基于多項(xiàng)目混合熒光免疫反應(yīng)的分光分析法
【專利摘要】一種基于多項(xiàng)目混合熒光免疫反應(yīng)的分光分析法，是建立一個(gè)多項(xiàng)目混合熒光免疫反應(yīng)體系和反應(yīng)后分光檢測(cè)體系，用不同的熒光染料分別制備熒光結(jié)合物，混合在固相載體上反應(yīng)，利用不同的熒光染料具有特定的、不同的激發(fā)光波長(zhǎng)與發(fā)射光波長(zhǎng)的性質(zhì)，在檢測(cè)時(shí)通過(guò)將某一熒光染料的激發(fā)光波長(zhǎng)與其發(fā)射光波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的信號(hào)接收器聯(lián)動(dòng)，連續(xù)、逐一進(jìn)行熒光免疫反應(yīng)后的分光分析，實(shí)現(xiàn)對(duì)各項(xiàng)目的分別測(cè)定。本發(fā)明可以將多個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目組合在一起，一次完成，可有效地增加檢測(cè)通量，提高檢驗(yàn)效率。
【專利說(shuō)明】基于多項(xiàng)目混合熒光免疫反應(yīng)的分光分析法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥檢測(cè)技術(shù)，特別涉及一種基于多項(xiàng)目混合熒光免疫反應(yīng)的分光分析法。
【背景技術(shù)】
[0002]免疫標(biāo)記技術(shù)是將某種可微量或超微量測(cè)定的物質(zhì)(如放射性核素、熒光染料、酶等)作為示蹤物標(biāo)記于抗體或抗原上制成標(biāo)記物，利用抗原-抗體特異性反應(yīng)原理，建立相應(yīng)的反應(yīng)體系，以檢測(cè)標(biāo)記物的有無(wú)或含量來(lái)間接反映樣品中待檢抗原或抗體的有無(wú)或量的多少。
[0003]突光免疫技術(shù)屬于標(biāo)記免疫技術(shù)的一種。是以突光染料為示蹤物標(biāo)記抗體或抗原，利用抗原抗體反應(yīng)的原理，實(shí)現(xiàn)定性或定量分析的技術(shù)。應(yīng)用上主要分兩大類:免疫組織化學(xué)(包括流式細(xì)胞術(shù))和熒光免疫測(cè)定。免疫組織化學(xué)主要應(yīng)用熒光染料標(biāo)記抗體，與組織或細(xì)胞中的抗原結(jié)合，在專用顯微鏡下觀察經(jīng)激發(fā)光激發(fā)的熒光，對(duì)相應(yīng)的抗原進(jìn)行定性或/和定位，也稱為熒光抗體技術(shù)；或與混合細(xì)胞成分作用，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞的分類研究。
[0004]熒光免疫測(cè)定是用熒光染料標(biāo)記抗體或抗原，利用抗原抗體反應(yīng)的特異性和熒光染料的檢測(cè)靈敏度，對(duì)生物材料(血液、尿液等體液或組織提取液、細(xì)胞培養(yǎng)液等)中水溶性成分進(jìn)行定性或定量測(cè)定。
[0005]近年來(lái)，免疫金斑點(diǎn)滲濾法和免疫層析法得到了迅速的發(fā)展和應(yīng)用，其中也包括了熒光法。其基本原理就是將第一抗體(也稱捕獲抗體)標(biāo)記在硝酸纖維素(NC)膜上或其它固相載體的表面上，成為固相抗體，然后將待檢標(biāo)本與標(biāo)記了第二抗體的膠體金或標(biāo)記了熒光染料的第二抗體(熒光結(jié)合物)先后或同時(shí)與捕獲抗體作用，在NC膜上相應(yīng)區(qū)域就形成了反應(yīng)條帶，如果是膠體金就形成肉眼可見(jiàn)的紅色條帶，如果是熒光結(jié)合物，則需在專用儀器內(nèi)讀取熒光強(qiáng)度，根據(jù)膠體金條帶的深淺或熒光強(qiáng)度得出定性或定量的結(jié)果。這兩種方法，操作簡(jiǎn)便，反應(yīng)快捷，被列入POCT(Point Of Care Test)范疇,受到廣泛的關(guān)注。
[0006]一般而言，上述方法一個(gè)試驗(yàn)只能檢測(cè)一個(gè)項(xiàng)目。以免疫層析法為例，每個(gè)測(cè)試條只能檢測(cè)一個(gè)項(xiàng)目，比如肌鈣蛋白I (TnI)測(cè)試條，只能檢測(cè)血清TnI濃度，如果想同時(shí)檢測(cè)肌紅蛋白和肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)的濃度，只有在同一個(gè)測(cè)試條上3個(gè)相鄰的位置上分別標(biāo)記3種相應(yīng)的捕獲抗體，成為所謂的“3合1”(3 in I)測(cè)試條。目前，這種組合測(cè)試條僅是個(gè)例，“層析”條的有限空間限制了更多項(xiàng)目的組合及其應(yīng)用。
