本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人dc-cik免疫活性細胞及其制備方法。

背景技術(shù)：

近年來我國惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率持續(xù)走高，在惡性腫瘤的治療中，手術(shù)、放療和化療三大常規(guī)治療，在控制腫瘤進展、延長患者生命、改善生存質(zhì)量方面發(fā)揮了重要作用，但還遠不夠完善。

現(xiàn)代免疫學研究證明腫瘤的發(fā)生發(fā)展和機體免疫缺陷有關(guān)。隨著上世紀八十年代重組細胞因子ifn-α被美國fda批準用于毛細胞白血病的治療，一系列細胞因子、單克隆抗體藥物、多肽蛋白疫苗以及細胞免疫治療技術(shù)等生物治療手段進入腫瘤的臨床治療方案，成為手術(shù)、化療和放療之外的第四類治療模式。

正常的機體免疫系統(tǒng)主要通過細胞免疫應(yīng)答發(fā)揮抗腫瘤免疫效應(yīng)，發(fā)揮免疫效應(yīng)的細胞包括腫瘤抗原特異性的t淋巴細胞(ctl)以及固有免疫系統(tǒng)的nk細胞等非特異免疫細胞。研究證明固有免疫系統(tǒng)的nk細胞可以識別并殺傷對化療和放療均不敏感的腫瘤干細胞(tallericoretal,jimmunol.2013；190(5):2381-90)，因此，非特異免疫細胞治療技術(shù)在腫瘤的綜合治療中顯示出重要的作用。

cik細胞，即細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokineinducedkiller)，與其它免疫細胞制劑相比cik具有細胞擴增數(shù)量多、抗腫瘤效果強而且毒副反應(yīng)更小的優(yōu)點。

dc細胞，即樹突狀細胞，是人體免疫系統(tǒng)中最為重要的高度專職化的主要抗原遞呈細胞，在誘導針對相關(guān)抗原的高效、特異性t細胞免疫應(yīng)答中起到 關(guān)鍵作用。

大量關(guān)于dc-cik的研究證明dc-cik比cik具有更強的細胞增值率，并能分泌更多的il-12、ifnγ等細胞因子，對腫瘤細胞的殺傷活性也更為強大，也證明了dc-cik細胞治療在腫瘤治療中的安全性和臨床療效，(wangmetal，plosone.2014；9(11):e112662.wangzxetal，worldjgastroenterol.2014；20(4):1095–106.wangdetal，bmccancer.2014；14:251.)。上海宇研生物技術(shù)有限公司經(jīng)過多年研究，建立了一種人dc-cik免疫活性細胞的制備方法(專利申請?zhí)?01310102720.4)，在保證效應(yīng)細胞比例和活力的情況下，制備更簡便，可重復性和安全性更高。使用該方法誘導擴增出的免疫細胞含有30％以上的nkt細胞，對腫瘤細胞的殺傷活性顯著高于cik細胞。

然而，dc-cik細胞治療依然存在靶向性不能覆蓋所有腫瘤細胞的問題。有些腫瘤細胞通過胞外小體分泌大量的可溶性nkg2d配體或在免疫壓力下以其它方式改變細胞表面的分子表達，逃避nk細胞等非特異免疫細胞的攻擊(schmidtjetal,cancerimmunolimmunother.2004；53(11):1018-26)。因而cik細胞或dc-cik細胞對腫瘤的控制效果仍然相當有限。

