在單個樣品上的免疫熒光和基于熒光的核酸分析的制作方法
【專利摘要】提供單個生物樣品的合成圖像的方法，包括以下步驟：產(chǎn)生所述生物樣品的第一圖像，產(chǎn)生所述生物樣品的第二圖像，和產(chǎn)生提供靶蛋白和靶核酸兩者的相對位置的合成圖像。還提供的是分析生物樣品的方法，包括按照提供合成圖像的方法提供所述生物樣品的合成圖像，和根據(jù)所述合成圖像分析蛋白表達(dá)和目標(biāo)核酸序列。進(jìn)一步提供的是包括用于進(jìn)行所述新方法的工具的系統(tǒng)和試劑盒。
【專利說明】在單個樣品上的免疫熒光和基于熒光的核酸分析 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及在生物樣品上對蛋白表達(dá)和靶核酸序列的檢測。更具體地講，本發(fā)明 涉及能夠在生物樣品的同一切片上進(jìn)行蛋白表達(dá)和靶核酸序列的熒光檢測的方法。還提供 的是用于進(jìn)行所述新方法的試劑盒和系統(tǒng)。
[0002] 發(fā)明背景 大部分疾病具有不同類型的表型，并且需要復(fù)雜的表征，用于患者評價。例如，乳腺 癌由5種不同亞型組成，每種亞型都涉及不同表型、生存時間和治療反應(yīng)性。例如，管腔型 (luminal type)具有最好的預(yù)后并對激素治療有良好反應(yīng)，而HER2-陽性和基底腫瘤的患 者卻發(fā)展不良。盡管目前靶向療法的發(fā)展已經(jīng)顯著地影響了 HER2-陽性腫瘤的治療，但是 這些患者中的許多都不反應(yīng)，或發(fā)展出抗性。在這些案例中的許多案例中，已經(jīng)鑒定了 HER2 基因中的突變或其它途徑（例如PI3K/AKT)的活化，并且已經(jīng)提出了同時靶向正常的和突 變的HER2的新的療法或者還影響其它途徑的組合療法。另外，若干研宄甚至已經(jīng)指出，在 不同乳癌亞型中的相同基因的變化可能差異地影響疾病進(jìn)程和治療反應(yīng)兩者。因此，對患 者腫瘤的綜合分析（comprehensive profiling)對于醫(yī)生能夠為該患者做出最佳治療決策 而言是至關(guān)重要的。
[0003] 在一部分乳腺癌患者中，擴(kuò)增HER2基因作為惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)展過程的部分。 HER2基因擴(kuò)增通常導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞表面上的HER2蛋白過量表達(dá)。在25-30%的乳腺癌中已 經(jīng)證明了 HER2基因的擴(kuò)增和/或其蛋白的過量表達(dá)。若干研宄已經(jīng)證明HER2狀態(tài)與對某 些化學(xué)治療方案的敏感性或抗性有關(guān)。高HER2蛋白過量表達(dá)或HER2基因擴(kuò)增的表現(xiàn)對于 啟動用Herceptin (針對HER2蛋白的一種單克隆抗體）的療法是必不可少的。臨床研宄 已經(jīng)證明，具有高HER2蛋白過量表達(dá)和/或HER2基因擴(kuò)增的腫瘤的患者從Here印tinHER2 蛋白水平和HER2基因擴(kuò)增。然而，兩種患者樣品常規(guī)用于進(jìn)行IHC和FISH分析，可能導(dǎo)致 兩種結(jié)果之間缺少一致性。理想的是，在同一樣品上和在細(xì)胞-細(xì)胞水平上同時進(jìn)行這兩 種分析。
[0004] 在胃或胃-食管結(jié)合處的晚期或轉(zhuǎn)移癌的患者中，大約20%具有HER2-陽性疾病。 與未分化的癌癥和混合腫瘤相比，腺癌更常見為HER2-陽性；與胃腫瘤相比，胃-食管結(jié)合 處癌癥更有可能為HER2-陽性。已經(jīng)證明曲妥單抗?改善了 HER2-陽性的胃或胃-食管結(jié) 合處的晚期或轉(zhuǎn)移性癌癥患者的生存率。研宄表明基因擴(kuò)增（FISH)和蛋白過量表達(dá)（使 用免疫熒光檢測）與乳腺癌的關(guān)聯(lián)不一樣，因此不應(yīng)該用單一方法來確定HER-2狀態(tài)。
[0005] 盡管多種方法可用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)，以觀察生物樣品中的不同靶標(biāo)，但是許多現(xiàn) 有技術(shù)在單個樣品中在同一時間內(nèi)僅可檢測少量靶標(biāo)（例如免疫熒光（IF)，其中可檢測的 靶標(biāo)數(shù)量受限于基于熒光的檢測系統(tǒng)）。對靶標(biāo)的進(jìn)一步分析可能需要使用來自來源的額 外的生物樣品，限制了測定靶標(biāo)的相對特性（例如生物樣品中的多個生物靶標(biāo)的存在、不 存在、濃度和/或空間分布）的能力。此外，在某些情況下，可以得到有限量的樣品用于分 析或者可能需要單個樣品用于進(jìn)一步分析其它目標(biāo)蛋白，例如細(xì)胞周期或其它癌癥生物標(biāo) 記。因此，需要能夠反復(fù)分析單個樣品的方法、試劑和裝置。
[0006] 若干實驗室已經(jīng)試圖在單個樣品上組合蛋白表達(dá)和基于DNA的分析。Lottner等 人描述了一個方案，其在單個組織樣品上先進(jìn)行FISH，再進(jìn)行HER2的IF，接著進(jìn)行圖像分 析。JPathol. 2005 ;205 (5) :577-84 ;doi: 10. 1002/path. 1742。作者注意到，在 FISH 之 前進(jìn)行IF導(dǎo)致較高的熒光背景和較弱的免疫熒光。Reisenbichler等人在單個樣品上對于 HER2進(jìn)行了免疫組織化學(xué)（IHC)和顯色原位雜交（CISH)組合的實驗。Am J Clin Pathol 2012 ;137:102-110 ;doi: 1(λ 1309/AJCPLNHINN906YSF。盡管作者通過先使CISH樣品成像、 再使IHC樣品成像而能夠得到信號，但他們發(fā)現(xiàn)當(dāng)不僅是在CISH之后進(jìn)行IHC，而且直到所 有濕實驗室（wet lab)實驗完成才使樣品成像（即沒有中間成像步驟）時，獲得更好的圖 像。重要的是，當(dāng)Reisenbichler等人在樣品上先進(jìn)行IHC，再進(jìn)行CISH時，他們不能獲得 CISH信號。
[0007] Gaiser等人描述了在同一組織樣品內(nèi)對于基因擴(kuò)增通過蛋白表達(dá)而定位的組 織結(jié)構(gòu)的分析方法。作者首先在結(jié)腸癌組織樣品中測定CD133表達(dá)，使用單克隆抗體和 FITC-標(biāo)記的第二抗體。使用40x放大倍數(shù)，手工選擇目標(biāo)區(qū)并記錄。成像之后，對于 擴(kuò)增的cMyc癌基因和ZNF217同時進(jìn)行FISH分析。在相同區(qū)域，以40x放大倍數(shù)，對樣 品再次進(jìn)行成像。對基于tile的FISH分析，將自動化顯微鏡和用戶定制設(shè)計的分類器 用于分析圖像。Anal Cell Pathol (Amst)。2010 ;33 (2) : 105 - 112 ;doi: 10.3233/ ACP-CL0-2010-0532) 〇
[0008] 仍然需要改進(jìn)的方法，用于在同一生物樣品中檢測多個靶標(biāo)并創(chuàng)建合成圖像，以 在細(xì)胞-細(xì)胞基礎(chǔ)上比較表達(dá)，允許根據(jù)蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡等而包括或排除細(xì)胞。
[0009] 發(fā)明概沐 本發(fā)明的一方面，提供了在同一生物樣品上進(jìn)行蛋白以及靶核酸序列的熒光檢測的方 法。因此，本發(fā)明的一個實施方案提供用于提供單個生物樣品的合成圖像的方法，包括以下 有序步驟：（1)產(chǎn)生所述生物樣品的第一圖像；(2)產(chǎn)生所述生物樣品的第二圖像；和（3) 產(chǎn)生提供所述靶蛋白和所述靶核酸兩者的相對位置的合成圖像。產(chǎn)生所述生物樣品的第 一圖像的步驟包括以下步驟：(a)使固體載體上的所述樣品與靶蛋白的第一結(jié)合劑接觸； (b)所述樣品用提供形態(tài)學(xué)信息的熒光標(biāo)記來染色；（c)通過熒光檢測來自第一結(jié)合劑和 所述熒光標(biāo)記的信號；(d)根據(jù)所檢測的熒光信號產(chǎn)生所述樣品的至少部分的第一圖像。 產(chǎn)生所述生物樣品的第二圖像的步驟包括以下步驟：(a)使來自步驟（1)的同一樣品與至 少一種靶核酸序列的每一個的探針接觸因此使所述探針與所述靶核酸序列雜交；(b)任選 地，所述樣品用所述熒光標(biāo)記來染色；(c)通過熒光檢測來自所述靶核酸序列的每一個的 探針和所述熒光標(biāo)記的信號；和（d)根據(jù)所檢測的熒光信號產(chǎn)生所述樣品的至少部分的 第二圖像。在某些實施方案中，所述合成圖像是通過將來自第一圖像的一種或多種信號與 來自第二圖像的一種或多種信號合并而產(chǎn)生。
[0010] 本發(fā)明的另一實施方案提供產(chǎn)生單個生物樣品的第一和第二圖像的方法，包括以 下步驟：（1)產(chǎn)生所述生物樣品的第一圖像，包括以下步驟：(a)使固體載體上的所述樣 品與靶蛋白的第一結(jié)合劑接觸；(b)所述樣品用提供形態(tài)學(xué)信息的熒光標(biāo)記來染色；（C) 通過熒光檢測來自第一結(jié)合劑和所述熒光標(biāo)記的信號；（d)根據(jù)所檢測的熒光信號產(chǎn)生 所述樣品的至少部分的第一圖像；和然后（2)產(chǎn)生所述生物樣品的第二圖像，包括以下步 驟：(a)使來自步驟（1)的同一樣品與至少一種靶核酸序列的每一個的探針接觸因此使所 述探針與所述靶核酸序列雜交；(b)任選地，所述樣品用所述熒光標(biāo)記來染色；(C)通過 熒光檢測來自所述靶核酸序列的每一個的探針和所述熒光標(biāo)記的信號；和（d)根據(jù)所檢 測的熒光信號產(chǎn)生所述樣品的至少部分的第二圖像。
[0011] 在本發(fā)明的另一方面，提供的是分析生物樣品的方法，包括提供所述生物樣品的 合成圖像，和根據(jù)所述合成圖像分析蛋白表達(dá)和目標(biāo)核酸序列。
[0012] 在本發(fā)明的又一方面，提供的是在同一生物樣品上熒光檢測蛋白以及靶核酸序列 的試劑盒。因此，本發(fā)明的實施方案提供試劑盒，其包括用于進(jìn)行本發(fā)明的新方法的組分。
[0013] 在本發(fā)明的再一方面，提供的是在同一生物樣品上熒光檢測蛋白以及靶核酸序列 的系統(tǒng)。因此，本發(fā)明的一個實施方案提供系統(tǒng)，其包括用于進(jìn)行本發(fā)明的新方法的工具。
[0014] 附圖簡沐 圖1是流程圖，顯示本發(fā)明實施方案的關(guān)鍵步驟。
[0015] 圖2A :表明以IOx成像的乳腺癌組織的偽彩色圖像。使用Cy3標(biāo)記的細(xì)胞角蛋白 抗體、Cy5標(biāo)記的Her2抗體和DAPI對組織切片進(jìn)行染色。用單色相機(jī)采集免疫熒光圖像， 如下進(jìn)行數(shù)字化重疊和上色：DAPI，藍(lán)色；細(xì)胞角蛋白，綠色；Her2,紅色。ROI的選擇，如圖 2所示，顯示為淺藍(lán)色長方形。
[0016] 圖2B :將來自圖IA的DAPI和細(xì)胞角蛋白圖像以及在綠色通道中代表背景熒光的 圖像轉(zhuǎn)化形成如所述的虛擬H&E圖像。
[0017] 圖2C :由IA中的DAPI和Her2圖像產(chǎn)生的虛擬DAB圖像。
[0018] 圖3 :從圖2中所示的組織選擇的40x ROI的合并的Her2免疫熒光（黃色）、DAPI (藍(lán)色）、Her2 FISH (紅色）和著絲粒17 FISH (綠色）。
[0019] 發(fā)明詳沐 定義： 為了更清楚而簡明地描述并指出所要求保護(hù)的發(fā)明的主題，對于在以下說明書及其所 附權(quán)利要求書中使用的特定術(shù)語，提供以下定義。
[0020] 單數(shù)形式"a"、"an"和"the"包括復(fù)數(shù)對象，除非上下文明確另外指出。在整個說 明書和權(quán)利要求書中使用的近似語言可應(yīng)用于修飾任何定量表示，其在不導(dǎo)致與其相關(guān)的 基本功能變化的情況下可允許變化。因此，由術(shù)語例如"約"修飾的值不限于所指定的精確 值。除非另有說明，在說明書和權(quán)利要求書中使用的表示成分的量、性質(zhì)例如分子量、反應(yīng) 條件等的所有數(shù)值，都理解為在所有情況下都用術(shù)語"約"來修飾。因此，除非有相反的說 明，以下說明書和所附權(quán)利要求書中給出的數(shù)值參數(shù)是近似值，其可根據(jù)本發(fā)明實施方案 力圖獲取的所需性質(zhì)而改變。最起碼，每個數(shù)值參數(shù)應(yīng)當(dāng)至少根據(jù)所報告的有效數(shù)字的值 和通過應(yīng)用常規(guī)四舍五入技術(shù)來解釋。
[0021] 本文使用的術(shù)語"固體載體"是指生物樣品可固定于其上且隨后可通過本文公開 的方法檢測其上的蛋白和靶核酸序列的制品。生物樣品可通過物理吸附、共價鍵形成或其 組合固定在固體載體上。固體載體可包括聚合物、玻璃或金屬材料。固體載體的實例包括 膜、微量滴定板、珠、濾紙、測試條、載玻片、蓋玻片和試管。
[0022] 本文使用的術(shù)語"熒光標(biāo)記"是指對特定亞細(xì)胞區(qū)室選擇性染色的熒光團(tuán)。合適的 熒光標(biāo)記（以及它們的靶細(xì)胞、亞細(xì)胞區(qū)室或細(xì)胞組分，如果合適的話）的實例可包括但不 限于：4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI)(核酸）、伊紅（堿性細(xì)胞組分、細(xì)胞質(zhì)）、H 〇echst 33258和Hoechst 33342 (兩種雙苯酰亞胺）（核酸）、碘化丙啶（核酸）、奎納克林（核 酸）、熒光素-鬼筆環(huán)肽（肌動蛋白纖維）、色霉素 A3 (核酸）、吖啶黃-福爾根反應(yīng)（核 酸）、金胺O-福爾根反應(yīng)（核酸）、溴化乙錠（核酸）。尼氏染色（神經(jīng)元）、高親和力DNA 熒光團(tuán)例如POPO、BOBO、YOYO和TOTO和其它，和融合到DNA結(jié)合蛋白（例如組蛋白）的綠 色熒光蛋白、ACM和吖啶橙。優(yōu)選地，所述熒光標(biāo)記使細(xì)胞核染色。
[0023] 本文使用的術(shù)語"熒光團(tuán)"是指如下化合物：當(dāng)通過暴露于特定波長的光來激發(fā) 時，所述化合物發(fā)射光（以不同波長）。術(shù)語"熒光"、"熒光的"或"熒光信號"都指通過激發(fā) 的熒光團(tuán)發(fā)射光。熒光團(tuán)可根據(jù)其發(fā)射特性或"顏色"描述。綠色熒光團(tuán)（例如Cy3、FITC 和Oregon Green)的特征可為其通常在515-540納米范圍的波長下發(fā)射。紅色焚光團(tuán)（例 如Texas Red、Cy5和四甲基若丹明）的特征可為通常在590-690納米范圍的波長下發(fā)射。 熒光團(tuán)的實例包括但不限于4-乙酰氨基-4' -異硫氰酸根合芪-2, 2' -二磺酸、吖啶、吖啶 衍生物和異硫氰酸吖啶、5-(2' -氨乙基）氨基萘-1-磺酸（EDANS)、4_氨基-N-[3-乙烯基 磺?；┍交鵠萘二甲酰亞胺-3, 5-二磺酸酯（Lucifer Yellow VS)、N-(4-苯胺基-1-萘 基）馬來酰亞胺、鄰氨基苯甲酰胺、亮黃、香豆素、香豆素衍生物、7-氨基-4-甲基香豆素 (AMC，香豆素120)、7_氨基-三氟甲基香豆素（香豆冉151)、四氯四溴焚光素（cyanosine)、 V，6_二脒基-2-苯基吲哚（DAPI)、5'，5"_二溴鄰苯三酚-磺酞（溴鄰苯三酚紅）、 7-二乙基氨基-3-(4' -異硫氰酸根合苯基）4_甲基香豆素、4, 4'-二異硫氰酸根合二 氫-芪_2,2'-二磺酸、4, 4'-二異硫氰酸根合芪_2,2'-二磺酸、5-[二甲氨基]萘-1-磺 酰氯（DNS，丹磺酰氯）、伊紅、伊紅衍生物諸如異硫氰酸伊紅、赤蘚紅、赤蘚紅衍生物諸如赤 蘚紅B和異硫氰酸赤蘚紅；乙啡啶；熒光素和衍生物，諸如5-羧基熒光素（FAM)、5-(4, 6-二 氯三嗪-2-基）氨基熒光素（DTAF)、2'，7' -二甲氧基-4'，5' -二氯-6-羧基熒光素（JOE)、 熒光素、異硫氰酸熒光素（FITC)、QFITC (XRITC);熒光胺衍生物（與胺反應(yīng)時發(fā)熒光）； IR144 ;IR1446 ;異硫氰酸孔雀綠；4-甲基傘形酮；鄰甲酚酞；硝基酪氨酸；堿性副品紅；酚 紅、B-藻紅蛋白；鄰苯二甲醛衍生物（與胺反應(yīng)時發(fā)熒光）；芘和衍生物，諸如芘、芘丁酸酯 (pyrene butyrate)和 1-花丁酸瑭泊酰亞胺醋（sucinimidyl 1-pyrene butyrate);活性 紅4 (Cibacron. RTM.亮紅3B-A)、若丹明和衍生物，諸如6-羧基-X-若丹明（ROX)、6_羧 基若丹明（R6G)、麗絲胺若丹明B磺酰氯、若丹明（Rhod)、若丹明B、若丹明123、異硫氰酸 若丹明X、磺基若丹明B、磺基若丹明101和磺基若丹明101的磺酰氯衍生物（Texas Red); N，N，N'，N'-四甲基-6-羧基若丹明（TAMRA);四甲基若丹明、四甲基若丹明異硫氰酸酯 (TRITC);核黃素；玫紅酸和鑭系螯合衍生物、量子點（quantum dot)、花菁和方酸菁。
[0024] 在某些實施方案中，焚光團(tuán)可以基本上包括可以與抗體結(jié)合的焚光團(tuán)，例如，在免 疫熒光分析中。可以綴合到抗體上的合適的熒光團(tuán)包括但不限于：熒光素、若丹明、Texas Red、Cy2、Cy3、Cy5、VECTOR Red、ELF. TM.(酶-標(biāo)記的熒光）、Cy2、Cy3、Cy3. 5、Cy5、Cy7、 FluorX、鈣黃綠素、鈣黃綠素-AM、CRYPT0FLU0R. TM. ' S、Orange (42 kDa)、Tangerine (35 kDa)、Gold (31 kDa)、Red (42 kDa)、Crimson (40 kDa)、BHMP、BHDMAP、Br-〇regon、Lucifer Yellow、Alexa染料家族、N-[6-(7-硝基苯并-2-氧雜-1，3-二唑-4-基）氨基]己酰基] (NBD)、B0DIPY.、二吡咯甲烷二氟化硼、Oregon Green、MITOTRACKER、Red、DiOC. sub. 7 (3)、 DiIC. sub. 18、藻紅蛋白、藻膽蛋白 ΒΡΕ (240 kDa) RPE (240 kDa) CPC (264 kDa) APC (104 kDa)、Spectrum Blue、Spectrum Aqua、Spectrum GreeruSpectrum GolcUSpectrum Orange、 Spectrum Red、NADH、NADPH、FAD、紅外（IR)染料、環(huán)狀⑶P-核糖（c⑶PR)、Calcofluor White、麗絲胺、傘形酮、酪氨酸或色氨酸。在某些實施方案中，熒光團(tuán)可以基本上包括花菁 染料。在某些實施方案中，熒光團(tuán)可以基本上包括一種或多種花菁染料（例如Cy3染料、Cy5 染料或Cy7染料）。
[0025] 本文使用的術(shù)語"抗體"是指與另一分子特異性結(jié)合且由此定義為與該分子的特 定空間和極性結(jié)構(gòu)互補的免疫球蛋白?？贵w可為單克隆抗體或多克隆抗體，且可通過本領(lǐng) 域熟知的技術(shù)而制備，所述技術(shù)例如：使宿主免疫和收集血清（多克隆的），或制備連續(xù)雜 交細(xì)胞系和收集分泌的蛋白質(zhì)（單克隆的），或克隆并表達(dá)至少編碼特異性結(jié)合天然抗體 所需要的氨基酸序列的核苷酸序列或其誘變形式?？贵w可包括完全免疫球蛋白或其片段， 所述免疫球蛋白包括多種分類和同種型，諸如IgA、IgD、IgE、IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3、 IgM。功能性抗體片段可包括能夠保留與全長抗體類似的親和力的結(jié)合的抗體部分（例如， Fab、Fv和F (ab'）2或Fab'）。另外，在適當(dāng)?shù)那闆r下，可使用免疫球蛋白或其片段的聚集 體、聚合體和綴合物，只要基本保持對特定分子的結(jié)合親和力即可。
[0026] 本文使用的"靶標(biāo)"，通常是指當(dāng)存在于生物樣品中時可被檢測的生物樣品的組 分。靶標(biāo)可為任何物質(zhì)，對該物質(zhì)存在著天然存在的特異性結(jié)合劑（例如，抗體）或可制 備針對該物質(zhì)的特異性結(jié)合劑（例如，小分子結(jié)合劑）。一般來講，結(jié)合劑可經(jīng)靶標(biāo)的一 個或多個離散化學(xué)部分或靶標(biāo)的三維結(jié)構(gòu)組分（例如，由肽折疊產(chǎn)生的三維結(jié)構(gòu)）與靶標(biāo) 結(jié)合。革G標(biāo)可包括以下的一種或多種：肽、蛋白質(zhì)（例如，抗體、親和體（affibody)或適體 (aptamer))、核酸（例如，多核苷酸、DNA、RNA或適體）；多糖（例如，凝集素或糖）、脂質(zhì)、 酶、酶底物、配體、受體、抗原或半抗原。在一些實施方案中，靶標(biāo)可包括蛋白質(zhì)或核酸。
[0027] 本文使用的術(shù)語"結(jié)合劑"是指可與生物樣品中的一種或多種靶標(biāo)結(jié)合的分子。結(jié) 合劑可與靶標(biāo)特異性結(jié)合。合適的結(jié)合劑可包括以下一種或多種：天然或修飾的肽、蛋白質(zhì) (例如，抗體、親和體或適體）、核酸（例如，多核苷酸、DNA、RNA或適體）；多糖（例如，凝集 素、糖）、脂質(zhì)、酶、酶底物或抑制劑、配體、受體、抗原或半抗原等。合適的結(jié)合劑可根據(jù)待 分析的樣品和可用于檢測的靶標(biāo)來選擇。例如，在樣品中的靶標(biāo)可包括配體且結(jié)合劑可包 括受體，或者靶標(biāo)可包括受體且探針可包括配體。類似地，靶標(biāo)可包括抗原且結(jié)合劑可包括 抗體或抗體片段，或反之亦然。在一些實施方案中，靶標(biāo)可包括核酸且結(jié)合劑可包括互補核 酸。在一些實施方案中，靶標(biāo)和結(jié)合劑兩者可包括能夠彼此結(jié)合的蛋白質(zhì)。
[0028] 本文使用的術(shù)語"特異性結(jié)合"是指與其他分子的明顯較低識別相比，兩種不同分 子之一對另一分子的特異性識別。所述分子在其表面上或在腔中可具有在兩分子之間產(chǎn)生 特異性識別的區(qū)域，所述特異性識別由靜電相互作用、氫鍵或疏水性相互作用中的一種或 多種產(chǎn)生。特異性結(jié)合的實例包括但不限于抗體-抗原相互作用、酶-底物相互作用、多核 苷酸相互作用等。在一些實施方案中，結(jié)合劑分子在環(huán)境條件（即PH大約6至大約8和溫 度范圍大約〇°C至大約37°C )下可對靶標(biāo)具有不低于約IO5 M4的固有平衡結(jié)合常數(shù)（KA)。
[0029] 本文使用的術(shù)語"原位"通常是指在原始位置，例如在完整器官或組織中或在器官 或組織的代表性節(jié)段中發(fā)生的事件。在一些實施方案中，靶標(biāo)的原位分析可在來源于各種 來源的細(xì)胞上進(jìn)行，所述來源包括生物體、器官、組織樣品或細(xì)胞培養(yǎng)物。原位分析提供前 后關(guān)系信息，該信息可在靶標(biāo)從其來源位點除去時丟失。因此，靶標(biāo)的原位分析描述了對 位于全細(xì)胞或組織樣品中的結(jié)合有靶標(biāo)的探針的分析，不管細(xì)胞膜是完全完整或部分完整 的，其中結(jié)合有靶標(biāo)的探針保持在細(xì)胞內(nèi)。此外，本文公開的方法可用于分析固定或未固定 的細(xì)胞或組織樣品中的原位靶標(biāo)。
[0030] "化學(xué)試劑"可包括能夠修改熒光團(tuán)或熒光團(tuán)與結(jié)合劑之間的可切割接頭（如果 存在的話）的一種或多種化學(xué)品?？墒够瘜W(xué)試劑與固體、溶液、凝膠或懸液形式的熒光團(tuán)接 觸?？捎糜谛薷男盘柕暮线m化學(xué)試劑包括：調(diào)節(jié)PH的試劑（例如酸或堿）、電子供體（例 如親核試劑）、電子受體（例如親電試劑）、氧化劑、還原劑或其組合。在某些實施方案中， 化學(xué)試劑可包括堿，例如，氫氧化鈉、氫氧化銨、碳酸鉀或乙酸鈉。在某些實施方案中，化學(xué) 試劑可包括酸，例如，鹽酸、硫酸、乙酸、甲酸、三氟乙酸或二氯乙酸。在某些實施方案中，化 學(xué)試劑可包括親核試劑，例如，氰化物、膦類或硫醇類。在某些實施方案中，化學(xué)試劑可包括 還原劑，例如，膦類、硫醇類、連二亞硫酸鈉或在水存在下可使用的氫化物例如氫硼化物或 氰基氫硼化物。在某些實施方案中，化學(xué)試劑可包括氧化劑，例如，活性氧類、羥自由基、單 態(tài)氧、過氧化氫或臭氧。在某些實施方案中，化學(xué)試劑可包括氟化物，例如四丁基氟化銨、吡 啶-HF 或 SiF4。
[0031] -種或多種前述化學(xué)試劑可用于本文公開的方法，取決于熒光團(tuán)、結(jié)合劑、靶標(biāo)或 生物樣品對該化學(xué)試劑的易感性。在某些實施方案中，可以使用基本上不影響結(jié)合劑、靶標(biāo) 和生物樣品的完整性的化學(xué)試劑。在某些實施方案中，可以使用不影響結(jié)合劑與靶標(biāo)之間 的結(jié)合特異性的化學(xué)試劑。
[0032] 在某些實施方案中，當(dāng)可同時使用兩種或更多種熒光團(tuán)時，化學(xué)試劑可能能夠選 擇性修飾一種或多種信號發(fā)生體（signal generator)。不同的信號發(fā)生體對化學(xué)試劑的易 感性可以部分地取決于信號發(fā)生體的濃度、溫度或pH。例如，兩種不同的熒光團(tuán)對堿可具有 不同的易感性，取決于堿的濃度。
[0033] 本文使用的術(shù)語"明場型圖像"或"虛擬染色圖像"（VSI)是指模擬由明場染色方 案獲得的圖像的生物樣品的圖像。所述圖像具有與明場圖像類似的對比度、強度和顏色。這 允許表征生物樣品內(nèi)的特征，包括但不限于細(xì)胞核、上皮、基質(zhì)或任何類型的胞外基質(zhì)材料 特征，如同明場染色方案直接用于生物樣品上。
[0034] 發(fā)明概沐 本發(fā)明包括通常涉及可用于將免疫熒光檢測與基于熒光的核酸分析組合的分析、診斷 或預(yù)后應(yīng)用的方法的實施方案。所公開的方法通常涉及來自單個生物樣品的不同類型的靶 標(biāo)（即蛋白和核酸）的檢測和關(guān)聯(lián)。在某些實施方案中，公開了使用相同檢測通道檢測相 同類型（即分別為蛋白或核酸）的多個靶標(biāo)的方法。在這樣的實施方案中，在多個不同類 型的靶標(biāo)中可以獲取相關(guān)性。
[0035] 本文公開的方法可以允許在同一生物樣品中檢測多個靶標(biāo)，同時對生物樣品的完 整性少有或沒有影響。在同一生物樣品中檢測靶標(biāo)，還可以提供在生物樣品中有關(guān)靶標(biāo)的 相關(guān)空間信息。本文公開的方法也可用于分析應(yīng)用，在所述分析應(yīng)用中可能得到有限量的 生物樣品用于分析和可能必須處理同一樣品用于多個分析。此外，可以使用相同檢測通道 用于檢測在樣品中不同的靶標(biāo)，使得對于多個靶標(biāo)的分析而言較少的化學(xué)需要成為可能。 所述方法可以進(jìn)一步幫助基于因為可分辨信號的限制而可受限于同時可檢測靶標(biāo)數(shù)量的 檢測方法的分析。
[0036] 在某些實施方案中，在生物樣品中檢測多個靶標(biāo)的方法包括在生物樣品中序貫檢 測靶標(biāo)。所述方法通常包括以下步驟：在生物樣品中檢測第一靶標(biāo)，任選修改來自第一靶標(biāo) 的信號，和在生物樣品中檢測第二靶標(biāo)。所述方法可以進(jìn)一步包括重復(fù)以下步驟：修改來自 第一或第二靶標(biāo)的信號，然后檢測生物樣品中的不同靶標(biāo)，等等。
[0037] 在一個實施方案中，提供的是用于提供單個生物樣品的合成圖像的方法，其包括 以下有序步驟：（1)產(chǎn)生所述生物樣品的第一圖像；（2)產(chǎn)生所述生物樣品的第二圖像； 和（3)產(chǎn)生提供靶蛋白和靶核酸兩者的相對位置的合成圖像。產(chǎn)生所述生物樣品的第一圖 像的步驟包括以下步驟：(a)使固體載體上的所述樣品與靶蛋白的第一結(jié)合劑接觸；(b) 所述樣品用提供形態(tài)學(xué)信息的熒光標(biāo)記來染色；(c)通過熒光檢測來自第一結(jié)合劑和所述 熒光標(biāo)記的信號；（d)根據(jù)所檢測的熒光信號產(chǎn)生所述樣品的至少部分的第一圖像。產(chǎn)生 所述生物樣品的第二圖像的步驟包括以下步驟：(a)使來自步驟（1)的同一樣品與至少一 種靶核酸序列的每一個的探針接觸因此使所述探針與所述靶核酸序列雜交；(b)任選地， 所述樣品用所述熒光標(biāo)記來染色；（c)通過熒光檢測來自所述靶核酸序列的每一個的探針 和所述熒光標(biāo)記的信號；和（d)根據(jù)所檢測的熒光信號產(chǎn)生所述樣品的至少部分的第二 圖像。在某些實施方案中，產(chǎn)生合成圖像的步驟包括使用在第一圖像的產(chǎn)生和第二圖像的 產(chǎn)生中所得的信號信息以產(chǎn)生所述合成圖像。在某些實施方案中，產(chǎn)生合成圖像的步驟包 括登記來自步驟（1)中所得的熒光標(biāo)記的信號位置以及來自步驟（2)中所得的熒光標(biāo)記的 信號位置。
[0038] 在某些實施方案中，步驟（I) (d)包括：（i)根據(jù)所檢測的熒光信號產(chǎn)生所述樣品 的至少部分的初始圖像；和（ii)根據(jù)所述初始圖像選擇目標(biāo)區(qū)，和通過熒光檢測來自至 少第一結(jié)合劑和所述熒光標(biāo)記的信號，以比所述初始圖像更高的分辨率產(chǎn)生第一圖像。在 某些實施方案中，通過合并來自更高分辨率圖像和第二圖像的信號信息而產(chǎn)生所述合成圖 像。在其它實施方案中，通過以下方法產(chǎn)生合成圖像：所述方法包括登記來自更高分辨率圖 像中的熒光標(biāo)記的信號位置以及來自第二圖像中的熒光標(biāo)記的信號位置。在再其它實施方 案中，所述合成圖像的產(chǎn)生包括登記來自步驟（1)中所得的熒光標(biāo)記的信號位置以及來自 步驟（2)中所得的熒光標(biāo)記的信號位置。
[0039] 在另一個實施方案中，提供的是用于產(chǎn)生單個生物樣品的第一和第二圖像的方 法，包括以下步驟：（1)產(chǎn)生所述生物樣品的第一圖像，包括以下步驟：（1)使固體載體上 的所述樣品與靶蛋白的第一結(jié)合劑接觸；(b)所述樣品用提供形態(tài)學(xué)信息的熒光標(biāo)記來染 色；（C)通過熒光檢測來自第一結(jié)合劑和所述熒光標(biāo)記的信號；（d)根據(jù)所檢測的熒光信 號產(chǎn)生所述樣品的至少部分的第一圖像；和然后（2)產(chǎn)生所述生物樣品的第二圖像，包括 以下步驟：(a)使來自步驟⑴的同一樣品與至少一種靶核酸序列的每一個的探針接觸因 此使所述探針與所述靶核酸序列雜交；(b)任選地，所述樣品用所述熒光標(biāo)記來染色；（C) 通過熒光檢測來自所述靶核酸序列的每一個的探針和所述熒光標(biāo)記的信號；和（d)根據(jù) 所檢測的熒光信號產(chǎn)生所述樣品的至少部分的第二圖像。
