一種高細(xì)胞毒活性cik細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞免疫治療用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高細(xì)胞毒活性CIK細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞免疫治療用途，該CIK細(xì)胞通過如下步驟制備：(1)取患者外周血，收集外周血單個核細(xì)胞部分；(2)將步驟(1)收集的外周血單個核細(xì)胞部分離心，棄去上清液，獲得單個核細(xì)胞；(3)取單個核細(xì)胞按照1×106/mL細(xì)胞，加入含500～2000IU/mLγ干擾素和80～120ng/mL化合物(Ⅰ)的完全培養(yǎng)基，開始誘導(dǎo)培養(yǎng)；完全培養(yǎng)基包括含體積百分比為10％FBS的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液；(4)步驟(3)的細(xì)胞培養(yǎng)20～28小時后，加入50～1000ng/mL抗人CD3單克隆抗體和500～2000IU/mL重組人IL?2，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，每隔2～3天傳代培養(yǎng)一次，誘導(dǎo)培養(yǎng)時間為13～21天，獲得CIK細(xì)胞。該CIK細(xì)胞可用于腫瘤細(xì)胞免疫治療。
【專利說明】
一種高細(xì)胞毒活性c IK細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞免疫治療用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞免疫領(lǐng)域，具體涉及一種用于腫瘤細(xì)胞免疫治療的高細(xì)胞毒活性 CIK細(xì)胞以及制備該高細(xì)胞毒活性CIK細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 免疫治療作為腫瘤綜合治療的第四種模式，越來越受到重視。腫瘤免疫治療主要 包括腫瘤疫苗治療、細(xì)胞因子治療、過繼性細(xì)胞免疫治療及單克隆抗體免疫治療等。腫瘤疫 苗是利用腫瘤細(xì)胞或腫瘤抗原物質(zhì)誘導(dǎo)機(jī)體的特異性細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體 的抗癌能力，阻止腫瘤的生長、擴(kuò)散和復(fù)發(fā)。用于抗腫瘤研究的細(xì)胞因子主要有干擾素類、 白細(xì)胞介素類、集落刺激因子類等，其中以IFN-α、IL-2、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子為多。過 繼性細(xì)胞免疫包括淋巴細(xì)胞因子活化的殺傷細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞、DC-CIK等。單克隆抗體免疫療法的現(xiàn)有研究結(jié)果表明，腫瘤分子靶向治療具有較好的安全性和 有效性，如小分子表皮生長因子受體(EGFR)、酪氨酸激酶抑制劑、抗EGFR單克隆抗體、抗血 管內(nèi)皮生長因子單克隆抗體以及其他分子靶向治療藥物，已在臨床中取得較好的療效。
[0003] 目前用于腫瘤細(xì)胞免疫治療的免疫活性細(xì)胞主要有腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞(TIL)、 樹突狀細(xì)胞(DC)以及細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)等。CIK細(xì)胞是一種殺傷力強(qiáng)的免疫活 性細(xì)胞，其主要效應(yīng)細(xì)胞的表面標(biāo)志為CD3+CD56+，與其他過繼性免疫治療細(xì)胞相比，具有增 殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣等優(yōu)點。但是，腫瘤病人免疫功能受損，免疫細(xì)胞功能減 弱，因此，來源于腫瘤病人外周血制備的CIK細(xì)胞殺傷腫瘤能力低下，影響CIK細(xì)胞療效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于腫瘤細(xì)胞免疫治療的高細(xì)胞毒活性CIK細(xì)胞以及 制備該高細(xì)胞毒活性CIK細(xì)胞的方法，該CIK細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖力，⑶3+、⑶8+和⑶3+⑶56+ 細(xì)胞的比例高，并且對腫瘤治療效果優(yōu)異。
[0005] 上述目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0006] -種用于腫瘤細(xì)胞免疫治療的高細(xì)胞毒活性CIK細(xì)胞，通過如下步驟制備：（1)取 患者外周血，收集外周血的單個核細(xì)胞部分；（2)將步驟（1)收集的外周血的單個核細(xì)胞部 分離心，棄去上清液，獲得單個核細(xì)胞；（3)取單個核細(xì)胞按照1 X 106/mL細(xì)胞，加入含500~ 2000IU/mLy干擾素和80~120ng/mL如下結(jié)構(gòu)所示化合物（I)的完全培養(yǎng)基，開始誘導(dǎo)培 養(yǎng);其中，完全培養(yǎng)基，包括含體積百分比為1 〇 %FBS的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液；（4)步驟(3) 的細(xì)胞培養(yǎng)20~28小時后，加入50~1000ng/mL抗人CD3單克隆抗體和500~2000IU/mL重組 人IL-2,繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，其中，每隔2~3天傳代培養(yǎng)一次，整個誘導(dǎo)培養(yǎng)的時間為13~21天， 獲得高細(xì)胞毒活性CIK細(xì)胞;化合物(I)結(jié)構(gòu)為：
