一種細胞中葛根素分布差異熒光檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學領(lǐng)域，具體涉及一種細胞中葛根素分布差異熒光檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 由于大腦組織的復雜性，藥物在腦部不同種類神經(jīng)細胞中的分布差異研究是神經(jīng) 藥理學研究的一大難題。葛根素是中藥葛根的主要藥效成分，現(xiàn)代藥理學研究表明，葛根素 對6-羥多巴胺、D-半乳糖、H202、缺氧復氧等各種因素誘導的阿爾茨海默癥、帕金森病、缺血 /再灌注損傷等動物模型及原代培養(yǎng)的神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞及其它神經(jīng)細胞系細胞等細胞模 型具有明顯的保護活性，其機制包括減輕線粒體氧化應激、抗細胞凋亡、減輕神經(jīng)細胞興奮 性毒性及促進細胞增殖等。盡管葛根素的神經(jīng)保護作用已被廣泛證實，但其在神經(jīng)系統(tǒng)的 靶細胞及作用靶位仍不清晰，目前尚未見葛根素在不同種類神經(jīng)細胞間分布差異的報道。
[0003] HPLC、UPLC-MS/MS、毛細管電泳及流動注射化學發(fā)光法等方法已經(jīng)普遍用于不同 組織樣品中葛根素的含量分析，但這些方法存在成本較高、耗時較長等缺點?；谄洚慄S酮 類化學結(jié)構(gòu)，紫外光源下葛根素可發(fā)射藍色熒光，S.Michihara(2011)建立了葛根中葛根素 含量測定的熒光分光光度法，但尚未見該法應用于細胞中葛根素含量檢測的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的之一是為解決細胞中葛根素分布差異檢測困難，成本高，耗時長的 問題，提供一種方便快捷的細胞中葛根素分布差異熒光檢測方法。
[0005] 本發(fā)明提供一種細胞中葛根素分布差異熒光檢測方法，包括以下步驟：
[0006] 在細胞培養(yǎng)體內(nèi)加入葛根素；
[0007] 收集細胞并制備樣品；
[0008] 將所述樣品以xex/em為342/461nm，激發(fā)狹縫10nm，發(fā)射狹縫10nm的條件，用焚 光分光光度法檢測葛根素含量。
[0009] 進一步的，所述制備樣品包括清洗細胞、消化細胞、重懸細胞和破碎細胞。
[0010] 進一步的，所述清洗細胞方法為，以0.Olmol/L的PBS清洗兩次，每次0. 5min。
[0011] 進一步的，所述消化細胞方法為采用0. 25%胰蛋白酶-EDTA= 1:1的復合消化液 進行細胞消化。
[0012] 進一步的，所述重懸細胞方法為以0. 01mol/L的PBS重懸細胞至細胞密度為 5X105個/mL，終體積為2mL。
[0013] 進一步的，所述破碎細胞方法為超聲破碎。
[0014] 進一步的，所述加入葛根素終濃度為1000ng/mL。
[0015] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明的細胞中葛根素分布差異熒光檢測方法具有較好 的專屬性、精密度、回收率及線性關(guān)系，并具有簡便、快捷及成本較低的優(yōu)點，可用于不同細 胞中葛根素含量的檢測。本研究發(fā)現(xiàn)，在新生大鼠原代神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)體及 單獨培養(yǎng)細胞內(nèi)，葛根素星形膠質(zhì)細胞中濃度較低，在神經(jīng)元中的濃度更高。當葛根素加入 60min到90min時，單獨培養(yǎng)及共細培養(yǎng)體中的星形膠質(zhì)細胞中未檢出葛根素，而神經(jīng)元中 葛根素維持在12. 8ng/mL，且在觀察時間120min內(nèi)一直未被細胞完全排出。葛根素在神經(jīng) 元中的分布濃度和時間始終高于在星形膠質(zhì)細胞中的分布，這無疑對于神經(jīng)元的保護和修 復作用有利，也從另一個角度揭示了葛根素對腦保護臨床療效的作用基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0016] 圖1所示為本發(fā)明細胞中葛根素分布差異熒光檢測方法葛根素激發(fā)光譜；
