納米管組：接種24小時(shí)后，氣管滴注40 μl羧基化多壁碳納米管（2 mg/kg)；

③高劑量碳納米管組：接種24小時(shí)后，氣管滴注80 μl羧基化多壁碳納米管（4 mg/kg)；

4）每日稱小鼠體重

5）取肺組織，觀察肺轉(zhuǎn)移點(diǎn)數(shù)

注射腫瘤細(xì)胞后14天，處死小鼠，取肺組織，觀察并統(tǒng)計(jì)肺轉(zhuǎn)移點(diǎn)數(shù)。

3.動物模型二

1）接種腫瘤細(xì)胞

六周齡雄性C57BL/6小鼠24只，體重18-22g，實(shí)驗(yàn)第一天，每只小鼠均尾靜脈注射B16F10黑色素瘤細(xì)胞2×10⁵個(gè)。

2）分組

將接種后的小鼠隨機(jī)分為2組（模型對照組、碳納米管組），每組12只。

3）分組處理

①模型對照組：接種24小時(shí)后，氣管滴注80 μl羧甲基纖維素鈉溶液；

②碳納米管組：接種24小時(shí)后，氣管滴注80 μl羧基化多壁碳納米管（4 mg/kg)；

4）每日稱小鼠體重

5）取肺組織，觀察肺轉(zhuǎn)移點(diǎn)數(shù)

注射腫瘤細(xì)胞后14天，處死小鼠，取肺組織，觀察并統(tǒng)計(jì)肺轉(zhuǎn)移點(diǎn)數(shù)。

（二）用蘇木精-伊紅染色法，檢測羧基化多壁碳納米管對腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用

1.?。ㄒ唬┲蟹谓M織，經(jīng)多聚甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋，5 μm切片。

2.切片常規(guī)用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級乙醇至水洗：二甲苯（I）5min→二甲苯（Ⅱ）5min→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸餾水洗2min。（各兩次，然后把水吸干）

3.蘇木素染色5min，自來水沖洗。（吸干水）

4.鹽酸乙醇分化30s（提插數(shù)下）。

5.自來水浸泡15min或溫水（約50℃）5min。（吸干水）

6.置伊紅液2min。

7.常規(guī)脫水，透明，封片：95％乙醇（I）min → 95％乙醇（Ⅱ）1min → 100％乙醇（I）1min → 100％乙醇（Ⅱ）1min → 二甲苯（I）1min → 二甲苯（Ⅱ）1min → 中性樹脂封固。

8.光鏡下觀察并做病理學(xué)評價(jià)。

（三）化學(xué)性剔除小鼠肺部巨噬細(xì)胞，以檢測巨噬細(xì)胞在碳納米管抗腫瘤中的作用

1.接種腫瘤細(xì)胞

六周齡雄性C57BL/6小鼠36只，體重18-22g，實(shí)驗(yàn)第一天，每只小鼠均尾靜脈注射Lewis肺癌細(xì)胞1×10⁵個(gè)。

2.分組

將接種后的小鼠隨機(jī)分為3組（模型對照組、碳納米管組、碳納米管+巨噬細(xì)胞剔除組），每組12只。

3.分組處理

①模型對照組：接種24小時(shí)后，氣管滴注80 μl羧甲基纖維素鈉溶液；

②碳納米管組：接種24小時(shí)后，氣管滴注80 μl羧基化多壁碳納米管（4 mg/kg)；

③碳納米管+巨噬細(xì)胞剔除組：接種24小時(shí)后，氣管滴注80 μl羧基化多壁碳納米管（4 mg/kg)，同時(shí)氣管滴注氯膦酸鹽脂質(zhì)體（6 mg/kg，3天/次）

4.每天觀察小鼠一般生存狀態(tài)并測量體重。

5.取肺組織，觀察肺轉(zhuǎn)移點(diǎn)數(shù)。

注射腫瘤細(xì)胞后14天，處死小鼠，取肺組織，觀察并統(tǒng)計(jì)肺轉(zhuǎn)移點(diǎn)數(shù)。

（四）結(jié)果

1.羧基化多壁碳納米管抑制腫瘤轉(zhuǎn)移

1）肺轉(zhuǎn)移點(diǎn)數(shù)

解剖小鼠，取出肺組織，觀察并統(tǒng)計(jì)肺轉(zhuǎn)移點(diǎn)數(shù)。結(jié)果表明，羧基化多壁碳納米管（在圖中簡稱CNT）劑量依賴性抑制Lewis肺癌肺轉(zhuǎn)移，高劑量時(shí)使肺轉(zhuǎn)移點(diǎn)數(shù)減少47.2 %，如圖1。同時(shí)，羧基化多壁碳納米管顯著性抑制黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移，使肺轉(zhuǎn)移點(diǎn)數(shù)下降46.6 %，如圖2。