[0008] 進(jìn)一步地，步驟（1)所述收集外周血的單個核細(xì)胞部分的方法為：（a)患者外周血 中，加入1~1.5倍體積的不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液或pH7.2PBS緩沖液稀釋，充分混勻；其中， 細(xì)胞培養(yǎng)液包括:RPMI1640培養(yǎng)液和頂DM培養(yǎng)液；（b)將步驟(a)獲得的血液稀釋液加入到 淋巴細(xì)胞分離液的界面上；（c)1500~2500轉(zhuǎn)/分鐘，離心15~20分鐘，收集中間層，獲得單 個核細(xì)胞。
[0009] 進(jìn)一步地，步驟（1)中所述收集外周血的單個核細(xì)胞部分的方法為:患者經(jīng)采用血 細(xì)胞分離機(jī)上的淋巴細(xì)胞采集程序，單采集患者的外周血單個核細(xì)胞。
[0010] 進(jìn)一步地，步驟⑵中，離心的轉(zhuǎn)速為1〇〇〇~1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心的時間為7~10分 鐘。
[0011] 進(jìn)一步地，步驟(4)所述繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，每2~3天用含500~2000IU/mL重組人IL-2 的完全培養(yǎng)基或含500~2000IU/mL重組人IL-2和100~500IU/mL重組人IL-1的完全培養(yǎng)基 傳代培養(yǎng)。
[0012] 上述化合物(I)在制備高細(xì)胞毒活性的CIK細(xì)胞中的應(yīng)用。
[0013] 上述用于腫瘤細(xì)胞免疫治療的高細(xì)胞毒活性CIK細(xì)胞在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng) 用。
[0014] 有益效果：
[0015] 本發(fā)明提供了一種用于腫瘤細(xì)胞免疫治療的高細(xì)胞毒活性CIK細(xì)胞以及制備該高 細(xì)胞毒活性CIK細(xì)胞的方法，該CIK細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖力，CD3+、⑶8+和⑶3+⑶56+細(xì)胞的比 例高，并且對腫瘤治療效果優(yōu)異，可用于腫瘤的細(xì)胞免疫治療。
【具體實施方式】
[0016] 下面結(jié)合實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容。以下實施例中，所用的原料或 試劑除特別說明外，均為市售可得。所述患者指需要進(jìn)行CIK細(xì)胞免疫治療的患者，如癌癥 患者。另外，以下實施例中，涉及的完全培養(yǎng)基為含10 % (體積百分比)FBS的RPMI 1640培養(yǎng) 液;冷凍保護(hù)劑是含10 % (體積百分比）DMS0的培養(yǎng)基，其中，該培養(yǎng)基是由70 % (體積百分 比)RPMI1640培養(yǎng)液和20% (體積百分比)FBS(胎牛血清)所構(gòu)成。化合物（I)自制。
[0017] 實施例1 :CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)制備和檢測
[0018] 一、CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)制備
[0019] (1)取患者外周血30mL加入等體積RPMI 1640培養(yǎng)液（Invitrogen公司），充分混 勻。
[0020] (2)將步驟（1)獲得的倍比稀釋的外周血60mL，加入到30mL淋巴細(xì)胞分離液(上海 華精生物高科技有限公司）（比重1.077)的界面上(不要破壞界面），以2000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20 分鐘，取中間層一富含淋巴細(xì)胞的白膜層，加入完全培養(yǎng)基20mL。取少量細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計數(shù) 及苔盼蘭活細(xì)胞計數(shù)染色，結(jié)果顯示，活細(xì)胞達(dá)99 %。
[0021 ] (3)將步驟(2)獲得的含有完全培養(yǎng)基的白膜層，以1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，棄 上清液，沉淀為單個核細(xì)胞。
[0022] (4)加入完全培養(yǎng)基，細(xì)胞計數(shù)，用完全培養(yǎng)基調(diào)整單個核細(xì)胞濃度為1 X 106/mL。