[0040] 在具體的實施方案中，所述方法包括產(chǎn)生福爾馬林固定的、石蠟包埋的組織樣品 的第一低放大倍數(shù)圖像，其已經(jīng)被用于一種或多種標(biāo)記和熒光標(biāo)記（例如DAPI)染色法的 免疫熒光染色；根據(jù)低放大倍數(shù)圖像產(chǎn)生虛擬H&E或虛擬DAB圖像和使用該圖像，根據(jù)染色 強度或形態(tài)學(xué)來選擇目標(biāo)區(qū)；產(chǎn)生所述樣品的第二圖像，其已經(jīng)FISH和熒光標(biāo)記染色法染 色；根據(jù)使用熒光標(biāo)記染色法所得的共同圖像，重疊或登記所述圖像作為坐標(biāo)以產(chǎn)生合成 圖像。因此，在某些實施方案中，所述合成圖像是明場型圖像，例如虛擬H&E或虛擬DAB圖 像。在某些實施方案中，所述方法進(jìn)一步包括分析所述圖像，以測定單個細(xì)胞中的蛋白表達(dá) 和靶核酸序列的量。
[0041] 牛物樣品 依據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的生物樣品可以是固體或液體。生物樣品是指從生物受試 者獲得的樣品，包括體內(nèi)或體外獲得的生物組織或流體來源的樣品。生物樣品的合適實例 可以包括但不限于血、唾液、腦脊液、胸膜液、奶、淋巴、痰、精液、尿、糞、淚、針吸出物、皮膚 的外部切片、呼吸道、腸道和泌尿生殖道、腫瘤、器官、細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶓w組織切片。在某些 實施方案中，所述生物樣品可按原樣分析，即不用收獲和/或分離目標(biāo)靶標(biāo)。在替代實施方 案中，可在分析前收獲樣品。在某些實施方案中，本文公開的方法可特別適合于生物樣品的 體外分析?？蓪⑸飿悠饭潭ㄔ诠腆w載體上，例如在玻璃載片、微量滴定板或ELISA板中。
[0042] 生物樣品可包括任何前述樣品，無論它們的物理狀態(tài)如何，例如但不限于被冷凍 或染色或經(jīng)其它處理。在某些實施方案中，生物樣品可包括不天然與天然樣品混合的化合 物，例如防腐劑、抗凝劑、緩沖劑、固定劑、營養(yǎng)物、抗生素等等。
[0043] 生物樣品可為原核來源或真核來源（例如，昆蟲、原生動物、鳥、魚、爬行動物）。在 某些實施方案中，所述生物樣品為哺乳動物（例如，大鼠、小鼠、牛、狗、驢、豚鼠或兔）。在某 些實施方案中，所述生物樣品為靈長類動物來源（例如，黑猩猩或人）。
[0044] 在某些實施方案中，生物樣品可包括組織樣品、全細(xì)胞、細(xì)胞組分、細(xì)胞離心涂片 或細(xì)胞涂片。在某些實施方案中，生物樣品基本上包括組織樣品。組織樣品可包括得自生 物受試者組織且可具有相似功能的相似細(xì)胞的集合。在某些實施方案中，組織樣品可包括 得自人體組織的相似細(xì)胞的集合。人體組織的合適實例包括但不限于（1)上皮組織；（2) 結(jié)締組織，包括血管、骨和軟骨；（3)肌肉組織；和（4)神經(jīng)組織。組織樣品的來源可以是 得自新鮮、冷凍和/或保藏的器官或組織樣品或活檢或吸出物的實體組織；血或任何血液 組分；體液，例如腦脊液、羊膜液、腹膜液或間隙液；或來自受試者的妊娠或發(fā)育的任何時 間的細(xì)胞。在某些實施方案中，所述組織樣品可包括原代或培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)胞系。
[0045] 組織樣品可以通過多種程序而獲得，所述程序包括但不限于手術(shù)切除、吸引術(shù)或 活檢。在某些實施方案中，所述組織樣品可以是固定的和包埋在石蠟中。所述組織樣品可 以是固定的或通過常規(guī)方法而另外保存的；可以按照組織是進(jìn)行組織染色或其它分析的目 的來確定固定劑的選擇。固定的長度可以取決于組織樣品的大小和所用的固定劑。例如， 中性緩沖的福爾馬林、Bouin氏或低聚甲醛，可用于固定或保存組織樣品。
[0046] 在某些實施方案中，生物樣品包括正?；虬┳儊碓吹慕M織切片，例如來自結(jié)腸、乳 腺、前列腺、肺、肝和胃的組織切片。組織切片可包括一份或一片組織樣品，例如，從組織樣 品上切下的組織或細(xì)胞薄片。在某些實施方案中，可獲取組織樣品的多個切片并進(jìn)行分析， 前提是本文公開的方法可用于分析組織樣品的同一切片的至少2個不同靶標(biāo)（即其中之一 是蛋白質(zhì)來源，另一是核酸來源）。組織切片，如果用作生物樣品，可以具有的厚度范圍小于 大約100微米，范圍小于大約50微米，范圍小于大約25微米，或范圍小于大約10微米。
[0047] 靶蛋白 本發(fā)明的實施方案的靶蛋白可以存在于生物樣品表面上（例如組織切片表面的抗原） 或存在于大塊樣品中（例如緩沖液中的抗體）。在某些實施方案中，靶蛋白可能并非固有地 存在于生物樣品表面上并且生物樣品可能必須經(jīng)處理而使靶蛋白在表面上可用。在某些實 施方案中，所述靶蛋白可以在組織中，無論是在細(xì)胞表面還是細(xì)胞內(nèi)。
[0048] 可以根據(jù)生物樣品所需分析的類型和性質(zhì)來確定待分析的靶蛋白的適用性。在某 些實施方案中，靶標(biāo)可提供有關(guān)生物樣品中的分析物存在或不存在的信息。在另一個實施 方案中，靶蛋白可提供生物樣品狀態(tài)的信息。例如，如果生物樣品包括組織樣品，本文公開 的方法可用于檢測靶蛋白，其可有助于比較不同類型的細(xì)胞或組織，比較不同發(fā)育時期，檢 測疾病或異常的存在，或確定疾病或異常的類型。
[0049] 合適的靶蛋白可包括一種或多種肽、蛋白質(zhì)（例如抗體、親和體或適體）、酶、配 體、受體、抗原或半抗原。一種或多種前述靶蛋白可以是特定細(xì)胞所特有的，而其它靶蛋白 可以與特定疾病或病癥相關(guān)。在某些實施方案中，使用本文公開的方法可檢測和分析的組 織樣品中的靶蛋白可以包括但不限于預(yù)后標(biāo)記、預(yù)測標(biāo)記、激素或激素受體、淋巴樣、腫瘤 標(biāo)記、細(xì)胞周期相關(guān)標(biāo)記、神經(jīng)組織和腫瘤標(biāo)記或群分化標(biāo)記。
[0050] 預(yù)后標(biāo)記的合適實例可包括酶靶標(biāo)例如半乳糖基轉(zhuǎn)移酶II、神經(jīng)元特異性烯醇 酶、質(zhì)子ATP酶-2或酸性磷酸酶。預(yù)后蛋白或基因標(biāo)記的其它實例包括Ki67、細(xì)胞周期蛋 白 E、p53、cMeto
[0051] 預(yù)測標(biāo)記（藥物反應(yīng)）的合適實例可包括蛋白或基因革El標(biāo)例如EGFR、Her2、ALK。
[0052] 激素或激素受體的合適實例可包括人絨毛膜促性腺激素（HCG)、促腎上腺皮質(zhì)激 素、癌胚抗原（CEA)、前列腺-特異性抗原（PSA)、雌激素受體、黃體酮受體、雄激素受體、 gClq_R/p33補體受體、IL-2受體、p75神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體、PTH受體、甲狀腺激素受體或胰 島素受體。
[0053] 淋巴樣的合適實例可包括α-l-抗胰凝乳蛋白酶、α-l-抗胰蛋白酶、B細(xì)胞靶 標(biāo)、bcl-2、bcl-6、B淋巴細(xì)胞抗原36 kD、BMl (骨髓樣靶標(biāo)）、ΒΜ2 (骨髓樣靶標(biāo)）、半乳 凝素-3、粒酶B、HLA I類抗原、HLA II類（DP)抗原、HLA II類（DQ)抗原、HLA II類（DR) 抗原、人嗜中性粒細(xì)胞防衛(wèi)素、免疫球蛋白A、免疫球蛋白D、免疫球蛋白G、免疫球蛋白Μ、κ 輕鏈、κ輕鏈、λ輕鏈、淋巴細(xì)胞/組織細(xì)胞抗原、巨噬細(xì)胞靶標(biāo)、胞壁質(zhì)酶（溶菌酶）、P80 間變性淋巴瘤激酶、漿細(xì)胞靶標(biāo)、分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑、T細(xì)胞抗原受體（JOVI 1)、T 細(xì)胞抗原受體（JOVI 3)、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶或未成簇的B細(xì)胞靶標(biāo)。
[0054] 腫瘤標(biāo)記的合適實例可包括α甲胎蛋白、載脂蛋白D、BAG-1 (RAP46蛋白）、 CA19-9 (sialyl lewisa)、CA50 (癌相關(guān)粘蛋白抗原）、CA125 (卵巢癌抗原）、CA242 (腫 瘤相關(guān)粘蛋白抗原）、嗜鉻粒蛋白A、簇集蛋白（載脂蛋白J)、上皮膜抗原、上皮相關(guān)抗原、上 皮特異性抗原、巨囊性病的液狀蛋白-15、肝細(xì)胞特異性抗原、調(diào)蛋白、人胃粘蛋白、人乳汁 脂肪球、MAGE-1、基質(zhì)金屬蛋白酶、melan A、黑素瘤革巴標(biāo)（HMB45)、間皮素、金屬硫蛋白、小眼 轉(zhuǎn)錄因子（MITF)、Muc_l核心糖蛋白、Muc-I糖蛋白、Muc-2糖蛋白、Muc_5AC糖蛋白、Muc-6 糖蛋白、髓過氧化物酶、Myf-3 (橫紋肌肉瘤靶標(biāo)）、Myf_4 (橫紋肌肉瘤靶標(biāo)）、MyoDl (橫 紋肌肉瘤靶標(biāo)）、肌紅蛋白、nm23蛋白、胎盤堿性磷酸酶、前白蛋白、前列腺特異性抗原、前 列腺酸性磷酸酶、前列腺抑制素肽、PTEN、腎細(xì)胞癌靶標(biāo)、小腸粘蛋白抗原、四連接素、甲狀 腺轉(zhuǎn)錄因子-1、基質(zhì)金屬蛋白酶1的組織抑制劑、基質(zhì)金屬蛋白酶2的組織抑制劑、酪氨酸 酶、酪氨酸酶相關(guān)蛋白 -1、絨毛蛋白或von Willebrand因子。
[0055] 細(xì)胞周期相關(guān)標(biāo)記的合適實例可包括凋亡蛋白酶活化因子-1、bcl-w、bcl-x、溴 脫氧尿苷、CAK (cdk活化激酶）、細(xì)胞凋亡易感性蛋白（CAS)、胱冬蛋白酶2、胱冬蛋白酶8、 CPP32 (胱冬蛋白酶-3)、CPP32 (胱冬蛋白酶-3)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶、細(xì)胞周期蛋 白A、細(xì)胞周期蛋白B1、細(xì)胞周期蛋白D1、細(xì)胞周期蛋白D2、細(xì)胞周期蛋白D3、細(xì)胞周期蛋 白E、細(xì)胞周期蛋白G、DNA片段化因子（N-末端）、Fas (⑶95)、Fas-相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白、 Fas配體、Fen-1、IPO-38、Mcl-U微型染色體維持蛋白、錯配修復(fù)蛋白（MSH2)、多（ADP-核 糖）聚合酶、增殖細(xì)胞核抗原、P16蛋白、p 27蛋白、p34cdc2、p57蛋白（Kip2)、pl05蛋白、 Stat I α、拓?fù)洚悩?gòu)酶I、拓?fù)洚悩?gòu)酶II α、拓?fù)洚悩?gòu)酶III α或拓?fù)洚悩?gòu)酶II β。
[0056] 神經(jīng)組織和腫瘤標(biāo)記的合適實例可包括a B晶體蛋白、α-絲聯(lián)蛋白、α突觸核 蛋白、淀粉樣蛋白前體蛋白、β淀粉樣蛋白、鈣結(jié)合蛋白、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶、興奮性氨基酸轉(zhuǎn) 運子1、GAP43、神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白、谷氨酸鹽受體2、髓磷脂堿性蛋白、神經(jīng)生長因子 受體（gp75)、神經(jīng)母細(xì)胞瘤靶標(biāo)、神經(jīng)絲68 kD、神經(jīng)絲160 kD、神經(jīng)絲200 kD、神經(jīng)元特異 性烯醇酶、煙堿乙酰膽堿受體α 4、受體煙堿乙酰膽堿受體β 2、外周蛋白、蛋白基因產(chǎn)物9、 S-100蛋白、5-羥色胺、SNAP-25、突觸蛋白I、突觸素、tau、色氨酸羥化酶、酪氨酸羥化酶或 泛蛋白。
[0057] 群（cluster)分化標(biāo)記的合適實例可包括 CDla、CDlb、CDlc、CDlcU CDle、CD2、 CD3A、CD3 ε、CD3y、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8a、〇)8β、CD9、CD10、CDlla、CDllb、CDllc、 CDwl2、CD13、CD14、CD15、CD15s、CD16a、CD16b、CDwl7、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、 CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、 CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD44R、CD45、CD46、CD47、CD48、 CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、 CD58、CD59、CDw60、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD65s、CD66a、CD66b、 CD66c、CD66d、CD66e、CD66f、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、 CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、 CDw92、CDw93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CDlOl、CD102、CD103、CD104、 CD105、CD106、CD107a、CD107b、CDwl08、CD109、CD114、CD115、CD116、CD117、CDwll9、CD120a、 CD120b、CD121a、CDwl21b、CD122、CD123、CD124、CDwl25、CD126、CD127、CDwl28a、CDwl28b、 CD130、CDwl31、CD132、CD134、CD135、CDwl36、CDwl37、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、 CD142、CD143、CD144、CDwl45、CD146、CD147、CD148、CDwl49、CDwl50、CD151、CD152、CD153、 CD154、CD155、CD156、CD157、CD158a、CD158b、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166 和 TCR-zeta。
[0058] 其它合適的靶蛋白包括著絲粒蛋白-F (CENP-F)、巨蛋白、內(nèi)披蛋白、核纖層蛋白 A&C (XB 10)、LAP-70、粘蛋白、核孔復(fù)合體蛋白、P180片層體蛋白、ran、組織蛋白酶D、Ps2 蛋白、他『2-1^11、？53、5100、上皮靶抗原出麻）、丁(11\]\^2、]\^3、？〇隱、燈67、細(xì)胞角蛋白、？131(、 cMyc 或 MAPK。
[0059] 再其它合適的靶蛋白包括Her2/neu (在乳腺癌和胃癌中過量表達(dá)的表皮生長因 子，經(jīng)單克隆抗體治療減緩腫瘤生長）；EGF-R/erbB (表皮生長因子受體）；ER (某些乳腺 癌腫瘤生長所需的雌激素受體，位于胞核中且用ISH檢測以決定限制陽性患者中雌激素的 治療）；PR (黃體酮受體是與DNA結(jié)合的激素）；AR (雄激素受體參與雄激素依賴性腫瘤生 長）；β-連環(huán)蛋白（癌癥中的癌基因，從細(xì)胞膜易位到細(xì)胞核，其在細(xì)胞粘附和作為潛在基 因調(diào)節(jié)蛋白二者中起作用）；磷酸-β-連環(huán)蛋白（β-連環(huán)蛋白的磷酸化形式在胞質(zhì)溶膠 中降解且不轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核）；GSK3 β (在Wnt途徑中的糖原合酶激酶-3 β蛋白，使β -連 環(huán)蛋白磷酸化，標(biāo)記磷酸-β-連環(huán)蛋白以便在原口動物（protosome)中快速降解）；PKC|3 (介體G-蛋白偶聯(lián)受體）；NFKf3 (當(dāng)轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核時炎癥的核因子κΒ標(biāo)記）；VEGF(血 管生成相關(guān)的血管內(nèi)皮生長因子）；E-鈣黏蛋白（在上皮細(xì)胞上表達(dá)的細(xì)胞-細(xì)胞相互作 用分子，其功能在上皮癌中喪失）；c-met (酪氨酸激酶受體）。在一個優(yōu)選的實施方案中， 所述靶蛋白是HER2。