[0007]熒光染料研究隨著熒光標(biāo)記技術(shù)的廣泛應(yīng)用取得了飛躍的進(jìn)步。時(shí)間分辨熒光分析法的展開(kāi)、雙光子的應(yīng)用和量子點(diǎn)的研究開(kāi)拓了熒光染料發(fā)展的新的領(lǐng)域。在傳統(tǒng)的熒光染料領(lǐng)域也取得了令人矚目的進(jìn)展。例如僅Alexa Fluor系列熒光染料其發(fā)射光譜從近紫外到近紅外有約20種之多，這就為制備具有不同發(fā)射光譜的熒光結(jié)合物提供了范圍廣泛的選擇可能。
[0008]每種熒光染料均有其特定的激發(fā)光波長(zhǎng)和相應(yīng)的發(fā)射光波長(zhǎng)。獲取激發(fā)光的途徑主要是:連續(xù)白光光源加窄帶濾光片獲取所需單色光；激光二極管和單色LED光源。得益于科技進(jìn)步和制作工藝的發(fā)展，在這些領(lǐng)域都取得了迅速的發(fā)展。從近紫外到近紅外光波段，可以制備出任意波長(zhǎng)的窄帶濾光片；在激光領(lǐng)域，可以定制近紫外到近紅外光波段內(nèi)任意波長(zhǎng)的激光二極管。這樣就可以用不同波長(zhǎng)的激光二極管組合成激發(fā)光源；也可以用連續(xù)白光光源，如鹵素?zé)艋螂療襞c適用的濾光片組合以獲取激發(fā)光源；同時(shí)，LED單色光源的研發(fā)及其功率的提高，其作為激發(fā)光源應(yīng)用的前景值得期待。
[0009]在生物化學(xué)定量測(cè)定中，常利用反應(yīng)中形成的特征性發(fā)色基團(tuán)在特定吸收光譜吸光度的改變實(shí)現(xiàn)定量分析。目前廣泛使用的自動(dòng)化生化分析儀中均利用棱鏡或光柵逐一對(duì)反應(yīng)杯的透射光進(jìn)行分光，在計(jì)算機(jī)的控制下，測(cè)定各個(gè)反應(yīng)杯的特定吸收光譜吸光度的改變而實(shí)現(xiàn)大量樣本的快速檢測(cè)，這一技術(shù)俗稱為“后分光技術(shù)”。其要點(diǎn)在于，將混合光通過(guò)棱鏡或光柵解析還原成“單色光”，在特征光譜的位置設(shè)置光電轉(zhuǎn)換元件(如光電管)固定接受此處的光強(qiáng)度變化，系列的光電管形成一個(gè)陣列，可以根據(jù)使用者的指令，捕捉特定波長(zhǎng)處的光電信息，從而濾除無(wú)關(guān)雜色光的干擾，進(jìn)而對(duì)特定發(fā)色基團(tuán)作出精密的定性或定量分析。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0010]本發(fā)明的目的，就在于提供一種基于多項(xiàng)目混合熒光免疫反應(yīng)的分光分析法。
[0011]本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:一種基于多項(xiàng)目混合熒光免疫反應(yīng)的分光分析法是，建立多項(xiàng)目混合熒光免疫反應(yīng)體系和相應(yīng)的檢測(cè)體系，根據(jù)熒光染料分別具有特定的激發(fā)光波長(zhǎng)與發(fā)射光波長(zhǎng)的性質(zhì)，在檢測(cè)體系中通過(guò)將某一熒光染料激發(fā)光波長(zhǎng)與與其相應(yīng)的發(fā)射光波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的信號(hào)接收器聯(lián)動(dòng)，逐一、連續(xù)進(jìn)行分析，從而實(shí)現(xiàn)分別檢測(cè)；
[0012]所述多項(xiàng)目混合熒光免疫反應(yīng)體系的建立包括以下步驟:
[0013](I)確定項(xiàng)目組合數(shù)N,選定N+1種激發(fā)光波長(zhǎng)不同的突光染料,其中一種突光染料固定用于試劑內(nèi)參照；
[0014](2)根據(jù)項(xiàng)目組合，選擇相應(yīng)的配對(duì)抗體，即捕獲抗體和標(biāo)記抗體；并在(I)所述選定的熒光染料的范圍內(nèi)選擇熒光染料，取標(biāo)記抗體分別制備熒光結(jié)合物，混合成混合熒光結(jié)合物；
[0015](3)將針對(duì)不同被檢測(cè)物的多項(xiàng)目捕獲抗體混合、混勻后，包被于固相載體上；
[0016](4)另選一對(duì)抗原抗體作為內(nèi)參照物，將抗原用步驟(I)所述用于試劑內(nèi)參照的熒光染料，制備熒光結(jié)合物，加入步驟(2)所述混合熒光結(jié)合物中，其抗體與步驟(3)所述捕獲抗體混合后包被于步驟(3)所述固相載體上；
[0017](5)將待檢樣本與上述包含內(nèi)參照物的混合熒光結(jié)合物先后或同時(shí)滴加在上述固相載體上進(jìn)行熒光免疫反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后去除游離熒光結(jié)合物，即為待檢的反應(yīng)區(qū)；
[0018]所述檢測(cè)體系的建立包括以下步驟:
[0019](a)根據(jù)步驟(I)選定的N+1種熒光染料的激發(fā)光波長(zhǎng)，確定激發(fā)光源；
[0020](b)根據(jù)步驟(I)選定的N+1種熒光染料的發(fā)射光波長(zhǎng)定制固定波長(zhǎng)分光檢測(cè)器，在分光光路上與各熒光染料相應(yīng)的發(fā)射光波長(zhǎng)處分別設(shè)置信號(hào)接收器，組成信號(hào)接收器陣列，用于分別接收各選定的熒光染料的發(fā)射光信號(hào)；
[0021]將上述步驟(5)所述反應(yīng)區(qū)置于激發(fā)光的照射區(qū)域，用激發(fā)光源照射，將發(fā)射光聚焦，直接或經(jīng)分光檢測(cè)器檢測(cè)，所得發(fā)射光信號(hào)經(jīng)模/數(shù)轉(zhuǎn)換、計(jì)算機(jī)軟件處理，最終給出檢測(cè)結(jié)果。
[0022]所述多項(xiàng)目混合熒光免疫反應(yīng)體系是指用于包括單項(xiàng)測(cè)定在內(nèi)的I項(xiàng)以上的測(cè)試的反應(yīng)體系，最大的組合項(xiàng)目數(shù)為步驟(I)所述的組合項(xiàng)目數(shù)N。
[0023]步驟(I)中所述熒光染料包括異硫氰酸熒光素、異硫氰酸羅丹明、6-羧基熒光素酰胺酯、熒光烷衍生物類、1，8_萘二酰亞胺類、香豆素類、鑭系元素螯合物、量子點(diǎn)或包裹熒光染料的納米顆粒。
[0024]步驟(3)和步驟(5)中所述固相載體包括硝酸纖維膜、尼龍膜、聚苯乙烯片或膠乳顆粒、納米二氧化硅顆粒、磁性微粒、特殊處理的玻璃表面或玻璃微珠。
[0025]所述分別檢測(cè)的方法，包括常規(guī)發(fā)射光強(qiáng)分析法、時(shí)間分辨熒光分析法中的一種或兩種的組合。
[0026]步驟(a)中所述激發(fā)光源包括激光二極管、單色LED管、窄帶濾光片與連續(xù)白光光源的組合、連續(xù)白光光源或者特定的激發(fā)光。
[0027]所述信號(hào)接收器可以是高敏光電管，或是光導(dǎo)纖維導(dǎo)引至光電倍增管，或是實(shí)時(shí)影像記錄儀。
[0028]步驟(5)中所述突光免疫反應(yīng)包括雙抗體夾心法、雙抗原夾心法、抗原抗體結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)抑制法或間接免疫法。
[0029]所述連續(xù)白光光源包括鹵素?zé)簟㈦艋虬坠釲ED。
[0030]所述特定的激發(fā)光是指量子點(diǎn)的激發(fā)光，以粒徑不同的量子點(diǎn)為熒光染料，可在同一波長(zhǎng)激發(fā)光的作用下，發(fā)出不同波長(zhǎng)的發(fā)射光。
[0031]內(nèi)參照為儀器內(nèi)設(shè)固定必檢通道:即每種組合的每次測(cè)試都自動(dòng)進(jìn)行內(nèi)參照測(cè)試；軟件的數(shù)據(jù)處理是分別以該通道的光強(qiáng)為參比得出各項(xiàng)目相對(duì)光強(qiáng)，依據(jù)同法制備各自的校準(zhǔn)曲線，作為定性或定量的依據(jù)。
[0032]根據(jù)目前的資料，常用熒光染料的激發(fā)/發(fā)射光譜分布于從近紫外到近紅外的廣泛波段內(nèi)，因而可供選擇的熒光染料具有很大的范圍，也就是說(shuō)，可供組合的檢測(cè)項(xiàng)目數(shù)將完全可以滿足絕大多數(shù)情況下的檢測(cè)要求。
[0033]對(duì)于熒光染料來(lái)說(shuō)，其激發(fā)光波長(zhǎng)與發(fā)射光波長(zhǎng)是固定的、特征性的，因而，某一激發(fā)光波長(zhǎng)必須與其發(fā)射光波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的信號(hào)接收器(光電管等)聯(lián)動(dòng)，當(dāng)某一波長(zhǎng)激發(fā)光照射反應(yīng)區(qū)時(shí)，與其對(duì)應(yīng)的信號(hào)接收器同時(shí)啟動(dòng)，接收和輸出信號(hào)。
[0034]內(nèi)參照的設(shè)置是基于兩個(gè)方面的要求，對(duì)反應(yīng)條自身有效性的監(jiān)督和檢測(cè)數(shù)據(jù)的處理:各項(xiàng)目光強(qiáng)與內(nèi)參照物光強(qiáng)的比值是最終報(bào)告的基礎(chǔ)；內(nèi)參照的測(cè)定占用儀器內(nèi)設(shè)固定通道，無(wú)需操作者的指令自動(dòng)完成；也因此，盡管對(duì)每個(gè)項(xiàng)目組合而言可以選擇不同的抗原-抗體對(duì)作為內(nèi)參照，而實(shí)際上所有的項(xiàng)目組合可以使用相同的內(nèi)參照。
[0035]在不同單色激發(fā)光作用下，反應(yīng)區(qū)內(nèi)不同檢測(cè)對(duì)象的熒光結(jié)合物分別發(fā)出不同波長(zhǎng)的熒光，雜色光的產(chǎn)生應(yīng)極少；在預(yù)定項(xiàng)目組合數(shù)較少的情況下，雜色光干擾可以忽略不計(jì)時(shí)，可以無(wú)需分光檢測(cè)，利用光電轉(zhuǎn)換元件如光電管，直接接收發(fā)射光信號(hào)，完成檢測(cè)，這樣，可以簡(jiǎn)化儀器的結(jié)構(gòu)。
[0036]上述單色熒光可能會(huì)混以不同成分的雜光，特別是組合項(xiàng)目多、激發(fā)光譜接近，激發(fā)光譜相鄰的熒光結(jié)合物可能受到影響而產(chǎn)生干擾，這時(shí)，將“單色光”聚焦，引入棱鏡或光柵進(jìn)行分光，在各熒光染料特征發(fā)射光譜處接收光強(qiáng)信號(hào)，即可最大限度地排除雜光的干擾，對(duì)各檢測(cè)對(duì)象做出精密的定性或定量的分析。
[0037]單一激發(fā)光源，如連續(xù)白光光源照射反應(yīng)區(qū)時(shí)，熒光結(jié)合物會(huì)同時(shí)被激發(fā)，形成混合光束，在預(yù)訂項(xiàng)目組合較少，各發(fā)射光譜在峰值處的重疊可以忽略不計(jì)時(shí)，將其引入分光檢測(cè)器，可以無(wú)需單色光激發(fā)器，完成測(cè)試，此一設(shè)計(jì)，可以避免激光二極管或LED管因電源、環(huán)境溫度等外部因素導(dǎo)致的光譜漂移對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，激發(fā)光源結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單。
[0038]量子點(diǎn)熒光是一個(gè)特殊的情況，其激發(fā)光為一特定波長(zhǎng)單色光，熒光的發(fā)射波長(zhǎng)取決于量子點(diǎn)的大小，因而，用量子點(diǎn)為熒光染料時(shí)，可利用特定單色光為激發(fā)光源，經(jīng)分光檢測(cè)器實(shí)現(xiàn)分別檢測(cè)。
[0039]本發(fā)明可以將多個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目組合在一起，一次完成，可有效地增加檢測(cè)通量，減少樣本消耗，降低檢測(cè)成本，提高檢驗(yàn)效率，對(duì)現(xiàn)有的熒光免疫檢測(cè)技術(shù)是一個(gè)突破。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0040]圖1是采用激光二極管(包括LED管)作為激發(fā)光源的示意圖。
[0041]圖2是強(qiáng)光源加平面旋轉(zhuǎn)的單色濾光片獲得激發(fā)光的示意圖。
[0042]圖3是強(qiáng)光源加環(huán)形旋轉(zhuǎn)的單色濾光片獲得激發(fā)光的示意圖。
[0043]圖4是反應(yīng)區(qū)激發(fā)熒光直接檢測(cè)示意圖。
[0044]圖5是分光檢測(cè)熒光發(fā)射光的示意圖。
[0045]圖6是本發(fā)明的方法原理框圖。
【具體實(shí)施方式】
[0046]1.激發(fā)光源的確定
[0047]1.1確定未來(lái)可能需要使用的熒光染料的種類，例如，未來(lái)可能要使用5種熒光染料為① Alexa Fluor 488、② Alexa Fluor 546、③ Alexa Fluor 610、④ Alexa Fluor660、⑤Alexa Fluor 750，另加Alexa Fluor 350作為內(nèi)參照熒光染料。其激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng)分別為 499nm/519nm、561nm/572nm、610nm/629nm、663nm/691nm、752nm/776nm 和346nm/442nm。定制波長(zhǎng)分別是 499nm、561nm、610nm、663nm、752nm 和 346nm 的激光二極管(或LED管)，作為激發(fā)光源。