溶瘤病毒是具有復制能力的腫瘤殺傷性病毒，通過基因改造的溶瘤病毒能夠在惡性腫瘤細胞中特異性復制，并裂解腫瘤細胞，而對正常細胞沒有傷害。由于單獨的溶瘤病毒感染和裂解腫瘤細胞的效應(yīng)達不到100％，而痘苗病毒(痘病毒科)具有很多用于溶瘤病毒療法的理想病毒主鏈所必需的關(guān)鍵屬性，包括：只在胞漿復制而不會整合到宿主基因組中，對人體應(yīng)用安全性高，不會致癌；宿主范圍廣，可感染所有類型的哺乳動物細胞，可用于各種腫瘤的治療；基因組容量大，接近200kb，可插入25kb的外源基因而不影響其遺傳穩(wěn)定性；復制能力強，體外擴增簡便等。所以很多研究者研究溶瘤病毒攜帶外源基因以增強其抗腫瘤的效果：比如攜帶p53的重組痘苗病毒(rvv-p53)[timiryasovatm,etal，jgenemed2001；3(5):468-77.]，攜帶雙特異抗體(抗t細胞表面cd3分子以及腫瘤細胞表面epha2抗原)基因的痘苗溶瘤病毒(fengyuetal，moleculartherapy，10december2013)，攜帶gm-csf基因的wyeth株痘苗病毒(jx594)等，后者已被美國jennerex公司開發(fā)于2012年進入晚期肝癌治療 的ii期臨床研究，三個臨床i期研究證明jx549靜脈注射可以導致機體gm-csf水平的增加，既有溶瘤的作用也具有免疫治療的作用機制，能很好地激發(fā)腫瘤患者的免疫應(yīng)答，并且可以通過增加劑量提高對結(jié)腸癌、黑色素癌、卵巢癌和肝癌等多種腫瘤患者的病情控制效果。

白介素-24(il-24)是人體分泌的對腫瘤有抑制作用的細胞因子，對腫瘤細胞有特異性的生長抑制和凋亡誘導作用，可以促進血管內(nèi)皮細胞分化從而抑制腫瘤血管形成，同時通過刺激免疫系統(tǒng)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，而對正常細胞沒有或只有很低的殺傷作用，被譽為腫瘤治療的魔彈(fisherpb，cancerres.2005nov15；65(22):10128-38.，expertopinbiolther.2007may；7(5):577-86.)。

總之，痘苗溶瘤病毒由于其安全性和溶瘤能力在腫瘤的治療方面具有巨大的潛力，細胞免疫治療和細胞因子治療也都顯示出巨大的臨床應(yīng)用前景，但是單獨的痘苗溶瘤病毒治療或細胞免疫治療或細胞因子治療的療效都不夠理想。

因此，研發(fā)一種人dc-cik免疫活性細胞及利用高效的免疫殺傷細胞dc-cik細胞攜帶插入il-24基因的痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24定向殺傷惡性腫瘤的方法，將痘苗溶瘤病毒、細胞因子和免疫細胞的優(yōu)勢相結(jié)合，以產(chǎn)生顯著的協(xié)同效應(yīng)，為開發(fā)高效安全的臨床腫瘤治療技術(shù)或藥物提供新的方向，具有重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的單獨痘苗溶瘤病毒或免疫細胞或細胞因子治療的療效都不夠理想的問題，本發(fā)明提供了一種人dc-cik免疫活性細胞及人dc-cik免疫活性細胞負載痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24的方法，將痘苗溶瘤病毒、免疫細胞和細胞因子三者的優(yōu)勢相結(jié)合，產(chǎn)生顯著的協(xié)同效應(yīng)，從而發(fā)揮高效廣譜殺腫瘤作用，為開發(fā)高效安全的臨床腫瘤治療技術(shù)或藥物提供新的方向。

因此，本發(fā)明的第一個目的在于提供一種負載痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24的人dc-cik免疫活性細胞。

本發(fā)明的第二個目的在于提供制備所述人dc-cik免疫活性細胞的方法。

本發(fā)明第三個目的在于提供所述人dc-cik免疫活性細胞在作為臨床抗腫瘤免疫細胞治療技術(shù)和制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

為解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種人dc-cik免疫活性細胞，其特征在于，負載了痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24。

所述痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24通過痘苗溶瘤病毒融合il-24基因得到。

所述il-24基因插入所述痘苗溶瘤病毒的tk酶基因區(qū)。

所述人dc-cik免疫活性細胞通過所述痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24與dc-cik免疫活性細胞共培養(yǎng)得到。

所述痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24的制備包括以下步驟：

a、用雙酶酶切pcb質(zhì)粒及含有il-24基因的質(zhì)粒，然后通過t4連接酶連接，構(gòu)建pcb-il-24質(zhì)粒；

b、向接種了痘苗病毒的293細胞中轉(zhuǎn)染pcb-il-24質(zhì)粒，得到同源重組的痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24。