[0023] (5)按照1 X 106/mL細(xì)胞，加入γ -IFN(Pepr〇teCh公司）和化合物（I)使其濃度分別 為1000 IU/mL和100ng/mL，置37 °C、5 % C〇2培養(yǎng)箱中，開始誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0024] (6)步驟(5)的細(xì)胞培養(yǎng)24小時后，在培養(yǎng)的細(xì)胞中，加入500ng/mL抗人CD3單克隆 抗體(Biolegend公司）和1000IU/mL重組人IL-2(Peprotech公司），置37°C、5%⑶2培養(yǎng)箱 中，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，從而獲得CIK細(xì)胞。CIK細(xì)胞鑒定方法:細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增，⑶3+CD56+雙陽性標(biāo) 志細(xì)胞數(shù)量升高，殺傷腫瘤細(xì)胞能力增強(qiáng)(非MHC限制性）。
[0025]其中，單個核細(xì)胞中加入γ -IFN和化合物（I)，經(jīng)培養(yǎng)24小時后(誘導(dǎo)第1天），光鏡 觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞活化透亮，折光性強(qiáng)。在單個核細(xì)胞中加入抗人CD3單克隆抗體和重組人IL-2,經(jīng)培養(yǎng)24小時后(誘導(dǎo)第2天），光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞聚集，并且有很多小集落開始形成，細(xì) 胞明顯增大。
[0026] (7)誘導(dǎo)培養(yǎng)的第四天，細(xì)胞傳代。按照1份CIK細(xì)胞原液，加入3份含1000IU/mL重 組人IL-2的完全培養(yǎng)基。同時，取樣檢測CIK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)，流式細(xì)胞儀檢測⑶3、⑶56、⑶4、 CD8陽性細(xì)胞數(shù)，檢測CIK細(xì)胞殺傷K562腫瘤細(xì)胞活性。
[0027] (8)此后，每3天按照上述方法，傳代一次，并做相同的檢測。誘導(dǎo)培養(yǎng)的第19天終 止培養(yǎng)。以上方法均在嚴(yán)格無菌環(huán)境內(nèi)進(jìn)行。
[0028] 其中，在誘導(dǎo)第7天時，肉眼下即可觀察到白色斑點，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞集落明 顯增多、增大，大集落成黑團(tuán)，看不清細(xì)胞形態(tài)，周邊游離細(xì)胞飽滿折光性好，大小形態(tài)各 異。
[0029] 二、按照以上方法進(jìn)行誘導(dǎo)制備CIK細(xì)胞的相應(yīng)檢測結(jié)果
[0030] 1、檢測CIK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)
[0031] 檢測方法為：按IX 1〇6單個核細(xì)胞/孔，接種在24孔板內(nèi)，按照上述方法進(jìn)行誘導(dǎo) 制備CIK細(xì)胞和細(xì)胞換液，第7天開始換成25平方厘米細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，對誘導(dǎo)的第0、4、7、 10、13、16、19天，取111^樣本，通過血細(xì)胞計數(shù)儀（日本光電公司，腿1(-6410?)，進(jìn)行(：11(細(xì)胞 擴(kuò)增倍數(shù)檢測，取5次試驗結(jié)果的平均值，繪制生長曲線。由生長曲線可知，CIK細(xì)胞在誘導(dǎo) 培養(yǎng)的第4天開始增值，第7天到第16天進(jìn)入快速增長期，16天后增殖速度趨緩，第19天CIK 細(xì)胞最高增殖642倍，最低291倍，平均增殖482.2倍。
[0032] 2、CIK細(xì)胞的殺傷K562腫瘤細(xì)胞活性的檢測
[0033]患者外周血單個核細(xì)胞誘導(dǎo)制備的CIK細(xì)胞的殺傷K562腫瘤細(xì)胞活性的檢測方法 為:取對數(shù)生長的K562腫瘤細(xì)胞，用含有體積百分比為10%FBS的頂DM培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞數(shù) 為5X104/mL，每孔100yL，鋪于96孔板中，每組設(shè)4個復(fù)孔。取第7、10、13、16、19天(：11(細(xì)胞， 及未經(jīng)培養(yǎng)的單個核細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基調(diào)整誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞數(shù)為1 X 106/mL，取100yL加入 96孔板中，效靶比（即CIK細(xì)胞:K562腫瘤細(xì)胞)20:1，設(shè)空白對照組、效應(yīng)細(xì)胞對照組和靶細(xì) 胞對照組，置37 °C、5 %C02培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48小時后，加入20yL CCK-8(日本同仁化學(xué)研究所 產(chǎn)品），繼續(xù)孵育5小時，顯黃色，采用Thermofisher公司mult iscanFC酶聯(lián)儀，雙波長，參比 波長620mm、檢測波長450mm檢測0D值。取4次試驗結(jié)果的平均值，繪制殺傷率曲線。
[0034]殺傷率的計算公式為:殺傷率（％ ) = [ 1 -(效靶細(xì)胞組0D值-效應(yīng)細(xì)胞組0D值)/ (靶 細(xì)胞組0D值-空白對照組0D值）]X 100 %。其中，
[0035] 效靶細(xì)胞組0D值為：CIK細(xì)胞和K562靶細(xì)胞組檢測的波長450nm0D值一波長 620nm0D 值。
[0036] 效應(yīng)細(xì)胞組0D值為:單純CIK細(xì)胞檢測的波長450nm0D值一波長620nm0D值。
[0037] 靶細(xì)胞組0D值為:K562靶細(xì)胞組檢測的波長450nm0D值一波長620nm0D值。
[0038]空白對照組0D值為：完全培養(yǎng)基和10 % FBS的IMDΜ培養(yǎng)液混合后，檢測的波長 450nm0D 值一波長620nm0D 值。
[0039] 由殺傷率曲線可知，單個核細(xì)胞經(jīng)過1-19天的誘導(dǎo)，第7天，CIK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞 K562活性最高，平均達(dá)97.3%，此后逐步下降，第19天最低，平均84%。
[0040] 3、流式細(xì)胞儀進(jìn)行誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞檢測
[0041] 采用流式細(xì)胞儀(BD公司FACS Calibur)，對誘導(dǎo)前的外周血單個核細(xì)胞和誘導(dǎo)后 的第19天進(jìn)行⑶3、⑶4、⑶8、⑶3CD56檢測。結(jié)果:誘導(dǎo)CIK細(xì)胞前，外周血單個核細(xì)胞的⑶3+ 為52 · 84%，CD4+為36 · 58%，CD8+為24 · 98 %，CD3+CD56+為 1 · 35 % ;誘導(dǎo)CIK細(xì)胞的第 19天， CD3+為98 · 91 %，CD4+為 1 · 56 %，CD8+為91 · 37 %，CD3+CD56+為63 · 72 %。
[0042] 4、CIK細(xì)胞表型測定
[0043] 用pH7.4的1 X roS調(diào)整細(xì)胞密度至1 X 106/mL，加入到流式細(xì)胞檢測管中，200yL/ 管，分別加入不同熒光標(biāo)記的抗人CD3-FITC、CD4-FITC、CD8-PE、CD56-PE抗體(BD公司），置 暗處，4°C標(biāo)記20分鐘，ρΗ7.4的1 X PBS洗滌2次，1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，1 %甲醛固定后， 用流式細(xì)胞儀檢測。取5次試驗結(jié)果的平均值，結(jié)果見表1。從表1可以看出，隨著誘導(dǎo)時間的 延長，CIK主要效應(yīng)細(xì)胞CD3 + CD56 +雙陽性細(xì)胞所占比例大幅上升，第19天達(dá)到均數(shù)為 58.8%，范圍為52·3%-65·3%。
[0044] 表1單個核細(xì)胞誘導(dǎo)CIK細(xì)胞表型的變化(X土S，％ )
[0046]實施例2: CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)制備
[0047] (1)取患者外周血30mL加入等體積RPMI 1640培養(yǎng)液（Invitrogen公司），充分混 勻。
[0048] (2)將步驟（1)獲得的倍比稀釋的外周血60mL，加入到30mL淋巴細(xì)胞分離液(上海 華精生物高科技有限公司）（比重1.077)的界面上(不要破壞界面），以1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心20 分鐘，取中間層一富含淋巴細(xì)胞的白膜層，加入完全培養(yǎng)基20mL。取少量細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計數(shù) 及苔盼蘭活細(xì)胞計數(shù)染色，結(jié)果顯示，活細(xì)胞達(dá)99 %。
[0049] (3)將步驟(2)獲得的含有完全培養(yǎng)基的白膜層，以1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心7分鐘，棄上 清液，沉淀為單個核細(xì)胞。
[0050] (4)加入完全培養(yǎng)基，細(xì)胞計數(shù)，用完全培養(yǎng)基調(diào)整單個核細(xì)胞濃度為1 X 106/mL。 [00511 (5)按照1 X 106/mL細(xì)胞，加入γ -IFN(Pepr0teCh公司）和化合物（I)使其濃度分別 為500IU/mL和80ng/mL，置37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱中，開始誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0052] (6)步驟(5)的細(xì)胞培養(yǎng)20小時后，在培養(yǎng)的細(xì)胞中，加入50ng/mL抗人CD3單克隆 抗體(Biolegend公司）和500IU/mL重組人IL-2(Peprotech公司），置37°C、5 %C02培養(yǎng)箱中， 繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，從而獲得CIK細(xì)胞。CIK細(xì)胞鑒定方法:細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增，⑶3+⑶56+雙陽性標(biāo)志 細(xì)胞數(shù)量升高，殺傷腫瘤細(xì)胞能力增強(qiáng)(非MHC限制性）。