[0060] 靶核酸序列 本發(fā)明實施方案的靶核酸序列是指生物樣品中的核酸分子所含有的目標(biāo)序列。核酸分 子可以存在于生物樣品的細(xì)胞核中（例如染色體DNA)或存在于細(xì)胞質(zhì)中（例如mRNA)。在 某些實施方案中，核酸分子可能并非固有地存在于生物樣品表面上并且生物樣品可必須經(jīng) 處理而使核酸分子可被探針接近。例如，樣品的蛋白酶處理能夠容易地帶來靶核酸序列。
[0061] 可以根據(jù)生物樣品所需分析的類型和性質(zhì)來確定待分析的核酸分子的適用性。在 某些實施方案中，分析可提供有關(guān)生物樣品中的靶核酸序列的基因表達(dá)水平的信息。在其 它實施方案中，分析可提供染色體DNA的存在或不存在或擴(kuò)增水平的有關(guān)信息。例如，如果 生物樣品包括組織樣品，則本文公開的方法可用于檢測靶核酸序列，其可以識別具有包含 靶核酸序列的特定染色體節(jié)段的增加的拷貝數(shù)的細(xì)胞。
[0062] 在某些實施方案中，使用本文公開的方法可以檢測和分析的組織樣品中的靶核酸 序列可以包括但不限于以下的核酸序列：預(yù)后標(biāo)記、激素或激素受體、淋巴樣、腫瘤標(biāo)記、細(xì) 胞周期相關(guān)標(biāo)記、神經(jīng)組織和腫瘤標(biāo)記、或群分化標(biāo)記。這些標(biāo)記的實例描述于題為"靶 蛋白"的部分中。例如，在一個實施方案中，所述靶核酸序列靶是針對以下的序列：EGFR、 T0P2A、cMyc、ALK、FGFRl 或 HER2 基因。
[0063] 在某些實施方案中，所述靶核酸序列包括其為編碼靶蛋白的基因序列的一部分的 序列。在其它實施方案中，所述靶核酸序列不包括其為編碼靶蛋白的基因序列的一部分的 序列。因此，所述靶核酸序列可包括其為編碼并非靶蛋白的不同蛋白的基因序列的一部分 的序列。
[0064] 靶核酸序列的探針 在某些實施方案中，探針用于檢測靶核酸序列。最好是探針特異性地結(jié)合到含有目標(biāo) 序列的核酸分子的區(qū)域。因此，在某些實施方案中，所述探針是序列特異性的。序列-特異 性探針可包括核酸并且所述探針可以能夠識別核苷酸或其衍生物的特定線狀排列。在某些 實施方案中，所述線狀排列可包括毗鄰核苷酸或其衍生物，其各自可以與探針中的相應(yīng)的 互補核苷酸連接。在替代的實施方案中，當(dāng)有1、2或更多個核苷酸可以不具有探針上的相 應(yīng)的互補殘基時，所述序列可不毗鄰。探針的合適實例可包括但不限于DNA或RNA寡核苷 酸或多核苷酸、肽核酸（PNA)序列、鎖核酸（LNA)序列或適體。在某些實施方案中，合適的 探針可包括核酸類似物，例如dioxygenin dCTP、生物素 dcTP 7-氮雜鳥苷、疊氮胸苷、肌苷 或尿苷。
[0065] 在某些實施方案中，探針可以與革El核酸序列構(gòu)成Watson-Crick鍵。在另一個實施 方案中，探針可以與革El核酸序列構(gòu)成Hoogsteen鍵，從而形成三鏈體。通過Hoogsteen結(jié)合 而結(jié)合的探針可以進(jìn)入核酸序列的大溝并與位于其中的堿基雜交。在某些實施方案中，探 針可以與革G核酸序列同時構(gòu)成Watson-Crick鍵和Hoogsteen鍵（例如，雙PNA探針能夠與 核酸分子同時構(gòu)成Watson-Crick和Hoogsteen結(jié)合）。
[0066] 在某些實施方案中，探針可包括核酸探針、肽核酸探針、鎖核酸探針、mRNA探針、 miRNA探針或siRNA探針。
[0067] 探針的長度也可決定結(jié)合特異性。對于較短序列而言，探針和靶核酸序列之間的 單個錯配的能量消耗可以比較長序列相對高。在某些實施方案中，較小探針的雜交比較長 探針的雜交可能更具特異性，因為較長探針可能更易于錯配并且根據(jù)條件可以繼續(xù)與核酸 結(jié)合。在某些實施方案中，在指定溫度和鹽濃度時，較短探針可能具有較低的結(jié)合穩(wěn)定性。 與短序列結(jié)合具有更大穩(wěn)定性的探針可用于這種情況（例如雙PNA)。在某些實施方案中， 探針的長度范圍可以是大約4個核苷酸至大約12個核苷酸，大約12個核苷酸至大約25個 核苷酸，大約25個核苷酸至大約50個核苷酸，大約50個核苷酸至大約100個核苷酸，大約 100個核苷酸至大約250個核苷酸，大約250個核苷酸至大約500個核苷酸，或大約500個 核苷酸至大約1000個核苷酸。在某些實施方案中，探針的長度范圍可以是大于大約1000 個核苷酸。不管探針的長度如何，不是所有的探針核苷酸殘基可以與靶核酸序列中的互補 核苷酸雜交。例如，探針長度可包括50個核苷酸殘基，并且這些殘基中僅有25個可與靶核 酸序列雜交。在某些實施方案中，可以雜交的核苷酸殘基可以彼此毗鄰。探針可以是單鏈 或可包括二級結(jié)構(gòu)。
[0068] 在某些實施方案中，生物樣品可包括細(xì)胞或組織樣品并且所述生物樣品可以使用 探針進(jìn)行原位雜交（ISH)。在某些實施方案中，除免疫熒光（IF)外，組織樣品還可以經(jīng)歷原 位雜交，以獲取有關(guān)組織樣品的想要的信息。
[0069] 無論探針和靶核酸序列的種類如何，探針和核酸序列之間的結(jié)合特異性也可能受 到結(jié)合條件的影響（例如，就互補核酸而言的雜交條件）?？赏ㄟ^調(diào)節(jié)PH、溫度或鹽濃度的 一項或多項，實現(xiàn)合適的結(jié)合條件。
[0070] 探針可以用熒光團(tuán)固有標(biāo)記（在探針合成期間連接熒光團(tuán)）或非固有標(biāo)記（在后 續(xù)步驟期間連接熒光團(tuán)）。例如，可以使用將熒光團(tuán)-標(biāo)記的核苷酸直接摻入到生長中的核 酸鏈的方法，合成固有標(biāo)記的核酸。在某些實施方案中，以可將熒光團(tuán)在后期摻入的方式可 以合成探針。例如，這后一種標(biāo)記可以通過將活性氨基或巰基引入核酸鏈中的化學(xué)方法而 得以實現(xiàn)。在某些實施方案中，可使用針對探針的合適化學(xué)，將探針例如核酸（例如DNA) 直接化學(xué)標(biāo)記。
[0071] 結(jié)合劑 本文公開的方法涉及以特定方式與靶標(biāo)物理結(jié)合的結(jié)合劑的使用。在某些實施方案 中，結(jié)合劑可以以足夠的特異性與靶標(biāo)結(jié)合，也就是說，結(jié)合劑可以比其與任何其它分子結(jié) 合更大的親和力與靶標(biāo)結(jié)合。在某些實施方案中，結(jié)合劑可與其它分子結(jié)合，但所述結(jié)合可 能是這樣的：非特異性結(jié)合可以在背景水平或接近背景水平。在某些實施方案中，結(jié)合劑對 目標(biāo)靶標(biāo)的親和力可以在其對其它分子的親和力的至少2倍、至少5倍、至少10倍或更高 的范圍內(nèi)。在某些實施方案中，可以使用具有最大差異親和力的結(jié)合劑，盡管它們可能并非 是與靶標(biāo)具有最大親和力的那些。
[0072] 靶標(biāo)和結(jié)合劑之間的結(jié)合可能受到物理結(jié)合的影響。物理結(jié)合可包括使用非共價 相互作用而實現(xiàn)的結(jié)合。非共價相互作用可以包括但不限于疏水性相互作用、離子相互作 用、氫鍵相互作用或親和力相互作用（例如，生物素-抗生物素蛋白或生物素-鏈霉抗生物 素絡(luò)合作用）。在某些實施方案中，靶標(biāo)和結(jié)合劑在它們的表面上或腔中可能具有區(qū)域，弓丨 起兩者之間的特異性識別，導(dǎo)致物理結(jié)合。在某些實施方案中，根據(jù)它們分子形狀的一部分 的相互配合，結(jié)合劑可以與生物靶標(biāo)結(jié)合。
[0073] 結(jié)合劑及其相應(yīng)的靶標(biāo)可被認(rèn)為是結(jié)合對，其非限制性實例包括：免疫型結(jié)合對， 例如，抗原/抗體、抗原/抗體片段或半抗原/抗半抗原；非免疫型結(jié)合對，例如生物素/抗 生物素蛋白、生物素/鏈霉抗生物素、葉酸/葉酸結(jié)合蛋白、激素/激素受體、凝集素/特異 性碳水化合物、酶/酶、酶/底物、酶/底物類似物、酶/假-底物（不能通過酶活性催化的 底物類似物）、酶/輔因子、酶/調(diào)節(jié)劑、酶/抑制劑或維生素 B12/內(nèi)在因子。結(jié)合對的其 它合適實例可包括互補核酸片段（包括DNA序列、RNA序列、PNA序列、和肽核酸序列、鎖核 酸序列）；蛋白A/抗體；蛋白G/抗體；核酸/核酸結(jié)合蛋白；或多核苷酸/多核苷酸結(jié)合蛋 白。
[0074] 在某些實施方案中，結(jié)合劑可以是序列-或結(jié)構(gòu)-特異性結(jié)合劑，其中結(jié)合劑所識 別和結(jié)合的靶標(biāo)的序列或結(jié)構(gòu)對于該靶標(biāo)而言可能是足夠獨特的。
[0075] 在某些實施方案中，結(jié)合劑可以是結(jié)構(gòu)-特異性的并且可以識別靶標(biāo)的一級、二 級或三級結(jié)構(gòu)。靶標(biāo)的一級結(jié)構(gòu)可包括其原子組成和連接這些原子的化學(xué)鍵（包括立體化 學(xué)）的詳細(xì)說明，例如，在蛋白質(zhì)中的氨基酸的線狀排列的種類和性質(zhì)。靶標(biāo)的二級結(jié)構(gòu)可 指生物分子節(jié)段的常規(guī)三維形式，例如，對于蛋白而言，二級結(jié)構(gòu)可指肽"主鏈"折疊為不同 構(gòu)象，其可導(dǎo)致遠(yuǎn)離的氨基酸彼此靠近。二級結(jié)構(gòu)的合適實例可包括但不限于α螺旋、β 折疊片或無規(guī)則卷曲。靶標(biāo)的三級結(jié)構(gòu)可以是其整體的三維結(jié)構(gòu)。靶標(biāo)的四級結(jié)構(gòu)可以是 通過其與一個或多個其它靶標(biāo)或大分子的非共價相互作用（例如蛋白相互作用）而構(gòu)成的 結(jié)構(gòu)。四級結(jié)構(gòu)的實例可以是通過4個球蛋白亞基構(gòu)成的結(jié)構(gòu)，形成血紅蛋白。本發(fā)明實 施方案的結(jié)合劑對于任何上述結(jié)構(gòu)而言可以是特異性的。
[0076] 結(jié)構(gòu)-特異性結(jié)合劑的實例可包括可與蛋白靶標(biāo)結(jié)合的蛋白-特異性分子。合適 的蛋白-特異性分子的實例可包括抗體和抗體片段、核酸（例如，識別蛋白靶標(biāo)的適體）、或 蛋白底物（非可催化的）。
[0077] 在某些實施方案中，靶標(biāo)可包括抗原，結(jié)合劑可包括抗體。合適的抗體可包括單克 隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體（例如雙特異性抗體）或抗體片段，只要它們與靶抗原 特異性結(jié)合。
[0078] 在某些實施方案中，靶標(biāo)可包括單克隆抗體。"單克隆抗體"可指得自基本均一抗 體群的抗體，即，包含該群體的單個抗體是相同的，除了以少數(shù)量存在的可能天然發(fā)生的突 變之外。單克隆抗體可以是高度特異性的，針對單一抗原性位點。此外，與典型地包括針對 不同抗原決定簇（表位）的不同抗體的（多克?。┛贵w制劑相反，每種單克隆抗體可以針 對抗原上的單一抗原決定簇?？赏ㄟ^任何已知方法制備單克隆抗體，所述方法例如雜交瘤 方法、重組DNA方法、或可自噬菌體抗體文庫分離。
[0079] 在某些實施方案中，生物樣品可包括細(xì)胞或組織樣品，和本文公開的方法可以用 于免疫熒光（IF)。免疫化學(xué)可涉及靶抗原與基于抗體的結(jié)合劑的結(jié)合，以提供組織或細(xì)胞 (例如患病的與正常的細(xì)胞）的有關(guān)信息。適合作為用于本文公開方法的結(jié)合劑的抗體 (和相應(yīng)的疾病/疾病細(xì)胞）的實例包括但不限于：抗雌激素受體抗體（乳腺癌）、抗黃體 酮受體抗體（乳腺癌）、抗p53抗體（多種癌癥）、抗Her-2/neu抗體（多種癌癥）、抗EGFR 抗體（表皮生長因子、多種癌癥）、抗組織蛋白酶D抗體（乳腺癌和其它癌癥）、抗Bcl-2抗 體（凋亡細(xì)胞）、抗E-鈣黏蛋白抗體、抗CA125抗體（卵巢癌和其它癌）、抗CA15-3抗體 (乳腺癌）、抗CA19-9抗體（結(jié)腸癌）、抗c-erbB-2抗體、抗P-糖蛋白抗體（MDR、多重藥物 抗性）、抗CEA抗體（癌胚抗原）、抗成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白（Rb)抗體、抗ras癌蛋白（p21) 抗體、抗Lewis X (也稱為CD15)抗體、抗Ki-67抗體（細(xì)胞增殖）、抗PCNA(多種癌癥） 抗體、抗CD3抗體（T-細(xì)胞）、抗CD4抗體（輔助T細(xì)胞）、抗CD5抗體（T細(xì)胞）、抗CD7抗 體（胸腺細(xì)胞、不成熟T細(xì)胞、NK殺傷細(xì)胞）、抗CD8抗體（抑制T細(xì)胞）、抗CD9/p24抗體 (ALL)、抗CDlO (也稱為CALLA)抗體（常見急性成淋巴細(xì)胞性白血病）、抗CDllc抗體（單 核細(xì)胞、粒細(xì)胞、AML)、抗CD13抗體（髓單核細(xì)胞、AML)、抗CD14抗體（成熟單核細(xì)胞、粒 細(xì)胞）、抗CD15抗體（霍奇金?。?、抗CD19抗體（B細(xì)胞）、抗CD20抗體（B細(xì)胞）、抗CD22 抗體（B細(xì)胞）、抗CD23抗體（活化B細(xì)胞、CLL)、抗CD30抗體（活化T細(xì)胞和B細(xì)胞、霍 奇金病）、抗CD31抗體（血管生成標(biāo)記）、抗CD33抗體（骨髓細(xì)胞、AML)、抗CD34抗體（內(nèi) 皮干細(xì)胞、間質(zhì)瘤）、抗CD35抗體（樹突細(xì)胞）、抗CD38抗體（漿細(xì)胞、活化T、B和骨髓細(xì) 胞）、抗CD41抗體（血小板、巨核細(xì)胞）、抗LCA/CD45抗體（白細(xì)胞共同抗原）、抗CD45RO 抗體（輔助、誘導(dǎo)T細(xì)胞）、抗⑶45RA抗體（B細(xì)胞）、抗⑶39、⑶100抗體、抗⑶95/Fas抗 體（細(xì)胞凋亡）、抗CD99抗體（尤文氏肉瘤標(biāo)記、MIC2基因產(chǎn)物）、抗CD106抗體（VCAM-1 ; 活化內(nèi)皮細(xì)胞）、抗泛蛋白抗體（阿爾茨海默?。?、抗CD71 (轉(zhuǎn)鐵蛋白受體）抗體、抗c-myc (癌蛋白和半抗原）抗體、抗細(xì)胞角蛋白（轉(zhuǎn)鐵蛋白受體）抗體、抗波形蛋白（內(nèi)皮細(xì)胞） 抗體（B和T細(xì)胞）、抗HPV蛋白（人乳頭瘤病毒）抗體、抗κ輕鏈抗體（B細(xì)胞）、抗λ輕 鏈抗體（Β細(xì)胞）、抗黑素體（ΗΜΒ45)抗體（黑素瘤）、抗前列腺特異性抗原（PSA)抗體（前 列腺癌）、抗S-100抗體（黑素瘤、salvary、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞）、抗tau抗原抗體（淀粉樣蛋白 相關(guān)疾?。⒖估w維蛋白抗體（上皮細(xì)胞）、抗角蛋白抗體、抗細(xì)胞角蛋白抗體（腫瘤）、抗 α -連環(huán)蛋白（細(xì)胞膜）或抗Tn-抗原抗體（結(jié)腸癌、腺癌和胰腺癌）。