所述痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24的制備還包括以下步驟：

c、痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24的篩選；

d、用pcr方法分別取il-24基因的上下游基因序列和tk酶基因的上游和中游基因序列設(shè)計引物對痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24進行鑒定；

e、痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24的擴增。

所述步驟c中所述的il-24基因的上下游基因序列設(shè)計的引物為：

上游引物：5'-cgcgcgtaatacgactcact-3'，

下游引物：5'-gaaggcatcagtcggcttgcg-3'，

所述的tk酶基因的上游和中游基因序列設(shè)計的引物為：

上游引物：5'-tgtgaagacgataaattaatgatc-3'，

下游引物：5'-gtttgccatacgctcacag-3'。

所述步驟c中所述的pcr方法的反應(yīng)體系為：

所述步驟c中所述的pcr方法的反應(yīng)條件為：

所述的負載了痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24的人dc-cik免疫活性細胞在臨床抗腫瘤細胞治療技術(shù)和制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下有益效果：

1)負載痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24的dc-cik細胞與腫瘤細胞接觸，可以通過dc-cik細胞的殺瘤作用將病毒導入到腫瘤細胞發(fā)揮溶瘤作用并在腫瘤局部表達il-24發(fā)揮il-24的特異性抑癌作用，將痘苗溶瘤病毒的廣譜溶瘤活性、細胞因子的抗癌功能和免疫細胞的非特異殺傷機制的三重優(yōu)勢相結(jié)合，協(xié)同發(fā)揮高效的廣譜殺腫瘤作用(抗腫瘤作用不僅限于肝癌和肺癌，而適應(yīng)于各種惡性腫瘤)，其對腫瘤細胞的殺傷活性為dc-cik的160倍以上，而對正常細胞沒有毒性。

2)通過dc-cik細胞攜帶溶瘤病毒避免了血循環(huán)中的中和抗體對溶瘤病毒入侵腫瘤細胞的抑制作用，對提高溶瘤病毒的體內(nèi)療效，減少溶瘤病毒的副作用有重要意義，為開發(fā)高效安全的臨床腫瘤治療技術(shù)或藥物提供新的方向。

附圖說明：

圖1：雙酶切pcb質(zhì)粒示意圖。

圖2：同源重組構(gòu)建痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24流程圖。

圖3：痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24在腫瘤細胞和正常細胞(mrc-5)內(nèi) 的復制能力比較，圖中pfu為plaqueformingunit(空斑形成單位)，縱坐標代表pfu比率(腫瘤細胞/正常細胞)。

圖4：痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24在腫瘤細胞和mrc-5中表達抗癌因子il-24的能力比較，圖中β-tubulin為β微管蛋白。

圖5：不同濃度痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24對腫瘤細胞和mrc-5的殺傷活性，圖中，曲線從上至下，分別為mrc-5/1moi、mrc-5/0.5moi、a549/pbs、mrc-5/pbs、a549/0.5moi、a549/1moi。

圖6：dc-cik細胞中cd3+cd56+的nkt細胞比例檢測結(jié)果，圖中，橫坐標代表cd3表面標記物陽性的細胞量，縱坐標代表cd56表面標記物陽性的細胞含量。

圖7：dc-cik細胞對腫瘤細胞的殺傷活性。

圖8：感染痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24的dc-cik與dc-cik細胞的增值曲線比較；圖中，由上至下，分別為感染0moi、0.1moi、1moi、0.5moi的dc-cik細胞的增值曲線。

圖9：痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24在dc-cik細胞內(nèi)的增殖能力分析，圖中縱坐標pfu(plaqueformingunit，空斑形成單位)表示病毒滴度。

圖10：分別負載痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-241moi、10moi的dc-cik細胞、痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24及dc-cik細胞對肺癌腫瘤細胞的殺傷活性。

圖11：分別負載痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-240moi、0.1moi、0.5moi、1moi的dc-cik細胞，對肝癌腫瘤細胞的殺傷活性。