[0053]其中，單個核細(xì)胞中加入γ -IFN和化合物（I)，經(jīng)培養(yǎng)24小時后(誘導(dǎo)第1天），光鏡 觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞活化透亮，折光性強(qiáng)。在單個核細(xì)胞中加入抗人CD3單克隆抗體和重組人IL-2,經(jīng)培養(yǎng)24小時后(誘導(dǎo)第2天），光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞聚集，并且有很多小集落開始形成，細(xì) 胞明顯增大。
[0054] (7)誘導(dǎo)培養(yǎng)的第四天，細(xì)胞傳代。按照1份CIK細(xì)胞原液，加入3份含500 IU/mL重組 人IL-2的完全培養(yǎng)基。同時，取樣檢測CIK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)，流式細(xì)胞儀檢測⑶3、⑶56、CD4、 CD8陽性細(xì)胞數(shù)，檢測CIK細(xì)胞殺傷K562腫瘤細(xì)胞活性。
[0055] (8)此后，每3天按照上述方法，傳代一次，并做相同的檢測。誘導(dǎo)培養(yǎng)的第19天終 止培養(yǎng)。以上方法均在嚴(yán)格無菌環(huán)境內(nèi)進(jìn)行。
[0056] 本實施例獲得CIK細(xì)胞具有和實施例1近似的生物學(xué)性質(zhì)和生物活性。
[0057]實施例3: CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)制備和檢測
[0058] (1)取患者外周血30mL加入等體積RPMI 1640培養(yǎng)液（Invitrogen公司），充分混 勻。
[0059] (2)將步驟（1)獲得的倍比稀釋的外周血60mL，加入到30mL淋巴細(xì)胞分離液(上海 華精生物高科技有限公司）（比重1.077)的界面上(不要破壞界面），以2500轉(zhuǎn)/分鐘，離心15 分鐘，取中間層一富含淋巴細(xì)胞的白膜層，加入完全培養(yǎng)基20mL。取少量細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計數(shù) 及苔盼蘭活細(xì)胞計數(shù)染色，結(jié)果顯示，活細(xì)胞達(dá)99 %。
[0060] (3)將步驟(2)獲得的含有完全培養(yǎng)基的白膜層，以1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心7分鐘，棄上 清液，沉淀為單個核細(xì)胞。
[0061 ] (4)加入完全培養(yǎng)基，細(xì)胞計數(shù)，用完全培養(yǎng)基調(diào)整單個核細(xì)胞濃度為1 X 106/mL。 [0062] (5)按照1 X 106/mL細(xì)胞，加入γ -IFN(Pepr〇teCh公司）和化合物（I)使其濃度分別 為2000IU/mL和120ng/mL，置37°C、5 % C02培養(yǎng)箱中，開始誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0063] (6)步驟(5)的細(xì)胞培養(yǎng)28小時后，在培養(yǎng)的細(xì)胞中，加入1000ng/mL抗人CD3單克 隆抗體(Biolegend 公司）和 2000IU/mL 重組人 IL-2(Peprotech 公司），置 37°C、5%C02 培養(yǎng)箱 中，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，從而獲得CIK細(xì)胞。CIK細(xì)胞鑒定方法:細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增，⑶3+CD56+雙陽性標(biāo) 志細(xì)胞數(shù)量升高，殺傷腫瘤細(xì)胞能力增強(qiáng)(非MHC限制性）。
[0064]其中，單個核細(xì)胞中加入γ -IFN和化合物（I)，經(jīng)培養(yǎng)24小時后(誘導(dǎo)第1天），光鏡 觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞活化透亮，折光性強(qiáng)。在單個核細(xì)胞中加入抗人CD3單克隆抗體和重組人IL-2,經(jīng)培養(yǎng)24小時后(誘導(dǎo)第2天），光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞聚集，并且有很多小集落開始形成，細(xì) 胞明顯增大。
[0065] (7)誘導(dǎo)培養(yǎng)的第四天，細(xì)胞傳代。按照1份CIK細(xì)胞原液，加入3份含2000IU/mL重 組人IL-2和300IU/mL重組人IL-1的完全培養(yǎng)基。同時，取樣檢測CIK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)，流式細(xì) 胞儀檢測⑶3、⑶56、⑶4、⑶8陽性細(xì)胞數(shù)，檢測CIK細(xì)胞殺傷K562腫瘤細(xì)胞活性。
[0066] (8)此后，每3天按照上述方法，傳代一次，并做相同的檢測。誘導(dǎo)培養(yǎng)的第19天終 止培養(yǎng)。以上方法均在嚴(yán)格無菌環(huán)境內(nèi)進(jìn)行。
[0067] 本實施例獲得CIK細(xì)胞具有和實施例1近似的生物學(xué)性質(zhì)和生物活性。