[0080] 合適的抗體的其它具體實例可包括但不限于：抗增殖細(xì)胞核抗原、克隆PClO (Sigma Aldrich、P8825);抗平滑肌 α 肌動蛋白（SmA)、克隆 1Α4 (Sigma、A2547);兔抗 β 連環(huán)蛋白（Sigma、C 2206);小鼠抗全細(xì)胞角蛋白、克隆PCK-26 (Sigma、C1801);小鼠抗雌 激素受體α、克隆1D5 (DAKO、M 7047) ;β連環(huán)蛋白抗體、克隆15B8 (Sigma、C 7738);山羊 抗波形蛋白（Sigma、V4630);循環(huán)雄激素受體克隆 AR441 (DAKO、M3562) ;Von Willebrand 因子7、角蛋白5、角蛋白8/18、e-鈣黏蛋白、Her2/neu、雌激素受體、p53、黃體酮受體、 β 連環(huán)蛋白；驢抗小鼠 （Jackson Immunoresearch, 715-166-150);或驢抗兔（Jackson Immunoresearch, 711-166-152)。
[0081] 無論結(jié)合劑和靶標(biāo)的種類如何，結(jié)合劑和靶標(biāo)之間的結(jié)合特異性還可能受到結(jié)合 條件的影響（例如，就互補核酸而言的雜交條件）?？赏ㄟ^調(diào)節(jié)pH、溫度或鹽濃度的一項或 多項，實現(xiàn)合適的結(jié)合條件。
[0082] 如上所述，結(jié)合劑可以用熒光團(tuán)固有標(biāo)記（在結(jié)合劑合成期間連接熒光團(tuán)）或非 固有標(biāo)記（在后續(xù)步驟期間連接熒光團(tuán)）。例如對于基于蛋白的結(jié)合劑，可通過使用熒光團(tuán) 標(biāo)記的氨基酸，制備固有標(biāo)記的結(jié)合劑。在某些實施方案中，以可將熒光團(tuán)在后期摻入的方 式可以合成結(jié)合劑。在某些實施方案中，可使用針對結(jié)合劑的合適化學(xué)，將結(jié)合劑例如蛋白 (例如抗體）或核酸（例如DNA)直接化學(xué)標(biāo)記。
[0083] 在某些實施方案中，可使用結(jié)合劑的組合，其可提供更大的特異性或在某些實施 方案中放大信號。因此，在某些實施方案中，可使用結(jié)合劑夾心，其中第一結(jié)合劑可與靶標(biāo) 結(jié)合并用于提供第二結(jié)合，其中第二結(jié)合劑可包括或不包括熒光團(tuán)，其可進(jìn)一步提供第三 結(jié)合（如果需要的話），其中第三結(jié)合成員可包括熒光團(tuán)。
[0084] 結(jié)合劑組合的合適實例可包括第一抗體-第二抗體、互補核酸或其它配體-受體 對（例如生物素-鏈霉抗生物素）。合適的結(jié)合劑對的某些具體實例可包括小鼠抗myc， 對于具有c-myc表位的重組表達(dá)的蛋白；小鼠抗HisG，對于具有His-Tag表位的重組蛋白； 小鼠抗xpress，對于具有表位-tag的重組蛋白；兔抗山羊，對于山羊IgG第一分子；互補 核酸序列，對于核酸；小鼠抗硫（thio)，對于硫氧還蛋白融合蛋白；兔抗GFP，對于融合蛋 白；jacalin，對于a-D-半乳糖；和蜜二糖，對于碳水化合物-結(jié)合蛋白、糖、鎳偶聯(lián)基質(zhì) (nickel couple matrix)或月干素。
[0085] 在某些實施方案中，第一抗體和第二抗體的組合可用作結(jié)合劑。第一抗體能夠與 靶標(biāo)的特定區(qū)域結(jié)合，而第二抗體能夠與第一抗體結(jié)合。可第二抗體在與第一抗體結(jié)合之 前與熒光團(tuán)連接，或可在后續(xù)步驟與熒光團(tuán)結(jié)合。在替代的實施方案中，可使用第一抗體和 特異性結(jié)合配體-受體對（例如生物素-鏈霉抗生物素）?？蓪⒌谝豢贵w連接到所述對的 一個成員（例如生物素），而可將其它成員（例如鏈霉抗生物素）用熒光團(tuán)標(biāo)記。第二抗 體、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素或生物素可以各自獨立地用熒光團(tuán)標(biāo)記。
[0086] 在某些實施方案中，本文公開的方法可用于免疫熒光程序，第一抗體可用于與組 織樣品中的靶抗原特異性結(jié)合。第二抗體可用于與第一抗體特異性結(jié)合，從而在第一抗 體和后續(xù)試劑（例如熒光團(tuán)）（如果有的話）之間構(gòu)成橋連。例如，第一抗體可以是小鼠 IgG(在小鼠中產(chǎn)生的抗體）和相應(yīng)的第二抗體可以是具有能夠與小鼠 IgG中的區(qū)域結(jié)合的 區(qū)域的山羊抗小鼠（在山羊中產(chǎn)生的抗體）。
[0087] 在某些實施方案中，當(dāng)若干第二抗體可與第一抗體上的表位結(jié)合時，可以得到信 號放大。在免疫熒光程序中，第一抗體可以是用于該程序的第一種抗體，而第二抗體可以是 用于該程序的第二種抗體。在某些實施方案中，第一抗體可以是用于IF程序的唯一抗體。
[0088] 產(chǎn)牛牛物樣品的第一圖像 在本發(fā)明的某些實施方案中，所述方法包括產(chǎn)生生物樣品的第一圖像的步驟。第一圖 像通過如下產(chǎn)生：(a)使固體載體上的樣品與靶蛋白的第一結(jié)合劑接觸；(b)所述樣品用 提供形態(tài)學(xué)信息的熒光標(biāo)記來染色；（c)通過熒光檢測來自第一結(jié)合劑和所述熒光標(biāo)記的 信號；和（d)根據(jù)所檢測的熒光信號產(chǎn)生所述樣品的至少部分的第一圖像。在某些實施方 案中，所述方法還包括，在第一步驟中，使所述樣品與提供額外的形態(tài)學(xué)信息的至少一種額 外的結(jié)合劑接觸；和通過熒光檢測來自至少一種額外的結(jié)合劑的信號。在某些實施方案中， 步驟（c)還包括通過熒光檢測源自諸如紅細(xì)胞、形成纖維性組織和脂褐質(zhì)顆粒等結(jié)構(gòu)的內(nèi) 源熒光信號（也稱為自發(fā)熒光）。在某些實施方案中，產(chǎn)生第一圖像（步驟（d))包括，根據(jù) 所檢測的熒光信號以較低放大倍數(shù)產(chǎn)生所述樣品的至少部分的初始圖像；根據(jù)所述初始圖 像選擇目標(biāo)區(qū)，和通過熒光檢測來自至少第一結(jié)合劑和所述熒光標(biāo)記的信號，以比所述初 始圖像更高的分辨率產(chǎn)生第一圖像。關(guān)于"選擇目標(biāo)區(qū)"，其被理解為指（1)使用者根據(jù)初 始圖像選擇目標(biāo)區(qū)；（2)計算機(jī)（即執(zhí)行所述方法的成像系統(tǒng)）根據(jù)初始圖像、算法和收到 的指令選擇目標(biāo)區(qū)；或（3)計算機(jī)根據(jù)初始圖像和算法選擇目標(biāo)區(qū)。應(yīng)當(dāng)知道，第一圖像 不一定指所產(chǎn)生的初始圖像。同樣，第二圖像不照字面含義指通過所述方法的實施方案產(chǎn) 生的所述第二圖像。
[0089] 在某些實施方案中，產(chǎn)生生物樣品的第一圖像的方法包括以下步驟：(a)使固體 載體上的所述樣品與靶蛋白的第一結(jié)合劑接觸；(b)所述樣品用提供形態(tài)學(xué)信息的熒光標(biāo) 記來染色；（c)通過熒光檢測來自第一結(jié)合劑和所述熒光標(biāo)記的信號；和（d)根據(jù)所檢測 的第一結(jié)合劑和任選地所述熒光標(biāo)記的熒光信號產(chǎn)生所述樣品的至少部分的第一圖像。因 此，在這樣的實施方案中，第一圖像可用于識別樣品中的靶蛋白，而獲取得自熒光標(biāo)記的信 號，以允許將圖像登記下來，如本文中定義。
[0090] 在某些實施方案中，所述初始圖像可以是一個或多個明場型圖像，其類似于明場 染色方案。因此，初始熒光圖像數(shù)據(jù)可用于經(jīng)由算法而產(chǎn)生模擬的（虛擬的/分子的）蘇 木精和伊紅（H&E)圖像。或者，模擬的（虛擬的/分子的）3, 3'-二氨基聯(lián)苯胺（DAB)圖 像可經(jīng)由類似算法而產(chǎn)生。將熒光圖像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為明場型圖像的詳細(xì)方法描述于下文，標(biāo) 題為"圖像采集和分析"。明場型圖像隨后用于選擇目標(biāo)區(qū)。
[0091] 在某些實施方案中，生物樣品可包括全細(xì)胞、組織樣品或微陣列。在某些實施方案 中，生物樣品可包括組織樣品。所述組織樣品可通過多種程序而獲得，包括但不限于手術(shù)切 除、吸引術(shù)或活檢。所述組織可以是新鮮或冷凍的。在某些實施方案中，所述組織樣品可以 是固定的和包埋在石蠟中。所述組織樣品可以是固定的或通過常規(guī)方法而另外保存的；可 以按照對組織進(jìn)行組織染色或其它分析的目的來確定固定劑的選擇。固定的長度可以取決 于組織樣品的大小和所用的固定劑。例如，中性緩沖的福爾馬林、Bouin氏或低聚甲醛，可 用于固定或保存組織樣品。
[0092] 在某些實施方案中，所述組織樣品可以首先被固定，然后通過一系列遞增的乙醇 而脫水、浸潤和用石蠟或其它切片介質(zhì)包埋，使得可以將所述組織樣品切片。在替代實施方 案中，可將組織樣品切片并隨后將其固定。在某些實施方案中，所述組織樣品可以在石蠟中 包埋和處理?？梢允褂玫氖€的實例包括但不限于Paraplast、Broloid和Tissuecan。一 旦將組織樣品包埋后，可通過切片機(jī)將樣品切片，其厚度范圍可為大約3微米至大約5微 米。切片后，可使用粘合劑將切片貼在玻片上。玻片粘合劑的實例可以包括但不限于硅烷、 明膠、聚-L-賴氨酸。在某些實施方案中，如果將石蠟用作包埋材料，可將組織切片去石蠟 化和在水中再水合。通過例如使用有機(jī)試劑（例如二甲苯或逐步遞減的一系列乙醇）可將 組織切片去石蠟化。
[0093] 在某些實施方案中，除了上述樣品制備程序之外，可在免疫熒光測定之前、期間或 之后將組織切片經(jīng)過進(jìn)一步處理。例如，在某些實施方案中，可將組織切片經(jīng)過表位（即抗 原）恢復(fù)方法，例如，在檸檬酸鹽緩沖液中加熱組織樣品。在某些實施方案中，可將組織切 片任選經(jīng)過封閉步驟以盡可能降低任何非特異性結(jié)合。
[0094] 樣品制備之后，可將樣品與結(jié)合劑溶液（例如，免疫熒光程序中的標(biāo)記的抗體溶 液）在適于結(jié)合劑與靶蛋白（例如，免疫熒光程序中的抗原）結(jié)合的條件下接觸足夠的時 間。在某些實施方案中，在接觸步驟中可將生物樣品與超過一種結(jié)合劑接觸。多種結(jié)合劑 可能夠結(jié)合生物樣品中的不同的靶蛋白。例如，生物樣品可包括2種靶蛋白：靶1和靶2， 并且2組結(jié)合劑可用于這種情況：結(jié)合劑1 (能夠結(jié)合靶1)和結(jié)合劑2 (能夠結(jié)合靶2)。 可將多種結(jié)合劑與生物樣品同時接觸（例如作為單一的混合物）。
[0095] 除了使所述樣品與一種或多種靶標(biāo)的一種或多種結(jié)合劑接觸之外，所述樣品也可 用提供形態(tài)學(xué)信息的至少一種額外的結(jié)合劑染色。在一個實施方案中，提供形態(tài)學(xué)信息的 結(jié)合劑可以與靶標(biāo)的結(jié)合劑同時包括在內(nèi)。在其它實施方案中，它們可用于在結(jié)合劑-靶 反應(yīng)后使所述樣品染色。
[0096] 所述形態(tài)學(xué)信息包括但不限于組織形態(tài)學(xué)信息，例如組織類型和來源、某些細(xì)胞 來源的有關(guān)信息、細(xì)胞的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)（例如膜、細(xì)胞質(zhì)或核）的有關(guān)信息、細(xì)胞分化狀態(tài)、細(xì) 胞周期階段、細(xì)胞代謝狀態(tài)、細(xì)胞壞死或細(xì)胞凋亡的有關(guān)信息、細(xì)胞類型、和腫瘤、正常區(qū)和 基質(zhì)區(qū)。例如，形態(tài)學(xué)信息可包括上皮起源的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)位置的有關(guān)信息或它可以指示 腫瘤的不良分化或壞死區(qū)的位置。
[0097] 可通過與生物樣品中的特異性靶標(biāo)結(jié)合的至少一種額外的結(jié)合劑來提供形態(tài)學(xué) 信息。在某些實施方案中，至少一種額外的結(jié)合劑是與以下靶蛋白（但不限于此）結(jié)合的 抗體： 細(xì)胞角蛋白： 上皮細(xì)胞的標(biāo)記 全-鈣黏蛋白： 細(xì)胞膜的標(biāo)記 Na+K+ATP酶 細(xì)胞膜的標(biāo)記 平滑肌肌動蛋白： 平滑肌細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞和肌上皮細(xì)胞 CD31 血管的標(biāo)記 核糖體蛋白S6: 細(xì)胞質(zhì)的標(biāo)記 Glut 1 低氧的標(biāo)記 Κ?67 增殖細(xì)胞的標(biāo)記 膠原IV 基質(zhì) 提供形態(tài)學(xué)信息的其它靶標(biāo)還可包括角蛋白15、19、E-鈣黏蛋白、Claudin 1、EPCAM、 纖連蛋白和波形蛋白。
[0098] 組織的內(nèi)源熒光（自發(fā)熒光）可用于提供處于研宄中的樣品中的額外的形態(tài)學(xué)信 息，包括但不限于紅細(xì)胞、脂褐質(zhì)顆粒和形成纖維性組織。
[0099] 作為實例，至少一種額外的結(jié)合劑可包括全-細(xì)胞角蛋白抗體（例如，在一個反應(yīng) 中允許更大覆蓋細(xì)胞角蛋白同種型的細(xì)胞角蛋白抗體合劑）。細(xì)胞角蛋白是細(xì)胞骨架的一 部分并位于上皮的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。因此，這些抗體使上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)染色。在腫瘤樣 品中，這些抗體使腫瘤的上皮細(xì)胞、而不是基質(zhì)或其它支持組織/區(qū)染色。因此，至少一種 額外的結(jié)合劑例如全-細(xì)胞角蛋白標(biāo)記的使用允許選擇腫瘤的上皮細(xì)胞區(qū)，用于進(jìn)一步分 析。
[0100] 優(yōu)選地，所述結(jié)合劑用熒光團(tuán)標(biāo)記。當(dāng)檢測超過一種靶標(biāo)時，每種靶標(biāo)的結(jié)合劑優(yōu) 選用具有不同的發(fā)射波長的不同的熒光團(tuán)標(biāo)記，使得可以獨立地檢測信號并且基本上不會 重疊。還優(yōu)選地，提供形態(tài)學(xué)信息的結(jié)合劑還用與其它結(jié)合劑不同的熒光團(tuán)標(biāo)記，使得它們 也具有不同的發(fā)射波長。
[0101] 為結(jié)合作用提供足夠時間后，可將樣品與洗滌溶液（例如合適的緩沖溶液）接觸 以洗去任何未結(jié)合的探針。根據(jù)所用的探針濃度和種類，可將生物樣品經(jīng)過多個洗滌步驟， 用各步驟中使用相同或不同的洗滌溶液。
[0102] 在結(jié)合劑與靶蛋白和任選的形態(tài)學(xué)標(biāo)記之間反應(yīng)之后，所述樣品進(jìn)一步用提供額 外形態(tài)學(xué)信息的熒光標(biāo)記染色。術(shù)語"熒光標(biāo)記"是指使組織或其它生物樣品的特定部分 例如某種亞細(xì)胞形態(tài)學(xué)選擇性染色的熒光團(tuán)。合適的熒光標(biāo)記（以及它們的靶細(xì)胞、亞細(xì) 胞區(qū)室或細(xì)胞組分，如果合適的話）的實例可包括但不限于：4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI)(核酸）、伊紅（堿性細(xì)胞組分、細(xì)胞質(zhì)）、Hoechst 33258和Hoechst 33342 (兩 種雙苯酰亞胺）（核酸）、碘化丙啶（核酸）、奎納克林（核酸）、熒光素-鬼筆環(huán)肽（肌動 蛋白纖維）、色霉素 A 3 (核酸）、吖啶黃-福爾根反應(yīng)（核酸）、金胺0-福爾根反應(yīng)（核 酸）、溴化乙錠（核酸）。尼氏染色（神經(jīng)元）、高親和力DNA熒光團(tuán)例如P0P0、B0B0、YOYO 和TOTO和其它，和融合到DNA結(jié)合蛋白（例如組蛋白）的綠色熒光蛋白、ACMA和吖啶橙。 優(yōu)選地，所述熒光標(biāo)記使細(xì)胞核染色。更優(yōu)選地，所述熒光標(biāo)記包括4'，6-二脒基-2-苯基 吲哚（DAPI)。