[0017] 圖2所示為本發(fā)明細胞中葛根素分布差異熒光檢測方法葛根素342nm發(fā)射光譜；
[0018] 圖3所示為本發(fā)明細胞中葛根素分布差異熒光檢測方法專屬性細胞提取液吸收 曲線；
[0019] 圖4所示為本發(fā)明細胞中葛根素分布差異熒光檢測方法線性標準曲線；
[0020] 圖5所示為本發(fā)明細胞中葛根素分布差異熒光檢測方法測得不同培養(yǎng)時間下兩 種細胞內(nèi)葛根素的濃度變化。
【具體實施方式】
[0021] 下文將結(jié)合具體附圖詳細描述本發(fā)明具體實施例。應當注意的是，下述實施例中 描述的技術(shù)特征或者技術(shù)特征的組合不應當被認為是孤立的，它們可以被相互組合從而達 到更好的技術(shù)效果。
[0022] 熒光檢測方法建立：
[0023] 1、掃描檢測波長：將不含葛根素的神經(jīng)元細胞與星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)物按1 :1的比 例混合，以0.Olmol/L的PBS清洗2次，每次0. 5min。清洗后的細胞用0. 25%胰蛋白酶-EDTA =1:1的復合消化液消化細胞。再以〇.Olmol/L的PBS重懸細胞至密度為5X105個/mL， 終體積為2mL。超聲破碎細胞，1. 5X104(Xg)離心20min，得到細胞提取液。向細胞提取 液中加入葛根素至終濃度為50ng/mL，用以檢測最大激發(fā)波長和發(fā)射波長，激發(fā)與發(fā)射狹縫 均為10nm。經(jīng)測定，葛根素的Aex/em為342/461nm。葛根素激發(fā)光譜如圖1所示，葛根素 342nm發(fā)射光譜如圖2所示。
[0024] 2、建立檢測方法：以不含葛根素的細胞提取液考察方法的專屬性，專屬性細胞提 取液吸收曲線如圖3所示。以細胞提取液配制6. 25,12. 5, 25, 50,100ng/mL葛根素標準品 溶液并建立標準曲線，線性關(guān)系為y= 4. 5107x-0. 375，R2= 0. 9978,標準曲線如圖4所示。 檢測限為3. 45ng/mL。以6. 25, 25,100ng/mL標準葛根素溶液考察方法的精密度與回收率。 精密度和回收率如表1所示。
[0025] 表1熒光分光光度法的精密度與回收率上SD，n==5)
[0026]
[0027] 3、細胞內(nèi)葛根素濃度檢測：在受試細胞培養(yǎng)體內(nèi)加入葛根素至終濃度為lOOOng/ mL。在藥物加入后的0,10,20,30,60,90min收集細胞。每個時間點收集的細胞以0.Olmol/ L的PBS清洗2次，每次0. 5min。清洗后的細胞用0. 25%胰蛋白酶-EDTA= 1:1的復合消 化液消化細胞。再以0. 01m〇l/L的PBS重懸細胞至密度為5X105個/mL，終體積為2mL。超 聲破碎細胞，1. 5X104(Xg)離心20min后用熒光分光光度計檢測葛根素含量，熒光條件為 入ex/em為342/461nm，入射狹縫10nm，激發(fā)狹縫10nm。
[0028] 葛根素在受試細胞中的濃度變化如圖5所示。與星形膠質(zhì)細胞相比，單獨培養(yǎng)及 共培養(yǎng)神經(jīng)元中葛根素具有更高的峰濃度及更長的分布時間，當藥物與細胞共培養(yǎng)60min 到90min時，星形膠質(zhì)細胞內(nèi)未見藥物檢出，而神經(jīng)元內(nèi)葛根素維持在12. 80ng/mL。