[0068] 實施例4:實施例1的對比實例，不添加化合物(I)
[0069] (1)取患者外周血30mL加入等體積RPMI 1640培養(yǎng)液（Invitrogen公司），充分混 勻。
[0070] (2)將步驟（1)獲得的倍比稀釋的外周血60mL，加入到30mL淋巴細(xì)胞分離液(上海 華精生物高科技有限公司）（比重1.077)的界面上(不要破壞界面），以2000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20 分鐘，取中間層一富含淋巴細(xì)胞的白膜層，加入完全培養(yǎng)基20mL。取少量細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計數(shù) 及苔盼蘭活細(xì)胞計數(shù)染色，結(jié)果顯示，活細(xì)胞達(dá)99 %。
[0071 ] (3)將步驟(2)獲得的含有完全培養(yǎng)基的白膜層，以1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，棄 上清液，沉淀為單個核細(xì)胞。
[0072] (4)加入完全培養(yǎng)基，細(xì)胞計數(shù)，用完全培養(yǎng)基調(diào)整單個核細(xì)胞濃度為1 X 106/mL。
[0073] (5)按照lX106/mL細(xì)胞，加入 y-IFN(Peprotech公司）使其濃度為 1000IU/mL，置 37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱中，開始誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0074] (6)步驟(5)的細(xì)胞培養(yǎng)24小時后，在培養(yǎng)的細(xì)胞中，加入500ng/mL抗人CD3單克隆 抗體(Biolegend公司）和1000IU/mL重組人IL-2(Peprotech公司），置37°C、5%⑶2培養(yǎng)箱 中，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，從而獲得CIK細(xì)胞。其中，單個核細(xì)胞中加入γ -IFN，經(jīng)培養(yǎng)24小時后(誘 導(dǎo)第1天），光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞折光性一般。在單個核細(xì)胞中加入抗人CD3單克隆抗體和重 組人IL-2,經(jīng)培養(yǎng)24小時后(誘導(dǎo)第2天），光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞有一定程度的聚集，零零散散 有小集落開始形成，細(xì)胞略有增大。
[0075] (7)誘導(dǎo)培養(yǎng)的第四天，細(xì)胞傳代。按照1份CIK細(xì)胞原液，加入3份含1000IU/mL重 組人IL-2的完全培養(yǎng)基。同時，取樣檢測CIK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)，流式細(xì)胞儀檢測⑶3、⑶56、⑶4、 CD8陽性細(xì)胞數(shù)，檢測CIK細(xì)胞殺傷K562腫瘤細(xì)胞活性。
[0076] (8)此后，每3天按照上述方法，傳代一次，并做相同的檢測。誘導(dǎo)培養(yǎng)的第19天終 止培養(yǎng)。以上方法均在嚴(yán)格無菌環(huán)境內(nèi)進(jìn)行。
[0077] 該實施例制備的CIK細(xì)胞的相應(yīng)檢測結(jié)果表明：
[0078] (l)CIK細(xì)胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第4天開始增值，第7天到第16天進(jìn)入快速增長期，16天 后增殖速度趨緩，第19天CIK細(xì)胞最高增殖313倍，最低35倍，平均增殖174倍，顯著低于實施 例1制備方法制備的CIK細(xì)胞。
[0079] (2)單個核細(xì)胞經(jīng)過1-19天的誘導(dǎo)，第7天，CIK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞K562活性最高，平 均達(dá)54.1 % (范圍54.1 ±3.3%)，此后逐步下降，第19天最低，平均36% (范圍36±7.5%)， 對靶細(xì)胞K562的殺傷率明顯不及實施例1。
[0080] (3)采用流式細(xì)胞儀(BD公司FACS Calibur)，對誘導(dǎo)前的外周血單個核細(xì)胞和誘 導(dǎo)后的第19天進(jìn)行003、004、008、0030056檢測。結(jié)果:誘導(dǎo)(：11(細(xì)胞前，外周血單個核細(xì)胞的 CD3+為52.84%，CD4+為36.58%，CD8+為24.98%，CD3+CD56+為 1.35% ;誘導(dǎo)CIK細(xì)胞的第 19 天，CD3+為68 · 81 %，CD4+為2 · 03%，CD8+為44 · 77%，CD3+CD56+為22 · 54%，顯著不及實施例 1。 [0081 ] (4)用pH7 · 4的1 X roS調(diào)整細(xì)胞密度至1 X 106/mL，加入到流式細(xì)胞檢測管中，200μ L/管，分別加入不同熒光標(biāo)記的抗人CD3-FITC、CD4-FITC、CD8-PE、CD56-PE抗體(BD公司）， 置暗處，4°C標(biāo)記20分鐘，ρΗ7.4的1 X roS洗滌2次，1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，1 %甲醛固定 后，用流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果表明隨著誘導(dǎo)時間的延長，CIK主要效應(yīng)細(xì)胞CD3+CD56+雙陽性 細(xì)胞所占比例上升不明顯。
[0082]對比實施例4和實施例1可發(fā)現(xiàn)，化合物（I)可協(xié)同γ干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生高純度、高增 殖力、高細(xì)胞毒活性的CIK細(xì)胞。
[0083]上述實例中，收集外周血的單個核細(xì)胞部分的方法也可以為:采用COBE Spectra 型血細(xì)胞分離機(jī)(Gambro BC公司）上的淋巴細(xì)胞采集程序，單采正常人外周血單個核細(xì)胞 30mL〇
[0084]實施例5:化合物(I)的分離制備和結(jié)構(gòu)確證
[0085]分離方法：（a)將虎杖（2kg)粉碎，用90%乙醇熱回流提?。?5LX 3次），合并提取 液，濃縮至無醇味（3L)，依次用石油醚（3L X 3次）、乙酸乙酯（3L X 3次）和水飽和的正丁醇 (3LX3次）萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中 乙酸乙酯萃取物用D101型大孔樹脂除雜，先用35%乙醇洗脫8個柱體積，再用90%乙醇洗脫 12個柱體積，收集90%洗脫液，減壓濃縮得90%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中90%乙醇洗 脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為120:1 (11個柱體積）、60:1 (9個柱體積）、30:1 (9 個柱體積)和15:1 (8個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得至1」4個組分；（d)步驟(c)中組分 3用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為40:1(6個柱體積）、30:1(8個柱體積)和10:1(6個 柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合 的反相硅膠分離，用體積百分濃度為85 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集14~18個柱體積洗 脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物（I) (HPLC歸一化純度大于98% )。
[0086] 結(jié)構(gòu)確證:冊431-]\^顯示[]\?1]+為111/2 263.1202，結(jié)合核磁特征可得分子式為 C15H18〇4，不飽和度為7。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δΗ(ΡΡπι，CDC13，500MHz):H-2(4 · 42，dq，J = 2 · 8， 1.5Hz)，H-3(5.73，dq，J = 2.8，1.9Hz)，H-5(2.03，dd，J=13.2,2.2Hz)，H-6a(2.19，dddq，J = 14.2，13.2，1.9，1.5Hz)，H-6b(3.04，dd，J = 14.2,2.2Hz)，H-8(4.56，dddq，J=13.0,2.9， 1 ·9，1 ·5Ηζ)，H-9a(2.32，dd，J=13.3，13.0Hz)，H-9b(2.15，dd，J=13.3,2.9Hz)，H-13 (1 · 69，s)，H_14( 1 · 74, s)，H_15a(5 · 56，s)，H_15b(4 · 86，s);核磁共振碳譜數(shù)據(jù)5c(ppm， CDC13，125MHz):71.1(C3-C)，77.9(CH，2-C)127.4(CH，3-C)，148.8(C，4-C)，50.6(CH，5-C)，31.9(CH2,6-C)，161.2(C，7-C)，78.5(CH，8-C)，43.4(CH2,9-C)，144.5(C，10-C)，121.7 (C，n-C)，175.6(C，12-C)，8.5(CH 3，13-C)，15.6(CH3，14-C)，110.8(012,15-00?和 13C-NMR 譜顯示一個α，β-不飽和 γ-內(nèi)酯結(jié)構(gòu)[SH4.56(lH，dddq，J=13.0,2.9，1.9，1.5Hz，H-8);S 。161.2(07)，78.5(08)，121.7(011)，175.6((：-12)]，兩個乙烯基甲基[3[11.69(3!1，8，!1-13)和1.74(3!1，8，!1-14)]，一個末端雙鍵[5[ 15.56(1!1，8，!1-153)和4.86(1!1，8，!1-1513)]，一個 烯屬次甲基質(zhì)子信號[知5.73(1!1，(^，1 = 2.8，1.9他，!1-3)]以及一個連氧次甲基質(zhì)子信號 [δΗ4.42(1H，dq，J = 2.8，1.5Hz，H-2)]。綜合氫譜和碳譜的信息，可以推測該化合物可能是 一個倍半萜類化合物。查閱文獻(xiàn)可得，該化合物和已知的愈創(chuàng)木烷型化合物l，2-ep 〇Xy-10-hydroxy-podoandin具有相似的核磁數(shù)據(jù)。通過核磁數(shù)據(jù)比較，發(fā)現(xiàn)該新化合物主要變化是 在C-1/C-2位上的碳譜信息。