[0103] 可用于生物樣品的結(jié)合劑和熒光標(biāo)記的總數(shù)可以取決于通過來自所用的熒光團(tuán) 的光譜可分辨的熒光信號可得到的光譜分辨率。光譜可分辨的，對于多個熒光團(tuán)，意指熒光 團(tuán)的熒光發(fā)射波段是足以區(qū)分的，也就是說，足夠的非重疊的，使得基于通過使用標(biāo)準(zhǔn)光檢 測系統(tǒng)的各個熒光團(tuán)所產(chǎn)生的熒光信號，可以區(qū)分各個熒光團(tuán)。在某些實施方案中，在每輪 檢測中通過檢測系統(tǒng)，生物樣品可以與10個或小于10個熒光團(tuán)反應(yīng)。在其它實施方案中， 在每輪檢測中通過檢測系統(tǒng)，生物樣品可以與6個或小于6個熒光團(tuán)反應(yīng)。
[0104] 可使用檢測系統(tǒng)，檢測來自結(jié)合劑-標(biāo)記的熒光團(tuán)、熒光標(biāo)記和樣品的自發(fā)熒光 的信號。檢測系統(tǒng)可包括熒光檢測系統(tǒng)。在某些實施方案中，可檢測信號強度、信號波長、 信號位置、信號頻率或信號變化。在某些實施方案中，可以觀察、測量和記錄一種或多種前 述信號特征。在某些實施方案中，可使用熒光檢測系統(tǒng)檢測熒光波長或熒光強度。在某些 實施方案中，可在原位觀察信號，也就是說，可以直接觀察來自通過結(jié)合劑與生物樣品中的 靶標(biāo)結(jié)合的熒光團(tuán)的信號。
[0105] 在某些實施方案中，觀察信號可包括捕獲生物樣品的圖像。在某些實施方案中，依 據(jù)本文公開的方法，與成像裝置連接的顯微鏡可以用作檢測系統(tǒng)。在某些實施方案中，可以 激發(fā)熒光團(tuán)并且可以觀察所得熒光信號并以數(shù)字信號（例如數(shù)字化圖像）的形式進(jìn)行記 錄。對于在樣品中結(jié)合的不同的熒光團(tuán)，和對于樣品的自發(fā)熒光，可以使用合適的熒光濾鏡 重復(fù)同樣的程序。
[0106] 有關(guān)熒光檢測的方法和系統(tǒng)以及產(chǎn)生樣品的第一圖像的方法和系統(tǒng)的額外詳情 在下文提供，標(biāo)題為"圖像采集和分析"。
[0107] 在某些實施方案中，在根據(jù)所檢測的熒光信號產(chǎn)生生物樣品的第一圖像之后，改 變來自結(jié)合劑的熒光信號。然后，根據(jù)上述方法獲得一個或多個額外圖像。也就是說，每 個額外圖像是通過以下產(chǎn)生：(a)使固體載體上的所述樣品與不同靶蛋白的結(jié)合劑接觸； (b)所述樣品用提供額外的形態(tài)學(xué)信息的熒光標(biāo)記來染色；（C)通過熒光檢測來自所述結(jié) 合劑和所述熒光標(biāo)記的信號；和（d)根據(jù)所檢測的熒光信號產(chǎn)生所述樣品的圖像。
[0108] 可將化學(xué)試劑施加到生物樣品以改變熒光信號。在某些實施方案中，信號改變可 包括信號特征的一種或多種改變，例如，信號強度下降、信號峰的移位、共振頻率的變化、或 切割（去除）信號發(fā)生體導(dǎo)致信號去除。這樣的化學(xué)試劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如 參見美國專利號7629125。
[0109] 在某些實施方案中，化學(xué)試劑可以呈溶液的形式，可使生物樣品與化學(xué)試劑溶液 接觸預(yù)定量的時間?；瘜W(xué)試劑溶液的濃度和接觸時間可取決于想要的信號改變的類型。在 某些實施方案中，可以選擇化學(xué)試劑的接觸條件，使得結(jié)合劑、靶標(biāo)、生物樣品以及結(jié)合劑 與靶標(biāo)之間的結(jié)合可以不受影響。在某些實施方案中，化學(xué)試劑可以僅影響熒光團(tuán)并且化 學(xué)試劑可以不影響靶標(biāo)/結(jié)合劑結(jié)合或結(jié)合劑的完整性。因此舉例來說，結(jié)合劑可包括第 一抗體或第一抗體/第二抗體的組合?；瘜W(xué)試劑可以僅影響熒光團(tuán)，并且第一抗體或第一 抗體/第二抗體的組合可以基本上不受影響。在某些實施方案中，在樣品與化學(xué)試劑接觸 之后，結(jié)合劑（例如第一抗體或第一抗體/第二抗體的組合）可以仍然結(jié)合到生物樣品中 的靶標(biāo)上。在某些實施方案中，在樣品與化學(xué)試劑接觸之后，結(jié)合劑可以仍然結(jié)合到生物樣 品中的靶標(biāo)上，并且結(jié)合劑的完整性可以仍然基本上不受影響（例如，在化學(xué)試劑存在時， 抗體可以基本上不變性或洗脫）。
[0110] 在某些實施方案中，所述樣品與化學(xué)試劑接觸之后可以觀察信號的特征，以確定 信號改變的有效性。例如，在與化學(xué)試劑接觸之前和與化學(xué)試劑接觸之后可觀察來自熒光 信號發(fā)生體的熒光強度。在某些實施方案中，信號強度下降預(yù)定量可指信號改變。在某些 實施方案中，信號的改變可指信號強度下降量范圍大于大約50%。在某些實施方案中，信號 的改變可指信號強度下降量范圍大于大約60%。在某些實施方案中，信號的改變可指信號強 度下降量范圍大于大約80%。在某些實施方案中，信號改變可通過氧化、剝離（stripping)、 光褪色或其混合而完成。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述化學(xué)試劑選自氫氧化鈉、過氧化氫 或高碘酸鈉。在另一個實施方案中，信號改變可通過使樣品與光和/或化學(xué)試劑接觸而完 成，更充分描述于2011年12月23日申請的標(biāo)題為"PHOTOACTIVATED CHEMICAL BLEACHING OF DYES FOR USE IN SEQUENTIAL ANALYSIS OF BIOLOGICAL SAMPLES (染料的光活化化學(xué) 褪色，用于生物樣品的序貫分析）"的美國專利申請序列號13/336409,其通過引用以其整 體結(jié)合到本文中。
[0111] 產(chǎn)牛牛物樣品的第二圖像 在本發(fā)明的某些實施方案中，所述方法包括產(chǎn)生所述生物樣品的第二圖像的步驟。獲 得第一圖像之后產(chǎn)生第二圖像。第二圖像通過如下產(chǎn)生：(a)使所述樣品與至少一種靶核 酸序列的每一個的探針接觸因此使所述探針與所述核酸序列雜交；(b)任選地，所述樣品 使用用于產(chǎn)生第一圖像的所述熒光標(biāo)記來染色；(c)通過熒光檢測來自所述靶核酸序列的 每一個的探針和所述熒光標(biāo)記的信號；和（d)根據(jù)所檢測的一種或多種熒光信號產(chǎn)生所 述樣品的第二圖像。
[0112] 在某些實施方案中，在產(chǎn)生第二圖像的步驟之前，所述方法包括用蛋白酶消化所 述樣品。蛋白酶消化對肽結(jié)合的破壞直接影響信號質(zhì)量，因為它使探針容易接近靶核酸并 減少完整蛋白所產(chǎn)生的自發(fā)熒光。蛋白酶消化還用于從一種或多種靶蛋白上去除結(jié)合劑和 因此除去第一圖像相關(guān)的免疫熒光信號。用于蛋白酶消化的示例性的蛋白酶是絲氨酸蛋白 酶，例如蛋白酶K。另一示例性的蛋白酶是羧基蛋白酶，例如胃蛋白酶。
[0113] 在某些實施方案中，在得到第一圖像之后和產(chǎn)生第二圖像的步驟之前，所述方法 包括改變來自第一結(jié)合劑的熒光信號。在某些實施方案中，信號改變可通過氧化、剝離、光 褪色或其混合而完成。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述化學(xué)試劑選自氫氧化鈉、過氧化氫或 高碘酸鈉。
[0114] 所述靶核酸序列和所述探針詳述如上。優(yōu)選地，所述探針是熒光標(biāo)記的。
[0115] 在某些實施方案中，所述靶核酸序列包含染色體水平上的基因組變化。在某些實 施方案中，所述基因組變化是染色體異常。示例性的染色體異常包括染色體易位、染色體缺 失、染色體插入和染色體倒位、以及基因擴(kuò)增事件。在其它實施方案中，所述靶核酸序列包 含在單個基因水平上的基因組變化，例如單核苷酸多態(tài)性、小缺失、插入、以及點突變。
[0116] 在某些實施方案中，所述探針雜交到生物樣品中的靶核酸序列的互補鏈。探針和 靶核酸序列在合適的雜交條件下可以形成雜合體。雜交領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會知道常用于 利用或控制雜交嚴(yán)格性的因素，包括甲酰胺濃度（或其它化學(xué)變性劑）、鹽濃度（即離子強 度）、雜交溫度、去垢劑濃度、PH和離液劑的存在或不存在。封閉探針也可用作手段以改進(jìn) 辨別力，超過僅通過嚴(yán)格性因素的優(yōu)化而可能達(dá)到的限制?？赏ㄟ^眾所周知的技術(shù)找到形 成雜交組合的最佳嚴(yán)格性，所述技術(shù)是固定若干前述嚴(yán)格性因素，然后確定改變單一嚴(yán)格 性因素的作用?？梢哉{(diào)整相同的嚴(yán)格性因素，從而控制PNA或LNA與核酸雜交的嚴(yán)格性，除 了 PNA雜交是完全獨立于離子強度之外。用于測定的優(yōu)化的或合適的嚴(yán)格性可以經(jīng)實驗確 定，即通過檢查每個嚴(yán)格性因素，直到達(dá)到所需的辨別力程度。
[0117] 檢測核酸序列的方法例如雜交是眾所周知的。在某些實施方案中，通過FISH (或 FISH的變體例如IQ-FISH)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)(或PCR的變體例如原位PCR)、RCA (滾 環(huán)擴(kuò)增）或PRINS (引物原位標(biāo)記）檢測特定核酸序列。在示例性的實施方案中，通過FISH 檢測特定核酸序列。因此，使生物樣品中的靶核酸序列變性和與變性的熒光標(biāo)記的探針原 位雜交。在某些優(yōu)選的實施方案中，當(dāng)通過FISH分析靶核酸序列時，使用染色體特異性探 針，例如對于所述染色體的著絲粒探針，以及對于靶核酸序列的探針。來自染色體特異性探 針的信號顯示靶核酸序列是否在所述染色體上。優(yōu)選地，染色體特異性探針用熒光團(tuán)標(biāo)記， 其產(chǎn)生不同于靶核酸序列的探針的信號。
[0118] 雜交反應(yīng)之后，所述樣品任選用提供額外的形態(tài)學(xué)信息熒光標(biāo)記來染色。所述熒 光標(biāo)記與獲得第一圖像所用的熒光標(biāo)記優(yōu)選是相同的。或者，所述熒光標(biāo)記是不同的，但染 色與用于獲得第一圖像相同的亞細(xì)胞區(qū)室。在某些實施方案中，來自第一圖像的染色的熒 光信號被充分保留，所以該步驟是任選的。在其它實施方案中，來自第一圖像的染色的熒光 信號已經(jīng)褪色并且所述樣品按本文所提供的那樣被染色。
[0119] 在某些實施方案中，優(yōu)選所述熒光標(biāo)記使細(xì)胞核染色。因此染色有助于聚焦FISH 信號。通過獲得聚焦的核，可通過成像聚焦的核上下的若干焦平面捕捉FISH信號。染色還 有助于統(tǒng)計FISH信號。因為FISH信號可能是分散在核中，所以使用單一焦平面進(jìn)行點計 數(shù)可導(dǎo)致遺漏的計數(shù)。然而，通過捕獲每個視野內(nèi)的若干Z-堆棧，提供更多數(shù)據(jù)以盡可能 接近地產(chǎn)生細(xì)胞核的三維視野。因此提供的是統(tǒng)計FISH信號的更準(zhǔn)確的方法。
[0120] 用染色相同的亞細(xì)胞區(qū)室的相同的一種或多種熒光標(biāo)記使生物樣品染色，還用于 提供用于重疊第一圖像和第二圖像的參考點。因此，它有助于產(chǎn)生合成圖像。第一和第二 圖像重疊的有關(guān)詳情，參見以下部分"圖像采集和分析"。
[0121] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述生物樣品是FFPE組織樣品，第一結(jié)合劑是HER2的 抗體，任選的一種或多種額外的結(jié)合劑是全-細(xì)胞角蛋白抗體合劑，所述熒光標(biāo)記是DAPI， 所述靶核酸序列是HER2。
[0122] 使用如上所述的檢測系統(tǒng)可檢測來自探針-標(biāo)記的熒光團(tuán)和熒光標(biāo)記的信號。熒 光檢測的方法和系統(tǒng)以及產(chǎn)生樣品的第二圖像的方法和系統(tǒng)的有關(guān)額外詳情在下文提供， 標(biāo)題為"圖像采集和分析"。
[0123] 在某些實施方案中，在根據(jù)所檢測的熒光信號產(chǎn)生生物樣品的第二圖像之后，通 過例如氧化、剝離、光褪色或其混合，改變來自所述靶核酸序列的每一個的探針的熒光信 號。然后，按照本文的上述方法獲得一個或多個額外圖像。也就是說，每個額外圖像通過以 下產(chǎn)生：（1)使所述樣品與至少一種額外的靶核酸序列的每一個的探針接觸因此使所述探 針與所述序列雜交；(2)任選地，所述樣品用所述熒光標(biāo)記來染色；（3)通過熒光檢測來 自額外的序列的每一個的探針和所述熒光標(biāo)記的信號；和（4)根據(jù)所檢測的熒光信號產(chǎn) 生所述樣品的圖像。
[0124] 圖像采集和分析 在某些實施方案中，提供單個生物樣品的圖像的方法包括產(chǎn)生所述生物樣品的第一圖 像和產(chǎn)生所述生物樣品的第二圖像。這些第一和第二圖像通過以下產(chǎn)生：（1)熒光檢測來 自所述生物樣品的信號，和（2)分別根據(jù)所檢測的熒光信號產(chǎn)生所述樣品的第一和第二圖 像。優(yōu)選使用熒光顯微鏡進(jìn)行這些步驟并對接觸和染色步驟中所用的每種熒光團(tuán)重復(fù)這些 步驟。因此，激發(fā)每種熒光團(tuán)并使用標(biāo)準(zhǔn)儀器例如CCD相機(jī)或熒光掃描器在其波長處測量 其熒光發(fā)射。任選地，還測量生物樣品的自發(fā)熒光并且考慮其對某些熒光團(tuán)測量的影響。例 如，算法可用于扣除一個或多個發(fā)射波長的背景自發(fā)熒光。
[0125] 在某些實施方案中，以高分辨率同時得到全部生物樣品的第一圖像和第二圖 像。因此，在其發(fā)射波長，以高分辨率測定來自每個熒光團(tuán)的發(fā)射。對于高分辨率，是指在 20X-100X的分辨率獲得圖像，其對應(yīng)于數(shù)值孔徑0. 5-1. 4,支持像素尺寸為75-375 nm。優(yōu) 選地，在40X獲得圖像，數(shù)值孔徑為大約0. 85和像素尺寸為大約170 nm。在40X的圖像捕 獲是優(yōu)選的，因為分辨率足夠高以捕獲FISH信號，同時捕獲與60x或IOOx相比相對大的 FOV' S0
[0126] 在其它實施方案中，所述生物樣品可能不占據(jù)固體載體的全部表面，或整個生物 樣品的高分辨率圖像可能并非必要。因此，在獲得第一圖像時，所述固體載體的整個表面可 以先在低分辨率例如在2X進(jìn)行掃描。然后將圖像分析算法用于低分辨率圖像和測定含有 生物樣品的區(qū)域。捕獲標(biāo)記生物樣品邊界的坐標(biāo)并用于指導(dǎo)后續(xù)的更高分辨率掃描。對來 自一個熒光團(tuán)的發(fā)射的測量可能足以獲得樣品邊界的坐標(biāo)。