[0048]1.2定制這6種波長(zhǎng)的窄帶濾光片，與連續(xù)白色光源，組成激發(fā)光源，用以激發(fā)反應(yīng)區(qū)內(nèi)熒光結(jié)合物。
[0049]1.3以連續(xù)白光光源為激發(fā)光源，或其它單一光源為激發(fā)光源(以量子點(diǎn)為熒光染料時(shí))；采取這一激發(fā)光方式，檢測(cè)通道設(shè)置須以發(fā)射光波長(zhǎng)為依據(jù)，也即選定熒光染料時(shí)，發(fā)射光譜不得重疊。
[0050]應(yīng)用時(shí)，可根據(jù)實(shí)際需求，在上述激發(fā)光源中三取其一。
[0051]2.發(fā)射光信號(hào)接收器
[0052]2.1直接接受反應(yīng)區(qū)經(jīng)激發(fā)光激發(fā)的發(fā)射光信號(hào)，這些信號(hào)分別經(jīng)模/數(shù)轉(zhuǎn)換、計(jì)算機(jī)軟件處理，包括校準(zhǔn)曲線的建立，最終給出檢測(cè)結(jié)果。如此構(gòu)成一個(gè)完整的檢測(cè)系統(tǒng)。
[0053]2.2檢測(cè)系統(tǒng)設(shè)置與熒光染料匹配的檢測(cè)通道，如以1.1所舉例的5種熒光染料，則設(shè)①、②、③、④、⑤通道和內(nèi)參照通道。并令激發(fā)光發(fā)射/發(fā)射光接收聯(lián)動(dòng)。設(shè)以①為檢測(cè)Alexa Fluor 546通道，則選擇①通道，即啟動(dòng)499nm激發(fā)光，519nm接收器同時(shí)工作，此即為聯(lián)動(dòng)。操作者根據(jù)不同的項(xiàng)目組合選擇通道，給出指令，儀器則按程序接收和處理指定通道的信號(hào)。
[0054]內(nèi)參照為儀器內(nèi)設(shè)固定必檢通道:即每種組合的每次測(cè)試都自動(dòng)進(jìn)行內(nèi)參照測(cè)試；軟件的數(shù)據(jù)處理是分別以該通道的光強(qiáng)為參比得出各項(xiàng)目相對(duì)光強(qiáng)，依據(jù)同法制備的各自的校準(zhǔn)曲線，作出定性或定量的報(bào)告。
[0055]3.定制分光檢測(cè)器
[0056]3.1定制棱鏡或光柵分光檢測(cè)器，具備與所選定的熒光染料發(fā)射波長(zhǎng)位置相應(yīng)的信號(hào)接受器陣列。以1.1所舉例的6種熒光染料，則須具備519nm、572nm、629nm、691nm、776nm和442nm固定波長(zhǎng)信號(hào)接收器。它們接收經(jīng)分光剔除雜色光干擾的“單色光”信號(hào)，這些信號(hào)分別經(jīng)模/數(shù)轉(zhuǎn)換、計(jì)算機(jī)軟件處理，包括校準(zhǔn)曲線的建立，最終給出檢測(cè)結(jié)果。如此構(gòu)成一個(gè)完整的更為精密的檢測(cè)系統(tǒng)。
[0057]3.2如2.2所述設(shè)置儀器檢測(cè)通道和參比通道。
[0058]4.以上1.1、1.2和2 ;或1.1、1.2和3 ;或1.3和3構(gòu)成激發(fā)/接收分析系統(tǒng)，為以下各種實(shí)施方式所通用。
[0059]4.1免疫滲濾法
[0060]4.1.1設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)臏y(cè)試項(xiàng)目組合，如甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)和糖類抗原50 (CA50)組成腫瘤標(biāo)志物三項(xiàng)，選擇相應(yīng)的配對(duì)抗體。將各自的捕獲抗體和兔IgG (內(nèi)參照試劑)以適當(dāng)?shù)臐舛然旌希瑯?biāo)記在NC膜的表面；NC膜下墊置吸水材料，如多層濾紙，制成反應(yīng)板，備用。
[0061]4.1.2在上述檢測(cè)系統(tǒng)已設(shè)定的固定發(fā)射波長(zhǎng)的5種熒光染料中選擇3種，如①、③、⑤，分別標(biāo)記與上述捕獲抗體配對(duì)的抗體，制備熒光結(jié)合物。另取羊抗兔IgG標(biāo)記以Alexa Fluor 350 (內(nèi)參照試劑)，將這些熒光結(jié)合物以適當(dāng)?shù)臐舛然旌希瑐溆谩?br>