圖12：被負載痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24的dc-cik細胞殺傷的腫瘤細胞中il-24蛋白的表達，圖中，m：marker；n1：dc-cik細胞；n2：a549細胞；t1：0.5moi-24小時；t2：0.5moi-48小時；t3：0.5moi-72小時；t4：1moi-24小時；t5：1moi-48小時；t6：1moi-72小時；t7：0moi-24小時；t8：0moi-48小時；t9：0moi-72小時。

具體實施方式

以下通過具體實施例，對本發(fā)明做進一步詳細說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。

實施例1、痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24的構(gòu)建

1.1、pcb-il-24質(zhì)粒的構(gòu)建

合成il-24蛋白的基因序列，并在il-24基因序列的兩端加入bglⅱ和xbaⅰ酶切位點，利用限制性內(nèi)切酶bglⅱ和xbaⅰ，雙酶切pcb質(zhì)粒(顧懋治、江福美、蔡名杰、吳祥甫，重組質(zhì)粒pcb的構(gòu)建[j]，《生物化學與生物物理進展》，1980,7(4):46-48)及含有il-24基因的質(zhì)粒，利用膠回收方法回收pcb大片段及il-24基因片段，并純化，再將兩種純化后的基因片段按比例混合在一起，再加入t4連接酶，在4℃下過夜連接，構(gòu)建pcb-il-24質(zhì)粒。然后通過轉(zhuǎn)化dh5α感受態(tài)細胞，在37℃下過夜培養(yǎng)。挑取單克隆后，擴大培養(yǎng)并抽提相應(yīng)質(zhì)粒。選擇經(jīng)限制性內(nèi)切酶bglⅱ和xbaⅰ雙酶切鑒定為陽性的質(zhì)粒。

1.2、同源重組構(gòu)建痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24

在直徑6cm的培養(yǎng)皿內(nèi)接種適當數(shù)量的293細胞，向293細胞中接種1mlwr株痘苗病毒(美國atcc，型號vr-119)，于37℃，5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-2小時，按effectene公司試劑盒的說明書進行操作，轉(zhuǎn)染上述pcb-il-24質(zhì)粒，具體流程見圖1和圖2。待細胞完全病變后，將培養(yǎng)瓶在-80℃與室溫之間反復凍融，離心并收集上清液，得到同源重組構(gòu)建痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24液。

1.3、痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24的篩選

在直徑6cm的培養(yǎng)皿中接種適當數(shù)量的293細胞，使之在24h內(nèi)長滿培養(yǎng)皿。將1.2步驟中所得的病毒液稀釋不同的倍數(shù)，加入到培養(yǎng)皿中去感染293細胞。兩個小時后吸去懸浮的病毒液，鋪低熔點膠，9天后形成空斑。調(diào)取單個病毒空斑，在24孔板中小量擴增病毒，并采用qiagen公司的bloodkit提取病毒dna。

實施例2、痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24的鑒定

用pcr方法對同源重組的痘苗病毒中是否含有目的基因進行檢測，同時也為鑒定同源重組的痘苗病毒是否被野生病毒的污染，設(shè)計兩條引物，一條引物取il-24基因的上下游基因序列，一條引物取tk酶基因的上游和中游基因序列。

1)鑒定目的基因的引物為：

上游引物：5'-cgcgcgtaatacgactcact-3'，

下游引物：5'-gaaggcatcagtcggcttgcg-3'，

2)鑒定野生型病毒的引物為：

上游引物：5'-tgtgaagacgataaattaatgatc-3'，

下游引物：5'-gtttgccatacgctcacag-3'。

3)pcr反應(yīng)體系為：

4)pcr反應(yīng)條件為：

若病毒空斑的pcr產(chǎn)物含il-24基因且不含有tk酶基因，則空斑純化成功，所得痘苗溶瘤基因病毒重組成功，此過程重復一遍，得到痘苗溶瘤基因病毒oncopoxil-24。

實施例3、痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24的擴增

當293細胞長滿到培養(yǎng)皿的80％左右時，加入一定量的痘苗病毒，然后繼續(xù)放入37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。293細胞感染病毒2到3天后，收集293細胞，在-80℃和37℃之間反復凍融，裂解細胞，釋放病毒。最后利用密度梯度純化方法離心，并收集上清液。詳見氯化銫梯度離心純化病毒操作說明(microbixbiosysteminc)。