[0127] 因此，含有生物樣品的區(qū)域可通過計算機(jī)實現(xiàn)的方法而檢測，包括：使用至少一個 處理器獲得所述生物樣品的圖像；使用（a)最大后驗邊際概率（MPM)方法和馬爾可夫隨機(jī) 場（MRF)，或者（b)最大后驗（MAP)估計和馬爾可夫隨機(jī)場（MRF)，用所述處理器將所述圖 像分割為多個區(qū)域；和將多個區(qū)域分為背景區(qū)和組織區(qū)以形成二元掩模（binary mask)。所 述方法hai可包括將主動輪廓方法用于二元掩模以精制生物樣品邊界。
[0128] 在再其它的實施方案中，整個生物樣品的更高分辨率圖像可能并非必要。然而，僅 對于樣品所選擇的目標(biāo)區(qū)（regions of interest，ROI)而言需要更高分辨率圖像。因此， 在產(chǎn)生第一圖像時，使生物樣品先以能夠ROI選擇的較低分辨率（例如與更高分辨率相比 為在10X)成像。任選地，在較低分辨率的成像包括對在接觸和染色步驟中使用的每種熒光 團(tuán)掃描?？筛鶕?jù)預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)（例如樣品完整性、表型例如腫瘤或正常、肌肉或管組織等）選擇 一個或多個ROI。在某些實施方案中，至少部分地根據(jù)自第一結(jié)合劑所測的一種或多種靶蛋 白的蛋白表達(dá)水平而選擇ROI。因此，對于與第一閾值相比的較低靶蛋白表達(dá)水平，可選擇 某些R0I，而由于與第二閾值（其可以不同于第一閾值）相比的更高蛋白表達(dá)水平，可選擇 其它ROI。ROI的坐標(biāo)用于將更高分辨率掃描引導(dǎo)到僅R0I。在某些實施方案中，以與對于 ROI的第一圖像而獲得圖像相同的更高分辨率獲得僅對于ROI的第二圖像。
[0129] 如上所述，在某些實施方案中，首先將初始圖像（即較低分辨率圖像）轉(zhuǎn)化為一個 或多個明場型圖像，其類似于明場染色方案。因此，初始熒光圖像數(shù)據(jù)可用于經(jīng)由算法而產(chǎn) 生模擬的（虛擬的/分子的）蘇木精和伊紅（H&E)圖像?；蛘?，經(jīng)由類似算法可以產(chǎn)生模 擬的（虛擬的/分子的）3, 3'-二氨基聯(lián)苯胺（DAB)圖像。將熒光圖像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為明場型 圖像的詳細(xì)方法描述于下文。然后至少部分地根據(jù)形態(tài)學(xué)信息，將明場型圖像用于目標(biāo)區(qū) 的選擇。
[0130] 在某些實施方案中，因為顯微鏡視野（field of view，F(xiàn)0V)的局限，用一次掃描可 能無法獲得全部生物樣品或樣品內(nèi)所選ROI的圖像。也就是說，有待成像的區(qū)域可能大于 顯微鏡FOV可以捕獲的區(qū)域。在這類情況下，所需圖像可通過捕獲跨越玻片或所選的ROI 的多個FOV而獲得。FOV的這些原始圖像經(jīng)校正以為視場改變作出調(diào)整，并且隨后可以根據(jù) 算法拼接在一起，所述算法將單個FOV排列成整個玻片或ROI的單幅圖像。這樣的圖像拼 接算法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，參見美國專利號6, 674, 884。單色相機(jī)常用于熒光成 像，因其具有更高靈敏度以及通過使用合適的激發(fā)和發(fā)射濾鏡和雙色鏡而捕獲預(yù)定的波長 的能力。因此，產(chǎn)生單個通道的灰度圖像。各熒光通道的灰度數(shù)字圖像可以是偽彩色的并 經(jīng)合并而填充所需圖像。
[0131] 在一個優(yōu)選的實施方案中，產(chǎn)生第一圖像包括（1)任選地產(chǎn)生整個固體載體的較 低分辨率圖像和將所述樣品放在所述固體載體上；(2)產(chǎn)生所述樣品的中等分辨率圖像； (3)根據(jù)預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)識別目標(biāo)區(qū)（ROI);和對于每個ROI產(chǎn)生更高分辨率圖像。所產(chǎn)生的第 二圖像是在第一圖像產(chǎn)生期間所選的每個ROI的較高分辨率圖像。在這些實施方案中，術(shù) 語較低、中等和較高不限于某些放大倍數(shù)。而是，它們彼此相對。在最優(yōu)選的實施方案中， 低分辨率圖像是2X圖像；中等分辨率圖像是IOX圖像，高分辨率圖像是40X圖像。
[0132] 在某些實施方案中，通過計算機(jī)輔助方式將圖像增強至更清楚表明靶蛋白或靶核 酸的特征可能是合乎需要的。因此，一個實例創(chuàng)建RGB顏色混合熱圖（heatmap)圖像，其中 將靶蛋白表達(dá)水平映射到參考顏色查詢表。該查詢表的一個實例將低水平強度映射到藍(lán)色 陰影，將中等強度映射到黃色陰影，高強度映射到紅色陰影，以便更容易地鑒定具有不同染 色強度水平的區(qū)域。在另一實例中，對第一圖像創(chuàng)建顏色混合的合成圖像，以更好地顯示靶 蛋白、形態(tài)學(xué)結(jié)合劑以及所述熒光標(biāo)記之間的空間關(guān)系。例如，靶蛋白結(jié)合劑被染成黃色和 形態(tài)學(xué)結(jié)合劑被染成藍(lán)色，因此其中靶蛋白在形態(tài)學(xué)結(jié)合劑標(biāo)記區(qū)中表達(dá)的區(qū)域，染色將 出現(xiàn)綠色，以便容易和特異性地鑒定。在再一實例中，可以創(chuàng)建特定熒光團(tuán)通道的偽彩色圖 像。例如目標(biāo)基因的FISH信號染為紅色和相同染色體的另一區(qū)域染為綠色，使得在給定細(xì) 胞或組織區(qū)中容易區(qū)分兩類信號的相對量。
[0133] 在某些實施方案中，優(yōu)選至少部分地根據(jù)來自熒光標(biāo)記所測的信號的某些圖像， 將第一和第二圖像排列。優(yōu)選地，將第一和第二圖像重疊并進(jìn)一步創(chuàng)建合成圖像。合成圖 像允許在細(xì)胞-細(xì)胞基礎(chǔ)上直接比較得自第一圖像和第二圖像的結(jié)果。
[0134] 合成圖像可不包括第一或第二圖像的全部圖像，或在第一圖像或第二圖像的產(chǎn)生 中所獲得的全部信號。得自熒光標(biāo)記的圖像可含有任何形態(tài)學(xué)信息，和可包括生物樣品的 特定亞細(xì)胞組分例如細(xì)胞核的圖像。因此，算法獲得來自第一和第二圖像中的形態(tài)學(xué)信息 (例如亞細(xì)胞組分）的坐標(biāo)，并使用這些坐標(biāo)以排列第一和第二圖像。在一個優(yōu)選的實施方 案中，用于排列圖像的形態(tài)學(xué)信息是在細(xì)胞水平上。在更優(yōu)選的實施方案中，用于排列圖像 的形態(tài)學(xué)信息是亞細(xì)胞水平上。在最優(yōu)選的實施方案中，用于排列圖像的形態(tài)學(xué)信息來自 細(xì)胞核的熒光信號。
[0135] 合成圖像可不包括第一或第二圖像的全部，或在第一圖像或第二圖像的產(chǎn)生中所 獲得的全部信號。因為玻片位置和顯微鏡鏡臺的移動，第二圖像相對于第一圖像可旋轉(zhuǎn)或 平移，并且該旋轉(zhuǎn)和平移必須被校正，以便在產(chǎn)生合成圖像之前排列或登記這兩個圖像。
[0136] 為了登記圖像，在第一圖像和第二圖像中優(yōu)選使用相同的形態(tài)學(xué)標(biāo)記。這類標(biāo)記 的一個實例是DAPI，其標(biāo)記細(xì)胞核并在隨后的漂白、染色和其它處理期間停留在樣品中。 得自所述熒光標(biāo)記的圖像提供了在兩個圖像中的有關(guān)特定亞細(xì)胞區(qū)室的形態(tài)學(xué)信息，并且 所述亞細(xì)胞區(qū)室的相對位置在兩個圖像中基本上保持不變。因此，算法可以使用該空間信 息以建立第一圖像和第二圖像之間的坐標(biāo)變換，即通過（a)計算這兩個圖像的傅里葉變 換；(b)將振幅分量傅里葉變換轉(zhuǎn)換為對數(shù)極坐標(biāo)，創(chuàng)建這兩個圖像的每一個的平移不變 標(biāo)記；（c)將第二傅里葉變換用于這兩個標(biāo)記；（d)計算這兩個標(biāo)記之間的相關(guān)函數(shù)；（e) 對所述相關(guān)函數(shù)作反傅里葉變換，解決這兩個圖像間的旋轉(zhuǎn)和縮放；（f)將旋轉(zhuǎn)和縮放用 于第二圖像，使得這兩個圖像都被同等地旋轉(zhuǎn)和縮放；（g)計算同等縮放的圖像間的交叉 乘方（cross-power)相關(guān)函數(shù)；和（h)對交叉乘方相關(guān)作反傅里葉變換，得到第一和第二 圖像間的平移。然后將平移、旋轉(zhuǎn)和縮放用于產(chǎn)生同等排列的（登記的）圖像，用于合成。 交叉乘方相關(guān)優(yōu)選是常規(guī)積-矩相關(guān)，因為它對兩個圖像間的強度差異和對跨越顯微鏡視 野的緩慢變化的強度差異不敏感。
[0137] 在某些實施方案中，第一和第二圖像以及所創(chuàng)建的任何合成圖像用于表征靶蛋白 的表達(dá)以及靶核酸序列。因此，可以通過將信號強度值（例如熒光強度）與生物樣品中的靶 標(biāo)量關(guān)聯(lián)而分析蛋白表達(dá)水平?？墒褂脴?biāo)定標(biāo)準(zhǔn)確定靶標(biāo)量和信號強度間的關(guān)系。在某些 實施方案中，可使用一種或多種對照樣品。通過觀察樣品（目標(biāo)生物樣品與對照）中的信 號的存在或不存在，可以獲得生物樣品的相關(guān)信息。例如通過將患病的組織樣品與正常組 織樣品比較，可以獲得患病的組織樣品中存在的靶標(biāo)的相關(guān)信息。同樣，通過比較樣品（即 目標(biāo)樣品和一種或多種對照）間的信號強度，可以獲得樣品中的靶標(biāo)表達(dá)的相關(guān)信息。
[0138] 可以通過靶核酸序列的存在、不存在、表達(dá)或擴(kuò)增水平對其進(jìn)行分析。對于目標(biāo) DNA序列的分析，所述分析可集中在細(xì)胞核內(nèi)的信號上。因此，當(dāng)目標(biāo)DNA序列通過FISH而 檢測時，優(yōu)選首先分別分割一些細(xì)胞核，至少部分地根據(jù)得自所述熒光標(biāo)記的圖像（例如 DAPI染色）。在每個核內(nèi)，對靶核酸序列的FISH點和任選相應(yīng)的染色體的FISH點（自染 色體特異性探針）進(jìn)行定位。進(jìn)一步分析FISH點。例如，計算所述點的比例，以評價靶基 因擴(kuò)增或重排狀態(tài)。
[0139] 可以進(jìn)一步比較蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)和核酸分析數(shù)據(jù)以提供合并數(shù)據(jù)集。
[0140] 本文公開的方法可以在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中在分析、診斷和治療應(yīng)用中找到用途。根 據(jù)本文所述的方法，可將對患者的細(xì)胞或組織樣品的分析用于診斷（例如，識別患有特定 疾病、暴露給特定毒素或?qū)μ囟ㄖ委熁蚱鞴僖浦卜磻?yīng)良好的患者）和預(yù)后（例如，識別可能 發(fā)展特定疾病、對特定治療反應(yīng)良好或可接受特定器官移植的患者）。本文公開的方法可以 便于準(zhǔn)確和可靠地分析來自同一生物樣品的多個靶標(biāo)（例如疾病標(biāo)記）。
[0141] 在某些實施方案中，將第一和/或第二熒光圖像轉(zhuǎn)化為明場型圖像，其類似于明 場染色方案。因此，從提供形態(tài)學(xué)信息的一種或多種額外的結(jié)合劑、熒光標(biāo)記以及生物樣品 的任何自發(fā)熒光中檢測到的熒光信號，可用于經(jīng)由算法產(chǎn)生模擬的（虛擬的/分子的）蘇 木精和伊紅（H&E)圖像?；蛘?，模擬的（虛擬的/分子的）3, 3'-二氨基聯(lián)苯胺（DAB)圖 像可經(jīng)由類似算法而產(chǎn)生。在某些實施方案中，所述虛擬H&E圖像包括來自熒光標(biāo)記（例 如DAPI)、提供額外的形態(tài)學(xué)信息的至少一種額外的結(jié)合劑（例如抗全細(xì)胞角蛋白抗體）和 自發(fā)熒光的信號。在某些實施方案中，所述虛擬DAB圖像包括來自熒光標(biāo)記和靶蛋白的結(jié) 合劑（抗HER2抗體）的信號。
[0142] 將熒光圖像轉(zhuǎn)化為偽明場圖像的方法是已知的。也已知的是根據(jù)熒光圖像創(chuàng)建明 場圖像的方法，其中鑒定了生物樣品的結(jié)構(gòu)特征和詳情，如同直接根據(jù)指定的明場染色方 案獲得圖像一樣。美國專利申請12/569396。在本發(fā)明的某些實施方案中，使用類似于生 物樣品的明場染色方案的產(chǎn)生明場型圖像的改進(jìn)方法，如更充分描述于K. Kenny的標(biāo)題為 αSYSTEM AND METHODS FOR GENERATING A BRIGHTFIELD IMAGE USING FLUORESCENT IMAGES (使用熒光圖像產(chǎn)生明場圖像的系統(tǒng)和方法）"和2011年8月7日申請的美國專利申請序 列號13/211725,其通過引用以其整體結(jié)合到本文中。所述方法涉及使用自生物樣品的明場 圖像獲得的或使用預(yù)選或所需的顏色定義的標(biāo)定函數(shù)?？捎刹僮鲉T選擇預(yù)選的或所需的顏 色，所述操作員可以是熟悉標(biāo)準(zhǔn)生物染色方案的病理學(xué)家或顯微鏡工作者。標(biāo)定函數(shù)使用 稱為"消光系數(shù)"的3個參數(shù)a[紅色]、a[綠色]、a[藍(lán)色]，評價將熒光圖像映射到明場 色空間的強度變換。
[0143] 可通過制備用可見染料例如蘇木精、伊紅或二氨基聯(lián)苯胺（DAB)標(biāo)記的在目標(biāo)生 物標(biāo)記中具有寬范圍染色強度的一種或多種生物標(biāo)本，得到評價的參數(shù)。然后，所述樣品可 在明場中成像，并且可以計算紅色、綠色和藍(lán)色像素強度水平的分布；將像素強度水平標(biāo)準(zhǔn) 化至區(qū)間[0，1]。識別具有最小平均值（log強度）的顏色。不失一般性，可以假定一種特 定顏色。例如，如果顏色是綠色，則計算（log紅色/log綠色）和（log藍(lán)色/log綠色）的 平均值，和3個值（平均[log紅色/log綠色]、1、平均[log藍(lán)色/ log綠色])用作消 光系數(shù)。
[0144] 或者，可以得到消光系數(shù)，不用參考真實明場染料。而是，設(shè)計者可以選擇應(yīng)該用 于中等強度染色的顏色。如果該顏色在線性顏色模型中是（R，G，B)，其中通道R、G和B被 標(biāo)準(zhǔn)化至區(qū)間[0, 1]，則消光系數(shù)是簡單的（log R，log G，log B)。該方法允許所述方法 使用自然界中不存在的染料模擬明場染色。
[0145] 然后可通過以下兩種方法建立焚光圖像中的點的對應(yīng)（correspondence):基于 強度和基于特征的方法。
[0146] 在基于特征的方法中，對于熒光圖像和明場圖像二者，可以得到核、上皮、基質(zhì)或 任何類型的胞外基質(zhì)材料的圖像?？墒褂檬止ぬ幚砘蜃詣踊x擇基于特征的結(jié)構(gòu)。在來自 這兩種形式的圖像中選擇相應(yīng)的結(jié)構(gòu)。對于熒光圖像，可使用具有調(diào)準(zhǔn)到給定的生物標(biāo)記 的合適激發(fā)能源并具有合適收集發(fā)射光的濾鏡的熒光顯微鏡來捕獲圖像。然后可獲得樣品 的明場圖像，隨后可將其分割為紅色（R)、綠色（G)和藍(lán)色（B)通道并測定基于特征的結(jié)構(gòu) 的顏色和強度。