[0062]上述內(nèi)參照試劑，即兔IgG-熒光標(biāo)記羊抗兔IgG系統(tǒng)在各種項(xiàng)目組合和各種方法中通用而且必用。以下各種實(shí)施方法中均包含此系統(tǒng)，不再特別記述。
[0063]4.1.3將定量待檢標(biāo)本加在NC膜上,待滲濾后,加上定量混合突光結(jié)合物,待滲濾完全；或預(yù)先將標(biāo)本與混合熒光結(jié)合物按比例混勻后，定量加到NC膜上，待滲濾完全。
[0064]4.1.4滴加中性緩沖溶液，以求更充分濾除未結(jié)合(游離)的熒光結(jié)合物。
[0065]4.1.5將反應(yīng)板置于檢測(cè)裝置下，操作者選擇①、③、⑤通道，給出指令，進(jìn)行檢測(cè)。得出一組AFP、CEA、CA50的檢測(cè)結(jié)果。
[0066]4.2免疫層析法
[0067]4.2.1設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)臏y(cè)試項(xiàng)目組合，如免疫滲濾法的腫瘤標(biāo)志物三項(xiàng),選擇相應(yīng)的配對(duì)抗體。將各自的捕獲抗體以適當(dāng)?shù)臐舛然旌?，吸附于NC膜上，真空干燥。
[0068]4.2.2在上述檢測(cè)系統(tǒng)已設(shè)定的5種固定發(fā)射波長(zhǎng)的熒光染料中選擇3種，如②、③、⑤，分別標(biāo)記與上述捕獲抗體配對(duì)的抗體，制備熒光結(jié)合物，以適當(dāng)?shù)臐舛然旌?，噴涂在玻璃纖維墊上，真空干燥。
[0069]4.2.3將吸水墊、上述NC膜、玻璃纖維墊和樣品墊依次黏貼在不干膠墊片上，切條，制成免疫層析試驗(yàn)條帶，備用。
[0070]4.2.4將定量待檢標(biāo)本滴加于樣品墊上,待檢標(biāo)本因毛細(xì)作用形成側(cè)向液流,流經(jīng)玻璃纖維墊時(shí)，溶解并帶動(dòng)熒光結(jié)合物流過(guò)NC膜上的捕獲抗體帶，完成反應(yīng)，未結(jié)合物隨液流繼續(xù)前行，為吸水墊所容留。
[0071]4.2.5將反應(yīng)完全的條帶置于檢測(cè)裝置下，選擇②、③、⑤通道，給出指令，進(jìn)行測(cè)試。得出標(biāo)本的AFP、CEA和CA50的定量結(jié)果。
[0072]4.3常規(guī)微孔板熒光免疫檢測(cè)法
[0073]4.3.1設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)臏y(cè)試項(xiàng)目組合，如免疫滲濾法的腫瘤標(biāo)志物三項(xiàng),選擇相應(yīng)的配對(duì)抗體。將各自的捕獲抗體以適當(dāng)?shù)臐舛然旌?，吸附于微孔中。洗去未結(jié)合物，拍干備用。
[0074]4.3.2在上述檢測(cè)系統(tǒng)已設(shè)定的5種固定發(fā)射波長(zhǎng)的熒光染料中選擇3種，如②、
③、④分別標(biāo)記與上述捕獲抗體配對(duì)的抗體，制備熒光結(jié)合物，以適當(dāng)?shù)臐舛然旌?，備用?br>
[0075]4.3.3將定量待檢標(biāo)本加入微孔，溫育固定時(shí)間后，洗去未結(jié)合物，拍干；
[0076]4.3.4將定量突光結(jié)合物混合物加入微孔,溫育固定時(shí)間后，洗去未結(jié)合物，拍干;
[0077]上述4.3.3和4.3.4操作可并為一步進(jìn)行。
[0078]4.3.5將微孔置于檢測(cè)裝置下，選擇②、③、④通道，給出指令，進(jìn)行測(cè)試。得出標(biāo)本的AFP、CEA和CA50的定量結(jié)果。
[0079]4.4上述3種檢測(cè)方式中同一種項(xiàng)目組合應(yīng)用了 3種熒光染料的不同組合，意在說(shuō)明，在選定的熒光染料范圍內(nèi)，允許任意挑選、組合使用。
[0080]如圖1所示，不同波長(zhǎng)的激光二極管(或LED管)I圍繞反應(yīng)區(qū)5并以此為共同的“聚焦”點(diǎn)，形成對(duì)稱的倒錐形排列。在二極管陣列與反應(yīng)區(qū)之間有一旋轉(zhuǎn)的遮光板2，上面開(kāi)有一個(gè)孔3，它經(jīng)過(guò)每個(gè)二極管發(fā)出的光路，這樣可以連續(xù)獲得所需的單色激發(fā)光，同時(shí)保證在任一個(gè)時(shí)點(diǎn)只有一束激光可以投照到反應(yīng)區(qū)5。通過(guò)電路控制，使陣列中的二極管相繼開(kāi)關(guān)，在任一時(shí)點(diǎn)只有一個(gè)二極管處于開(kāi)啟狀態(tài)，即在任何時(shí)點(diǎn)只有一個(gè)二極管發(fā)光時(shí)，可以取消遮光板的設(shè)置。