實施例4、痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24的滴度測定

將293細胞鋪于6孔板中，每孔加入1ml稀釋后的痘苗溶瘤基因病毒oncopoxil-24(稀釋比例分別為10^-4、10^-5、10^-6、10^-7)。37℃，培養(yǎng)2小時后，鋪低熔點膠(8ml)以移除培養(yǎng)基。兩天后計算每孔中的空斑數(shù)，并算出對應(yīng)的病毒滴度。

實施例5、痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24復制能力分析以及腫瘤細胞內(nèi)il-24表達能力的檢測

5.1、將正常細胞(mrc-5人胚肺成纖維細胞)和腫瘤細胞sw620(人結(jié)腸癌細胞)、a549(人肺腺癌細胞)和skov-3(人卵巢腺癌細胞)鋪于小瓶中，于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，接種1moi(病毒與細胞數(shù)量的比值)的痘苗基因病毒oncopox-il-24，感染48小時后，收集細胞，并在-80℃和37℃反復凍融3次，離心取上清液，檢測病毒滴度，結(jié)果如圖3所示。

圖3的結(jié)果顯示oncopox-il-24可以選擇性地在腫瘤細胞中復制，而在正常細胞中不復制或者少復制。

5.2、將5.1步驟收集的正常細胞mrc-5和腫瘤細胞a549的細胞沉淀并進行westernblot分析，檢測正常細胞mrc-5和腫瘤細胞a549中il-24蛋白的表達水平，結(jié)果如圖4所示。

圖4的結(jié)果顯示感染oncopox-il-24的腫瘤細胞和正常細胞都有表達β微管蛋白，oncopox-il-24可以在腫瘤細胞中大量表達抗癌因子il-24，而在正常細胞中則幾乎檢測不出il-24。

5.3、用不同劑量的oncopox-il-24感染人正常或者腫瘤細胞，分別于24、48、72小時檢測病毒對細胞的殺傷力，具體步驟如下：

按每孔10000個分別將正常細胞和腫瘤細胞鋪入96孔板，培養(yǎng)4小時后分別加入1moi、0.5moi的病毒或pbs，24小時后用cck8試劑盒(日本同仁化學研究所)檢測細胞的存活數(shù)，并計算殺傷率，結(jié)果如圖5所示。

圖5的結(jié)果顯示oncopox-il-24對腫瘤細胞有明顯的殺傷活性，隨著病毒劑量的增加和時間的延長腫瘤細胞存活率顯著下降，而正常人胚肺成纖維細胞的存活率沒有下降。

實施例6、非特異免疫活性細胞dc-cik的體外誘導

采用上海宇研生物技術(shù)有限公司建立的一種人dc-cik免疫活性細胞的制備方法(專利申請?zhí)?01310102720.4)。

6.1dc-cik細胞制備

采集患者外周血，經(jīng)人淋巴細胞分離液密度梯度離心分離出單個核細胞(pbmc)，將pbmc接種到gt551無血清培養(yǎng)液(購自日本takara公司)，調(diào)整細胞濃度為1×10⁶(u/ml)，添加ifn-γ(1000u/ml)、il-2(500u/ml)、抗cd3單抗(20ng/ml)、il-4(1000u/ml)、gm-csf(500u/ml)，在37℃，5％co2條件下培養(yǎng)5天后即可誘導出未成熟的dc細胞，再加入tnfα(500u/ml)使dc成熟。7天后加入含il-2(500u/ml)的培養(yǎng)液隔天傳代培養(yǎng)7天，收集得到dc-cik細胞。

6.2dc-cik細胞表型測定

將培養(yǎng)15天的dc-cik細胞應(yīng)用fitc標記抗人cd分子單抗，然后與dc-cik細胞表面cd結(jié)合，測試dc-cik免疫效應(yīng)細胞cd3+cd56+的百分率，具體操作如下：

取一定體積的細胞(細胞總數(shù)為1×10⁶/ml)懸液于流式細胞儀測試管中，離心，棄上清液，保留細胞。按照美國bectondickinson公司的標記抗體使用說明，將抗人的cd3-fitc、抗cd56-pe加入測試管中，混勻，4℃、孵育30分鐘，然后1000rmp離心3min，用pbs洗滌細胞三次，然后再懸浮于0.5mlpbs 中，經(jīng)流式細胞儀測試，結(jié)果見圖6。

圖6表明，誘導的dc-cik細胞中cd3+cd56+的nkt細胞比例為37.76％。

6.3dc-cik細胞對腫瘤細胞的殺傷活性測定

按每孔10000個將a549細胞鋪入96孔板，培養(yǎng)4小時后，分別加入效靶比為5、10和20的dc-cik細胞，24小時后用cck8試劑盒檢測腫瘤細胞的存活數(shù)，并計算殺傷率，結(jié)果見圖7。

由圖7可以看出，dc-cik細胞對腫瘤細胞有顯著的殺傷作用，在10：1的效靶比(dc-cik細胞與腫瘤細胞的比值)時，對腫瘤細胞的殺傷率為38％。

實施例7、痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24入侵dc-cik細胞后病毒和dc-cik細胞的復制能力的分析

7.1取誘導培養(yǎng)到第11天的dc-cik細胞，調(diào)整到2×10⁶個細胞/毫升分裝到培養(yǎng)瓶中，分別將oncopox-il-24以1moi、0.5moi、0.1moi及0moi的濃度感染dc-cik細胞，加入gt551無血清培養(yǎng)液(購自日本takara公司)和500u/ml的il-2，放入37℃的5％co2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72、96、120和144小時，分別取出2×10⁶個細胞，離心，并使細胞重懸在1ml新鮮培養(yǎng)基中。同時記錄感染病毒與未感染病毒的免疫細胞的增殖曲線，結(jié)果見圖8。

由圖8可以看出，oncopox-il-24感染dc-cik細胞后，dc-cik細胞的增值在前四天基本沒有變化，至第六天略有下降，但顯微鏡下細胞形態(tài)基本沒有變化，說明痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24對dc-cik細胞的生長沒有顯著的不良影響。

7.2將7.1收集的痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24入侵的dc-cik細胞在-80℃和37℃之間反復凍融，裂解細胞，釋放病毒，離心并收集上清液，檢測上清液中的病毒滴度，結(jié)果見圖9。

由圖9可以看出，以感染1moi病毒后的dc-cik細胞內(nèi)的病毒總量為例，病毒在感染到dc-cik細胞的前48小時基本沒有增殖，至第72至96小時發(fā)生較大的增殖，120小時以后由于細胞數(shù)量擴增至5倍以上，病毒滴度顯示下降，說明病毒不再顯著增殖。

實施例8、負載痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24的dc-cik細胞對腫瘤細胞的殺傷能力分析

8.1對肺癌細胞a549殺傷能力的分析

取已刺激成熟的dc-cik細胞，按照不同的效靶比分裝到幾個培養(yǎng)瓶中，將oncopox-il-24分別以10moi、1moi、和0moi三個劑量感染dc-cik細胞，然后將感染后的dc-cik細胞放入37℃5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時后，用cck8法檢測其對肺癌a549細胞的殺傷活性，并與單純的oncopox-il-24對肺癌a549細胞的殺傷活性進行比較，結(jié)果見圖10。

由圖10可以看出，dc-cik細胞最高效靶比40：1時(即40個dc-cik細胞比1個腫瘤細胞)對腫瘤細胞的殺傷率只能達到85％，而負載1moi痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24的dc-cik細胞在10：1效靶比即可全部殺傷腫瘤細胞，負載10moi痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24的dc-cik細胞在5：1效靶比也可全部殺傷腫瘤細胞。

比較負載不同劑量oncopox-il-24的dc-cik細胞對腫瘤細胞的殺傷活性，可以看出，dc-cik細胞殺傷42％腫瘤細胞(最高殺傷率的50％)的效靶比為10：1，負載1moioncopox-il-24的dc-cik細胞殺傷42％腫瘤細胞的效靶比為0.5：1，而負載10moioncopox-il-24的dc-cik細胞殺傷42％腫瘤細胞的效靶比為0.0625：1，由此計算，負載1moi和10moi痘苗溶溜基因病毒oncopox-il-24的dc-cik細胞對腫瘤細胞的殺傷活性比dc-cik細胞分別提高了20和160倍。