結(jié)合高分辨數(shù)據(jù)，可以推斷出該化合物是在已知化合物1，2-epoxy-l〇-hydroxy-podoandin 上 C-1/C-2 三元氧環(huán)開環(huán)的產(chǎn)物。HMBC 譜中 H-2/C-1，H_2/C_ 3，H-3/C-l以及H-2/C-4之間的相關(guān)性證實了 C-1和C-2的二元醇結(jié)構(gòu)。同時和1，2-epoxy-l〇-hydroxy-podoandin比較，新化合物還多出一組末端雙鍵信號，H_15/C-1，H_15/C-9，H-9/C-10以及H-9/C-15的HMBC相關(guān)性證實新化合物中C-10/C-15之間存在一個末端雙鍵。至 此，將該化合物的平面結(jié)構(gòu)解析出來。該化合物的相對構(gòu)型是通過NOESY譜來解析的，Η-6β/ H-8以及Η-2/Η-6β之間的相關(guān)性說明該化合物C-2位上的羥基是位于α位的。綜合氫譜、碳 譜、HMBC譜和NOESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如下所示，立 體構(gòu)型進(jìn)一步通過E⑶試驗確定，理論值與實驗值基本一致。
[0087]該化合物化學(xué)式及碳原子編號如下：
[0089]上述實施例的作用在于說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種用于腫瘤細(xì)胞免疫治療的高細(xì)胞毒活性CIK細(xì)胞，其特征在于，通過如下步驟制 備：（1)取患者外周血，收集外周血的單個核細(xì)胞部分；（2)將步驟（1)收集的外周血的單個 核細(xì)胞部分離心，棄去上清液，獲得單個核細(xì)胞；（3)取單個核細(xì)胞按照1 X 106/mL細(xì)胞，加 入含500~2000IU/mLy干擾素和80~120ng/mL如下結(jié)構(gòu)所示化合物（I)的完全培養(yǎng)基，開 始誘導(dǎo)培養(yǎng);其中，完全培養(yǎng)基，包括含體積百分比為10%FBS的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液；（4) 步驟（3)的細(xì)胞培養(yǎng)20~28小時后，加入50~1000ng/mL抗人CD3單克隆抗體和500~ 2000IU/mL重組人IL-2,繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，其中，每隔2~3天傳代培養(yǎng)一次，整個誘導(dǎo)培養(yǎng)的時 間為13~21天，獲得高細(xì)胞毒活性CIK細(xì)胞;化合物(I)結(jié)構(gòu)為：2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高細(xì)胞毒活性CIK細(xì)胞，其特征在于，步驟(1)所述收集外周血 的單個核細(xì)胞部分的方法為：（a)患者外周血中，加入1~1.5倍體積的不含血清的細(xì)胞培養(yǎng) 液或pH7.2PBS緩沖液稀釋，充分混勻；其中，細(xì)胞培養(yǎng)液包括:RPMI1640培養(yǎng)液和頂DM培養(yǎng) 液；（b)將步驟(a)獲得的血液稀釋液加入到淋巴細(xì)胞分離液的界面上；（c)1500~2500轉(zhuǎn)/ 分鐘，離心15~20分鐘，收集中間層，獲得單個核細(xì)胞。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于腫瘤細(xì)胞免疫治療的高細(xì)胞毒活性CIK細(xì)胞，其特征在 于，步驟(1)中所述收集外周血的單個核細(xì)胞部分的方法為：患者經(jīng)采用血細(xì)胞分離機(jī)上的 淋巴細(xì)胞采集程序，單采集患者的外周血單個核細(xì)胞。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于腫瘤細(xì)胞免疫治療的高細(xì)胞毒活性CIK細(xì)胞，其特征在 于:步驟⑵中，離心的轉(zhuǎn)速為1000~1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心的時間為7~10分鐘。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于腫瘤細(xì)胞免疫治療的高細(xì)胞毒活性CIK細(xì)胞，其特征在 于:步驟(4)所述繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，每2~3天用含500~2000IU/mL重組人IL-2的完全培養(yǎng)基或 含500~2000IU/mL重組人IL-2和100~500IU/mL重組人IL-1的完全培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。6. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)在制備高細(xì)胞毒活性的CIK細(xì)胞中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求1-5任一所述的用于腫瘤細(xì)胞免疫治療的高細(xì)胞毒活性CIK細(xì)胞在制備抗 腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N5/0783GK105950553SQ201610345739
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月21日
【發(fā)明人】楊曉旭
【申請人】楊曉旭