2）蘇木精-伊紅染色

解剖小鼠，取出肺組織，石蠟包埋，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色。結(jié)果顯示，Lewis肺癌模型中，模型組肺組織細(xì)胞具有低分化非小細(xì)胞癌的典型特征，如核具有異形性、核深染以及高核質(zhì)比等，主要為腫瘤細(xì)胞；低劑量碳納米管組中具有腫瘤細(xì)胞特征的細(xì)胞目有降低趨勢，可見部分正常肺泡結(jié)構(gòu)；高劑量碳納米管組中大部分為正常肺泡組織，腫瘤細(xì)胞散在分布，如圖3A。與Lewis肺癌模型結(jié)果相似，B16F10黑色素瘤模型中，模型組肺組織多深染，細(xì)胞核大且不規(guī)則，大部分腫瘤細(xì)胞；碳納米管組中多見正常肺泡結(jié)構(gòu)，腫瘤細(xì)胞大大減少，如圖3B。

2. 羧基化多壁碳納米管不影響一般動物生存狀態(tài)及體重

小鼠生存狀態(tài)良好，實(shí)驗(yàn)期間未出現(xiàn)動物死亡。不同組別小鼠的飲食和活動狀態(tài)無明顯差異。結(jié)果顯示，在Lewis肺癌模型（圖4A）和B16F10黑色素瘤模型（圖4B）中，各組動物體重均無顯著性差異。

3.化學(xué)性剔除小鼠肺部巨噬細(xì)胞逆轉(zhuǎn)碳納米管抗腫瘤作用

解剖小鼠，取出肺組織，觀察并統(tǒng)計(jì)肺轉(zhuǎn)移點(diǎn)數(shù)。結(jié)果顯示，Lewis肺癌模型中，與碳納米管組相比，碳納米管+巨噬細(xì)胞剔除組的肺轉(zhuǎn)移點(diǎn)數(shù)增加95.7 %，即剔除小鼠肺部巨噬細(xì)胞逆轉(zhuǎn)碳納米管的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用，如圖5。

（五）結(jié)論

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，羧基化多壁碳納米管顯著性抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，且巨噬細(xì)胞在其中發(fā)揮重要的作用。

【實(shí)施例2】羧基化多壁碳納米管對腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞極化影響的檢測

（一）免疫熒光染色

1.?。ㄒ唬┲蠰ewis肺癌模型動物肺組織，經(jīng)多聚甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋，5 μm切片。

2.將石蠟切片浸沒在抗原修復(fù)緩沖液中(10 mM Tris, 0.5 mM EGTA水溶液, pH 9.0)，微波爐500 W加熱20分鐘。

3.石蠟切片在含有5%牛血清白蛋白(BSA)的PBS中孵育。

4.一抗4°C孵育過夜。

5.PBS洗滌3次，二抗室溫避光孵育1小時(shí)。

6. PBS洗滌3次，滴加DAPI染液，室溫避光孵育10min。

7. PBS洗滌3次，切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

8.使用顯微鏡數(shù)碼相機(jī)（DP80;OLYMPUSA,日本）鏡檢拍照。

（二）多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

1.取（一）中Lewis肺癌模型動物肺組織，使用Trizol試劑盒提取總RNA。

2.使用紫外分光光度儀檢測RNA樣品OD260和OD280，檢測總RNA純度和完整性。

3.使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提取將mRNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

4.配置如下反應(yīng)體系：2 μl cDNA模板，2 μl引物，12.5 μl SYBR溶液和8.5 μl超純水。

5.使用Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System進(jìn)行擴(kuò)增。

6.使用2?ΔΔCt方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

（三）結(jié)果

1.免疫熒光染色

解剖小鼠，取肺組織，石蠟包埋后進(jìn)行免疫熒光染色。結(jié)果如圖6，F(xiàn)4/80、iNOS和CD206分別是巨噬細(xì)胞、M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞的表型標(biāo)志物。結(jié)果顯示，與模型組相比，碳納米管組中表達(dá)iNOS的巨噬細(xì)胞比例顯著增加，表達(dá)CD206的巨噬細(xì)胞比例顯著降低。

2.多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

解剖小鼠，取肺組織，采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測肺組織巨噬細(xì)胞功能狀態(tài)。結(jié)果如圖7，羧基化多壁碳納米管劑量依賴性增加M1型巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物iNOS的基因表達(dá)，高劑量碳納米管組中iNOS基因表達(dá)增加近4倍；同時(shí)，羧基化多壁碳納米管劑量依賴性抑制M2型巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物CD206的基因表達(dá)，高劑量碳納米管組中CD206基因表達(dá)降低47.1 %。

（四）結(jié)論

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，羧基化多壁碳納米管顯著性促進(jìn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞由M2型重編程為M1型，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。

綜合以上實(shí)驗(yàn)的結(jié)果、結(jié)論，可以確信，羧基化多壁碳納米管是治療腫瘤轉(zhuǎn)移以及重編程腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞為M1型的有效藥物。