8.2對肝癌細胞huh7殺傷能力的分析

取已刺激成熟，并培養(yǎng)到第11天的dc-cik細胞，按照不同的效靶比分裝到幾個培養(yǎng)瓶中。將oncopox-il-24分別以1moi、0.5moi和0.1moi三個劑量感染dc-cik細胞，然后將感染后的dc-cik細胞放入37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72小時后檢測其對肝癌細胞huh7的殺傷活性，并與單純的dc-cik細胞對肝癌細胞huh7的殺傷活性進行比較，結(jié)果見圖11。

由圖11可以看出，低于1moi的oncopox-il-24感染的dc-cik細胞對肝 癌huh7細胞仍有顯著的殺傷力，其中0.5moi和1moi感染的dc-cik細胞在2.5倍效靶比時可以殺傷90％以上的腫瘤細胞，而單獨的dc-cik細胞在2.5倍效靶比時的殺傷力低于5％。

實施例9、負載oncopox-il-24的dc-cik對腫瘤細胞的殺傷過程中，腫瘤細胞il-24蛋白表達量的分析

取適量已刺激成熟，并培養(yǎng)到第11天的dc-cik細胞，平均分裝到10個培養(yǎng)瓶中，將oncopox-il-24以1moi和0.5moi劑量感染dc-cik細胞，然后將感染后的dc-cik細胞放入37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72小時后，以10倍效靶比的比例加入鋪有a549腫瘤細胞的96孔板中，分別于24、48、72小時后，裂解所有細胞并離心收集上清液，得到樣本t1(0.5moi-24小時)、t2(0.5moi-48小時)、t3(0.5moi-72小時)、t4(1moi-24小時)、t5(1moi-48小時)、t6(1moi-72小時)、t7(0moi-24小時)、t8(0moi-48小時)、t9(0moi-72小時)。以未感染oncopox-il-24病毒(0moi)的dc-cik細胞的殺傷樣品作為陰性對照(n1、t7、t8和t9)，以a549細胞作為空白對照n2，用westblot方法檢測細胞il-24蛋白的表達含量，結(jié)果見圖12。

圖12的結(jié)果顯示，負載oncopox-il-24的dc-cik細胞與腫瘤細胞共培養(yǎng)后，在腫瘤細胞裂解液和分泌上清液中均可以檢測到il-24，且隨著oncopox-il-24病毒劑量的增加和殺傷時間的延長，il-24的表達量也有所上升。

綜上所述，本發(fā)明的人dc-cik免疫活性細胞負載痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24的方法，是向痘苗溶瘤病毒tk酶基因區(qū)插入抑癌因子il-24基因，得到痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24，并將痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24與高效的免疫殺傷dc-cik細胞聯(lián)合應(yīng)用，利用痘苗病毒tk酶缺失后只能在高度增殖的細胞中復制的特性，將溶瘤病毒、細胞因子和免疫細胞的優(yōu)勢相結(jié)合，具有顯著的協(xié)同效應(yīng)，同時通過dc-cik細胞攜帶溶瘤病毒避免了血循環(huán)中的中和抗體對溶瘤病毒入侵腫瘤細胞的抑制作用，提高了溶瘤病毒的體內(nèi)療效，減少了溶瘤病毒的副作用，為開發(fā)高效安全的臨床腫瘤治 療技術(shù)或藥物提供新的方向。

雖然以上實施例僅對肺癌和肝癌細胞的殺傷力及腫瘤細胞il-24蛋白表達量進行了分析，但由于痘苗病毒的廣譜溶瘤活性和dc-cik細胞的非特異殺傷機制，本發(fā)明的方法制備的負載痘苗溶瘤基因病毒oncopox-il-24的人dc-cik免疫活性細胞的作用不限于肝癌和肺癌，其殺傷腫瘤的范圍適應(yīng)于各種惡性腫瘤，這是顯而易見的。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對該實用進行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。