[0147] 在基于強度的方法中，可用電、磁、光或機(jī)械傳感器控制顯微鏡下的樣品區(qū)的位 置，使得樣品區(qū)可被重復(fù)定位于接近相同位置，用于下個圖像采集。基于強度的登記通?？?用于廣泛類型的生物標(biāo)記。通常，被固定或以其它方式在基質(zhì)（例如但不限于TMA、玻片、孔 或柵格）上提供的生物樣品，用分子生物標(biāo)記來標(biāo)記，并通過熒光顯微鏡成像。
[0148] 在基于強度的方法或基于特征的方法中，從熒光圖像向明場色空間的變換使用非 線性變換方程中估計的映射參數(shù)。非線性變換方程可使用紅色、綠色、藍(lán)色值或色空間（R， G，B)來表示，并且變換可表示為下式： R = 255 exp (- a[Dyel]*z[Dyel] - a[Dye2]z[Dye2]-...) G = 255 exp (- b [Dyel]*z[Dyel] - b [Dye2]z [Dye2]-...) B = 255 exp (- c [Dyel]*z [Dyel] - c [Dye2]z [Dye2]-...) 在式中，標(biāo)量z[Dyel]，z[Dye2]，...是在給定像素位置上觀察到的熒光染料數(shù)量。 3個值（a[Dyen], b[Dyen], c[Dyen])是乘以在使用預(yù)選的或所需的顏色所定義的虛擬染 色中的第η個染料的消光系數(shù)的常數(shù)。選擇該常數(shù)，使得輸出顏色值（R，G，B)顯示圖像 中的對比的可讀范圍。R、G和B是在明場型圖像中的所得的紅色、綠色和藍(lán)色像素值；ζ是 在給定像素位置上觀察到的熒光染料數(shù)量的縮放系數(shù)；和a、b和c是對應(yīng)于明場色空間的 消光系數(shù)；和其中3個值a[Dyen]、b [Dyen]、c [Dyen]，是乘以在使用預(yù)選的或所需的顏色所 定義的虛擬染色中的第η個染料的消光系數(shù)的常數(shù)。
[0149] 優(yōu)選地，對于ζ [Dyel]，ζ [Dye2]，...找到0. 995分位數(shù)，并選擇常數(shù)，使得： min (exp (-a[Dyen]*z[Dyen]), exp (~b[Dyen]*z[Dyen]), exp(~c[Dyen]*z[Dyen]))= 1/255。
[0150] 這導(dǎo)致輸出顏色的動態(tài)范圍幾乎填充8位圖像的可能的動態(tài)范圍，并產(chǎn)生強烈對 比。
[0151] 在其合成后，銳化變換可用于虛擬染色圖像。在一個實施方案中，所述銳化變換可 作為線性卷積過濾而執(zhí)行，其內(nèi)核是矩陣：
【權(quán)利要求】
1. 提供單個生物樣品的合成圖像的方法，包括以下步驟： (1) 產(chǎn)生所述生物樣品的第一圖像，包括以下步驟： a. 使固體載體上的所述樣品與靶蛋白的第一結(jié)合劑接觸； b. 所述樣品用提供形態(tài)學(xué)信息的熒光標(biāo)記來染色； c. 通過熒光檢測來自第一結(jié)合劑和所述熒光標(biāo)記的信號； d. 根據(jù)所檢測的熒光信號產(chǎn)生所述樣品的至少部分的第一圖像；和然后 (2) 產(chǎn)生所述生物樣品的第二圖像，包括以下步驟： a. 使來自步驟（1)的同一樣品與至少一種靶核酸序列的每一個的探針接觸因此使所 述探針與所述靶核酸序列雜交； b. 任選地，所述樣品用所述熒光標(biāo)記來染色； c. 通過熒光檢測來自所述靶核酸序列的每一個的探針和所述熒光標(biāo)記的信號；和 d. 根據(jù)所檢測的熒光信號產(chǎn)生所述樣品的至少部分的第二圖像；和 (3) 產(chǎn)生提供所述靶蛋白和所述靶核酸的相對位置的合成圖像。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述合成圖像的產(chǎn)生包括使用在第一圖像的產(chǎn)生和第二圖 像的產(chǎn)生中所得的信號信息以產(chǎn)生所述合成圖像。
3. 權(quán)利要求1的方法，其中所述合成圖像的產(chǎn)生包括登記來自步驟1中所得的熒光標(biāo) 記的信號位置以及來自步驟2中所得的熒光標(biāo)記的信號位置。
4. 權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中步驟（I) (d)包括： (i) 根據(jù)所檢測的熒光信號產(chǎn)生所述樣品的至少部分的初始圖像；和 (ii) 根據(jù)所述初始圖像選擇目標(biāo)區(qū)，和通過熒光檢測來自至少第一結(jié)合劑和所述熒光 標(biāo)記的信號，以比所述初始圖像更高的分辨率產(chǎn)生第一圖像。
5. 權(quán)利要求4的方法，其中通過合并來自更高分辨率圖像和第二圖像的信號信息而產(chǎn) 生所述合成圖像。
6. 權(quán)利要求4-5中任一項的方法，包括登記來自更高分辨率圖像中的熒光標(biāo)記的信號 位置以及來自第二圖像中的熒光標(biāo)記的信號位置。
7. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中在產(chǎn)生第一圖像中的檢測步驟或在產(chǎn)生第二圖 像中的檢測步驟進(jìn)一步包括檢測所述生物樣品的自發(fā)熒光。
8. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述合成圖像的產(chǎn)生包括登記來自步驟1中所 得的熒光標(biāo)記的信號位置以及來自步驟2中所得的熒光標(biāo)記的信號位置。
9. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中產(chǎn)生第一圖像的步驟進(jìn)一步包括：在產(chǎn)生所述 樣品的圖像之前，產(chǎn)生全部固體載體的較低分辨率圖像和將所述樣品放在所述固體載體 上。
10. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中產(chǎn)生第一圖像和/或產(chǎn)生第二圖像包括產(chǎn)生 明場型圖像，其類似于明場染色。
11. 權(quán)利要求11的方法，其中所述明場型圖像類似于模擬的H&E圖像。
12. 權(quán)利要求11的方法，其中所述明場型圖像類似于模擬的DAB圖像。
13. 權(quán)利要求10-12中任一項的方法，其中至少部分地根據(jù)來自第一圖像的明場型圖 像的形態(tài)學(xué)信息而選擇目標(biāo)區(qū)。
14. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，進(jìn)一步包括在接觸步驟（I) (a)之前的抗原恢復(fù)步 驟。
15. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，在步驟（I) (a)中進(jìn)一步包括第一結(jié)合劑與所述靶 蛋白的物理結(jié)合。
16. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述結(jié)合劑是對所述靶蛋白具有特異性的抗 體。
17. 權(quán)利要求16的方法，其中所述抗體用熒光團(tuán)標(biāo)記。
18. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述革巴蛋白選自細(xì)胞角蛋白、cyclin Dl、 cyclin Bl、Ki67、ER、AR、PI3K、cMET、EGFR、cMyc、PTEN、MAPK、EGFR 和 HER2。
19. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中在步驟（I) (a)中，使所述樣品還與提供額外 的形態(tài)學(xué)信息的至少一種額外的結(jié)合劑接觸；和在步驟（I) (c)中，還通過熒光檢測來自至 少一種額外的結(jié)合劑的信號。
20. 權(quán)利要求19的方法，其中所述至少一種額外的結(jié)合劑包括針對以下的抗體：角蛋 白 15、19、E-鈣黏蛋白、Na+K+ATP 酶、Claudin 1、膠原 IV、EPCAM、纖連蛋白、glut 1、SMA、波 形蛋白、平滑肌肌動蛋白、CD31和全-細(xì)胞角蛋白。
21. 權(quán)利要求19的方法，其中所述額外的形態(tài)學(xué)信息包括組織來源、細(xì)胞來源、腫瘤、 正常區(qū)和基質(zhì)區(qū)、細(xì)胞類型和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)例如細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核。
22. 權(quán)利要求19的方法，其中所述額外形態(tài)學(xué)信息包括上皮起源的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)位置 的有關(guān)?目息。
23. 權(quán)利要求19-22中任一項的方法，在步驟（I) (a)中進(jìn)一步包括第一結(jié)合劑與所 述蛋白的物理結(jié)合，以及至少一種額外的結(jié)合劑與位于所述樣品的特定區(qū)室內(nèi)的蛋白的結(jié) 合。
24. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述熒光標(biāo)記包括4'，6-二脒基-2-苯基吲 哚（DAPI)、伊紅、Hoechst 33258和Hoechst 33342 (兩種雙苯酰亞胺）、碘化丙啶、奎納克 林、熒光素-鬼筆環(huán)肽、色霉素 A 3、吖啶黃-福爾根反應(yīng)、金胺0-福爾根反應(yīng)和溴化乙錠。
25. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述熒光標(biāo)記使細(xì)胞核染色。
26. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，進(jìn)一步包括在步驟（2) (a)之前用蛋白酶消化所述 樣品。
27. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中在步驟（2) (a)中，所述雜交反應(yīng)選自FISH、 IQ-FISH、原位PCR、滾環(huán)擴(kuò)增和引物原位標(biāo)記。
28. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述雜交反應(yīng)是FISH，和所述反應(yīng)進(jìn)一步包 括識別目標(biāo)核酸序列所在的染色體的每一條的探針。
29. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述探針包括核酸探針、肽核酸探針、鎖核酸 探針、mRNA探針、miRNA探針或siRNA探針。
30. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述探針被熒光標(biāo)記。
31. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述靶核酸包括以下的核酸序列：EGFR、 T0P2A、cMyc、ALK、FGFRl 和 HER2。
32. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中在步驟（I) (d)之后，來自第一結(jié)合劑的熒光 信號被改變。
33. 權(quán)利要求32的方法，其中所述熒光信號通過化學(xué)試劑而改變。
34. 權(quán)利要求32的方法，其中步驟（I) (a)至（I) (d)用針對不同蛋白的另一結(jié)合劑來 重復(fù)進(jìn)行。
35. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中在步驟（2) (d)之后，來自所述探針的熒光信 號通過氧化、剝離、光褪色或其混合而改變，和步驟（2) (a)至（2) (d)用針對額外的目標(biāo)核 酸序列的探針來重復(fù)進(jìn)行。
36. 分析生物樣品的方法，包括提供權(quán)利要求1的生物樣品的合成圖像，和根據(jù)所述合 成圖像分析蛋白表達(dá)和目標(biāo)核酸序列。
37. 權(quán)利要求36的方法，其中所述樣品包括細(xì)胞或組織樣品。
38. 權(quán)利要求36-37中任一項的方法，其中所述樣品包括福爾馬林固定的、石蠟包埋的 (FFPE)組織樣品。
39. 權(quán)利要求36-38中任一項的方法，其中在步驟（I) (a)中，使所述樣品還與提供額外 的形態(tài)學(xué)信息的至少一種額外的結(jié)合劑接觸；和在步驟（I) (c)中，還通過熒光檢測來自至 少一種額外的結(jié)合劑的信號。
40. 權(quán)利要求36-39中任一項的方法，進(jìn)一步包括通過將來自第一結(jié)合劑的熒光信號 映射到參考顏色查詢表，創(chuàng)建靶蛋白表達(dá)水平的RGB顏色混合熱圖圖像。
41. 權(quán)利要求39的方法，進(jìn)一步包括對于第一圖像創(chuàng)建顏色混合的合成圖像，所述合 成圖像包括所述靶蛋白、至少一種額外的結(jié)合劑所代表的形態(tài)學(xué)信息和所述熒光標(biāo)記的圖 像。
42. 權(quán)利要求36-41中任一項的方法，其中所述樣品是FFPE組織樣品，第一結(jié)合劑是 HER2的抗體，一種或多種額外的結(jié)合劑是全-細(xì)胞角蛋白抗體合劑，所述熒光標(biāo)記是DAPI， 所述目標(biāo)核酸序列是HER2。
43. 試劑盒，包括用于在同一生物樣品上熒光檢測蛋白以及熒光檢測靶核酸序列的組 分。
44. 系統(tǒng)，包括用于在同一生物樣品上進(jìn)行熒光檢測蛋白以及靶核酸序列的工具。
45. 產(chǎn)生單個生物樣品的第一和第二圖像的方法，包括以下步驟： (1) 產(chǎn)生所述生物樣品的第一圖像，包括以下步驟： a. 使固體載體上的所述樣品與靶蛋白的第一結(jié)合劑接觸； b. 所述樣品用提供形態(tài)學(xué)信息的熒光標(biāo)記來染色； c. 通過熒光檢測來自第一結(jié)合劑和所述熒光標(biāo)記的信號； d. 根據(jù)所檢測的熒光信號產(chǎn)生所述樣品的至少部分的第一圖像；和然后 (2) 產(chǎn)生所述生物樣品的第二圖像，包括以下步驟： a. 使來自步驟（1)的同一樣品與至少一種靶核酸序列的每一個的探針接觸因此使所 述探針與所述靶核酸序列雜交； b. 任選地，所述樣品用所述熒光標(biāo)記來染色； c. 通過熒光檢測來自所述靶核酸序列的每一個的探針和所述熒光標(biāo)記的信號；和 d. 根據(jù)所檢測的熒光信號產(chǎn)生所述樣品的至少部分的第二圖像。
46. 權(quán)利要求45的方法，其中產(chǎn)生第一圖像包括，在通過熒光檢測來自第一結(jié)合劑和 所述熒光標(biāo)記的信號后， (i)根據(jù)所檢測的熒光信號產(chǎn)生所述樣品的至少部分的初始圖像；和 (i i)根據(jù)所述初始圖像選擇目標(biāo)區(qū)，和通過熒光檢測來自至少第一結(jié)合劑和所述熒光 標(biāo)記的信號，以比所述初始圖像更高的分辨率產(chǎn)生第一圖像。
【文檔編號】G01N33/574GK104520713SQ201380017702
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年3月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月30日
【發(fā)明者】E. 塞波 A., 金蒂 F., B. 肯尼 K., L. 亨德森 D., J. 格德斯 M., I. 拉里拉莫雷諾 A., 劉 X., D. 科文 A., E. 青格列維奇 S., 哈 T., R. 軍 N., 基什圖巴耶夫 A., A. 霍爾曼－休格利 D., 李 Y. 申請人:克拉里安特診斷服務(wù)公司