[0029] 本發(fā)明的細胞中葛根素分布差異熒光檢測方法具有較好的專屬性、精密度、回收 率及線性關(guān)系，并具有簡便、快捷及成本較低的優(yōu)點，可用于不同細胞中葛根素含量的檢 測。本研究發(fā)現(xiàn)，在新生大鼠原代神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)體及單獨培養(yǎng)細胞內(nèi)，葛 根素星形膠質(zhì)細胞中濃度較低，在神經(jīng)元中的濃度更高。當葛根素加入60min到90min 時，單獨培養(yǎng)及共細培養(yǎng)體中的星形膠質(zhì)細胞中未檢出葛根素，而神經(jīng)元中葛根素維持在 12. 8ng/mL，且在觀察時間120min內(nèi)一直未被細胞完全排出。葛根素在神經(jīng)元中的分布濃 度和時間始終高于在星形膠質(zhì)細胞中的分布，這無疑對于神經(jīng)元的保護和修復作用有利， 也從另一個角度揭示了葛根素對腦保護臨床療效的作用基礎(chǔ)。
[0030] 本文雖然已經(jīng)給出了本發(fā)明的一些實施例，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應當理解，在 不脫離本發(fā)明精神的情況下，可以對本文的實施例進行改變。上述實施例只是示例性的，不 應以本文的實施例作為本發(fā)明權(quán)利范圍的限定。
【主權(quán)項】
1. 一種細胞中葛根素分布差異熒光檢測方法，其特征在于，包括以下步驟： 在細胞培養(yǎng)體內(nèi)加入葛根素； 收集細胞并制備樣品； 將所述樣品以X ex/em為342/461nm，激發(fā)狹縫10nm，發(fā)射狹縫IOnm的條件，用焚光分 光光度法檢測葛根素含量。2. 如權(quán)利要求1所述的細胞中葛根素分布差異熒光檢測方法，其特征在于，所述制備 樣品包括清洗細胞、消化細胞、重懸細胞和破碎細胞。3. 如權(quán)利要求2所述的細胞中葛根素分布差異熒光檢測方法，其特征在于，所述清洗 細胞方法為，以〇. Olmol/L的PBS清洗兩次，每次0. 5min。4. 如權(quán)利要求2所述的細胞中葛根素分布差異熒光檢測方法，其特征在于，所述消化 細胞方法為采用〇. 25%胰蛋白酶-EDTA = 1:1的復合消化液進行細胞消化。5. 如權(quán)利要求2所述的細胞中葛根素分布差異熒光檢測方法，其特征在于，所述重懸 細胞方法為以〇. Olmol/L的PBS重懸細胞至細胞密度為5 X IO5個/mL，終體積為2mL。6. 如權(quán)利要求2所述的細胞中葛根素分布差異熒光檢測方法，其特征在于，所述破碎 細胞方法為超聲破碎。7. 如權(quán)利要求1-6任一項所述的細胞中葛根素熒光檢測方法，其特征在于，所述加入 葛根素終濃度為l〇〇〇ng/mL。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種細胞中葛根素分布差異熒光檢測方法，包括以下步驟：在細胞培養(yǎng)體內(nèi)加入葛根素；收集細胞并制備樣品；將所述樣品以λex/em為342/461nm，激發(fā)狹縫10nm，發(fā)射狹縫10nm的條件，用熒光分光光度法檢測葛根素含量。本發(fā)明的細胞中葛根素分布差異熒光檢測方法具有較好的專屬性、精密度、回收率及線性關(guān)系，并具有簡便、快捷及成本較低的優(yōu)點，可用于不同細胞中葛根素含量的檢測。
【IPC分類】G01N21/64
【公開號】CN105021583
【申請?zhí)枴緾N201510424839
【發(fā)明人】魏述永, 徐曉玉, 吳俊偉, 劉娟, 陳紅偉, 華玲
【申請人】西南大學
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年7月16日