[0081]如圖2所示，單色激發(fā)光的獲取，可以采用連續(xù)白光光源6經(jīng)窄帶濾光片8實(shí)現(xiàn)。在旋轉(zhuǎn)的濾光板7上，沿圓周對(duì)稱鑲嵌排列所選定的窄帶濾光片，置于光源與反應(yīng)區(qū)5之間，這樣可以連續(xù)獲得所需的單色激發(fā)光，同時(shí)保證在任一時(shí)點(diǎn)只有一種單色光投照在反應(yīng)區(qū)上。
[0082]如圖3所示，窄帶濾光片8可以排列鑲嵌在濾光環(huán)9上。光源6置于濾光環(huán)內(nèi)。濾光環(huán)旋轉(zhuǎn)，可以連續(xù)獲得所需的單色激發(fā)光，同時(shí)保證在任一時(shí)點(diǎn)只有一種單色光投照在反應(yīng)區(qū)上。
[0083]如圖1、圖2、圖3所示，激發(fā)光與反應(yīng)區(qū)平面形成一個(gè)夾角。此角度的合理取值，應(yīng)由實(shí)驗(yàn)確定。
[0084]如圖4所示，在雜色光的干擾可忽略不計(jì)時(shí)，反應(yīng)區(qū)5經(jīng)單色激發(fā)光激發(fā)的熒光經(jīng)聚焦系統(tǒng)10直接由接收器11接收信號(hào)。
[0085]如圖5所示，反應(yīng)區(qū)5由單色激發(fā)光激發(fā)所產(chǎn)生的發(fā)射光(包括多少不一的雜色光)經(jīng)聚焦系統(tǒng)10被引入棱鏡(或光柵)12分光，形成單色光束13，分別由接收器陣列14接收和輸出。
[0086]圖6是本發(fā)明的方法原理框圖，混合免疫熒光反應(yīng)在反應(yīng)區(qū)形成反應(yīng)產(chǎn)物的混合(混合的熒光結(jié)合物存在其中)；混合的熒光結(jié)合物經(jīng)單色激發(fā)光激發(fā)可直接測(cè)量，或經(jīng)后分光的進(jìn)一步過(guò)濾、解析、還原，從而實(shí)現(xiàn)多個(gè)檢驗(yàn)項(xiàng)目同時(shí)(多通道)分析檢測(cè)。
【權(quán)利要求】
1.一種基于多項(xiàng)目混合突光免疫反應(yīng)的分光分析法，其特征在于:建立多項(xiàng)目混合突光免疫反應(yīng)體系和相應(yīng)的檢測(cè)體系，根據(jù)熒光染料分別具有特定的激發(fā)光波長(zhǎng)與發(fā)射光波長(zhǎng)的性質(zhì)，在檢測(cè)體系中通過(guò)將某一熒光染料激發(fā)光波長(zhǎng)與與其相應(yīng)的發(fā)射光波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的信號(hào)接收器聯(lián)動(dòng)，逐一、連續(xù)進(jìn)行分析，從而實(shí)現(xiàn)分別檢測(cè)； 所述多項(xiàng)目混合熒光免疫反應(yīng)體系的建立包括以下步驟: (1)確定項(xiàng)目組合數(shù)N，選定N+1種激發(fā)光波長(zhǎng)不同的熒光染料，其中一種熒光染料固定用于試劑內(nèi)參照； (2)根據(jù)項(xiàng)目組合，選擇相應(yīng)的配對(duì)抗體，即捕獲抗體和標(biāo)記抗體；并在(I)所述選定的突光染料的范圍內(nèi)選擇突光染料，取標(biāo)記抗體分別制備突光結(jié)合物，混合成混合突光結(jié)合物； (3)將針對(duì)不同被檢測(cè)物的多項(xiàng)目捕獲抗體混合、混勻后，包被于固相載體上； (4)另選一對(duì)抗原抗體作為內(nèi)參照物，將抗原用步驟(1)所述用于試劑內(nèi)參照的熒光染料，制備熒光結(jié)合物，加入步驟(2)所述混合熒光結(jié)合物中，其抗體與步驟(3)所述捕獲抗體混合后包被于步驟(3)所述固相載體上； (5)將待檢樣本與上述包含內(nèi)參照物的混合突光結(jié)合物先后或同時(shí)滴加在上述固相載體上進(jìn)行熒光免疫反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后去除游離熒光結(jié)合物，即為待檢的反應(yīng)區(qū)； 所述檢測(cè)體系的建立包括以下步驟: (a)根據(jù)步驟(1)選定的N+1種熒光染料的激發(fā)光波長(zhǎng)，確定激發(fā)光源； (b)根據(jù)步驟(1)選定的N+1種熒光染料的發(fā)射光波長(zhǎng)定制固定波長(zhǎng)分光檢測(cè)器，在分光光路上與各熒光染料相應(yīng)的發(fā)射光波長(zhǎng)處分別設(shè)置信號(hào)接收器，組成信號(hào)接收器陣列，用于分別接收各選定的熒光染料的發(fā)射光信號(hào)； 將上述步驟(5)所述反應(yīng)區(qū)置于激發(fā)光的照射區(qū)域，用激發(fā)光源照射，將發(fā)射光聚焦，直接或經(jīng)分光檢測(cè)器檢測(cè)，所得發(fā)射光信號(hào)經(jīng)模/數(shù)轉(zhuǎn)換、計(jì)算機(jī)軟件處理，最終給出檢測(cè)結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于多項(xiàng)目混合熒光免疫反應(yīng)的分光分析法，其特征在于:所述多項(xiàng)目混合熒光免疫反應(yīng)體系是指用于包括單項(xiàng)測(cè)定在內(nèi)的I項(xiàng)以上的測(cè)試的反應(yīng)體系，最大的組合項(xiàng)目數(shù)為步驟(1)所述的組合項(xiàng)目數(shù)N。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于多項(xiàng)目混合熒光免疫反應(yīng)的分光分析法，其特征在于:步驟(1)中所述熒光染料包括異硫氰酸熒光素、異硫氰酸羅丹明、6-羧基熒光素酰胺酯、熒光烷衍生物類、1，8_萘二酰亞胺類、香豆素類、鑭系元素螯合物、量子點(diǎn)或包裹熒光染料的納米顆粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于多項(xiàng)目混合熒光免疫反應(yīng)的分光分析法，其特征在于:步驟⑶和步驟(5)中所述固相載體包括硝酸纖維膜、尼龍膜、聚苯乙烯片或膠乳顆粒、納米二氧化硅顆粒、磁性微粒、特殊處理的玻璃表面或玻璃微珠。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于多項(xiàng)目混合熒光免疫反應(yīng)的分光分析法，其特征在于:所述分別檢測(cè)的方法，包括常規(guī)發(fā)射光強(qiáng)分析法、時(shí)間分辨熒光分析法中的一種或兩種的組合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于多項(xiàng)目混合熒光免疫反應(yīng)的分光分析法，其特征在于:步驟(a)中所述激發(fā)光源包括激光二極管、單色LED管、窄帶濾光片與連續(xù)白光光源的組合、連續(xù)白光光源或者特定的激發(fā)光。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于多項(xiàng)目混合熒光免疫反應(yīng)的分光分析法，其特征在于:所述信號(hào)接收器可以是高敏光電管，或是光導(dǎo)纖維導(dǎo)引至光電倍增管，或是實(shí)時(shí)影像記錄儀。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于多項(xiàng)目混合熒光免疫反應(yīng)的分光分析法，其特征在于:步驟(5)中所述熒光免疫反應(yīng)包括雙抗體夾心法、雙抗原夾心法、抗原抗體結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)抑制法或間接免疫法。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于多項(xiàng)目混合熒光免疫反應(yīng)的分光分析法，其特征在于:所述連續(xù)白光光源包括鹵素?zé)?、氙弧燈或白光LED。
10. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于多項(xiàng)目混合熒光免疫反應(yīng)的分光分析法，其特征在于:所述特定的激發(fā)光是指量子點(diǎn)的激發(fā)光，以粒徑不同的量子點(diǎn)為熒光染料，可在同一波長(zhǎng)激發(fā)光的作用下，發(fā)出不同波長(zhǎng)的發(fā)射光。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK103743897SQ201410045888
【公開(kāi)日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2014年2月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月8日
【發(fā)明者】于方治 申請(qǐng)人:于方治