懸浮細胞球免疫熒光染色方法及染色裝置的制造方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于一種對測試用樣品著色的方法，具體涉及一種懸浮細胞球免疫熒光染色方法及染色裝置。
【背景技術】
[0002]免疫熒光染色技術是常用細胞與分子生物學實驗方法，它應用抗原-抗體反應原理，以熒光物質標記抗體而進行抗原定位，用于觀察目的蛋白的表達以及蛋白間是否存在共定位或共表達關系。
[0003]對于多見的貼壁細胞免疫熒光染色，常用且普遍采用的是使細胞“爬片”于多聚賴氨酸包被的載體表面，然后進行經典的染色操作。然而對于在干細胞研究中常用的懸浮細胞球，因為它不貼壁，所以在經典的實驗操作過程中極易造成細胞球的丟失。盡管現(xiàn)有文獻報道使用多聚賴氨酸包被的蓋玻片即可將懸浮細胞球粘附于蓋玻片[卜3]，但實際操作結果并非如此，即使使用多聚賴氨酸包被的蓋玻片，仍僅有10%~20%細胞球會粘附于蓋玻片表面，且其中95%以上的細胞球會在經典操作過程中丟失，最終導致樣本量過少而實驗失敗。
[0004]針對懸浮細胞的不貼壁性，現(xiàn)有文獻報道了多種可用于懸浮細胞球的免疫熒光染色方法。
[0005]中國專利文獻CN102288471B公開了一種懸浮細胞的免疫熒光染色方法，該方法適用于懸浮細胞，完成實驗至少需要10次以上細胞離心，此種方法不僅耗費時間和人力，而且將此種方法應用于懸浮細胞球時，由于細胞球的內層細胞和外層細胞表型不同，多次離心可使外層細胞脫離，損壞細胞球的結構和細胞組成，致最終檢測的細胞球構成與實驗操作前不同，影響實驗結果的準確性。
[0006]還有文獻報道用含10%血清培養(yǎng)基培養(yǎng)2h~4h可有助于細胞球粘附于蓋玻片[1'2^6]。此種方法雖然克服了細胞球的不貼壁性，但細胞球需要在無血清條件下培養(yǎng)才能維持其表型，有血清培養(yǎng)會促進細胞球細胞分化m，改變其表型，干擾最終實驗結果。且根據(jù)實驗觀察，細胞球于10%血清培養(yǎng)基培養(yǎng)30分鐘即出現(xiàn)明顯形態(tài)變化，細胞球外層細胞脫離細胞球并貼壁，說明細胞球已經發(fā)生表型改變，細胞組成由于有血清培養(yǎng)而被破壞。
[0007]Geraldo, S.等人研究發(fā)現(xiàn)將細胞球固定于膠原蛋白凝膠中確實可以保證細胞球不丟失M，但此種方法仍然存在缺陷:首先，凝膠中的膠原蛋白纖維會起到遮擋作用，影響共聚焦顯微鏡的激發(fā)光強度和穿透距離；其次，為了達到同樣的染色效果，染色過程中需要抗體工作液濃度加倍甚至三倍，并延長抗體孵育時間，增加了消耗的時間和實驗經費M。
[0008]Guerrero-Cazares, Η.等人研究將細胞球應用OCT包埋劑包埋制成冰凍組織切片再行免疫熒光染色[1°]，此種方法的缺點在于需要冰凍切片機，冰凍組織的切片需要具備專業(yè)技術的人員制備，且切片的過程中難以找到有細胞球的層面針對性取材，實驗步驟繁瑣，耗費時間很長。
[0009]參考文獻
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【發(fā)明內容】

[0010]本發(fā)明是為了克服現(xiàn)有技術中存在的懸浮細胞球不貼壁生長難以制樣以及現(xiàn)有懸浮細胞球免疫熒光染色方法存在的各種缺點而提出的，其目的是提供一種懸浮細胞球免疫熒光染色方法及染色裝置。
[0011]本發(fā)明的技術方案是:
一種懸浮細胞球免疫熒光染色方法，所述染色方法包括以下步驟:
(i)組合細胞小室和染色套件，取細胞球懸液加入細胞小室，棄染色套件內培養(yǎng)基，清洗細胞球；
(ii)向細胞小室中加入組織細胞固定液固定，棄染色套件內液體，清洗細胞球；
(iii)向細胞小室中加入TritonX-100通透細胞，棄染色套件內液體，清洗細胞球；
(iv)向細胞小室中加入封閉液封閉，孵育，棄染色套件內液體；
(v)向細胞小室中加入抗目的蛋白的一抗工作液，孵育，恢復至室溫，回收染色套件內一抗工作液，清洗細胞球； (vi)向細胞小室中加入抗一抗的熒光二抗工作液，孵育，棄染色套件(2)內液體，清洗細胞球；
(vii)向細胞小室中加入DAPI染液染色細胞核，棄染色套件內液體，清洗細胞球。
[0012]所述清洗細胞球的方法為重組細胞小室和染色套件，向細胞小室中加入200ulPBS清洗細胞球，靜置5min，拔下染色套件，棄染色套件內PBS，重復操作三次。
[0013]所述步驟(vii)完成染色后，重組細胞小室和染色套件，向細胞小室中加入150ulPBS，置于濕盒中4 °C避光保存。
[0014]所述步驟(ii)中組織細胞固定液為多聚甲醛，多聚甲醛的加入量為lOOul，其質量濃度為4%，多聚甲醛固定時間為lOmin。
[0015]所述步驟(iii)中Triton X-100的加入量為lOOul，其質量濃度為0.2%,TritonX-100通透細胞的時間為lOmin。
[0016]所述步驟(iv)中封閉液為山羊血清，山羊血清的加入量為lOOul，其質量濃度為
2% ο
[0017]所述步驟(vi)中抗一抗的熒光二抗工作液的加入量為lOOul。
[0018]所述步驟(vii)DAPI染液的加入量為100ul，DAPI染液染色細胞核的時間為5min。
[0019]所述步驟(iv)中孵育的方法為置于濕盒中于37°C下孵育lh ;所述步驟(V)中孵育的方法為置于濕盒中4°C孵育過夜；所述步驟(vi)中孵育的方法為于濕盒中37°C避光孵育2ho
[0020]一種懸浮細胞球免疫熒光染色裝置，包括細胞小室，所述細胞小室為上端敞口的圓臺型結構，細胞小室的底面為有機材料膜，還包括套裝于細胞小室下端外部的染色套件，染色套件是中空且上端敞口的圓臺型結構，中部形成內底，內底為下陷的圓錐面。
[0021]本發(fā)明的有益效果是: