本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種β-葡萄糖醛酸苷酶及其基因和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase)是一類能催化β-葡萄糖醛酸酸苷水解的糖苷酶，廣泛存在于人體、動(dòng)物、植物和微生物中。β-葡萄糖醛酸苷酶最早被發(fā)現(xiàn)存在于人體和動(dòng)物的各種組織和體液中，尤其在肝、脾和腎上腺中的含量較高，早期人們發(fā)現(xiàn)該酶與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，目前通過(guò)檢測(cè)該酶在特定部位的水平已成為腫瘤診斷治療的一種重要手段。細(xì)菌來(lái)源的β-葡萄糖醛酸苷酶自發(fā)現(xiàn)以來(lái)已得到很好的應(yīng)用。例如大腸桿菌來(lái)源的β-葡萄糖醛酸苷酶可水解底物形成熒光或有色物質(zhì)，因此可利用這一特性檢測(cè)飲用水或各種食品中大腸桿菌的污染。此外基于這一特性，β-葡萄糖醛酸苷酶常被作為報(bào)告基因，用于轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)記和目的基因表達(dá)定位，成為相關(guān)科學(xué)研究工作的工具酶。隨著人們對(duì)天然化合物的認(rèn)識(shí)和研究，國(guó)內(nèi)外已利用β-葡萄糖醛酸苷酶進(jìn)行含糖苷類天然藥物的改性研究。

甘草酸(glycyrrhizin，gl)是甘草(glycyrrhizauralensis)的主要有效成分之一，是一種三萜皂苷類化合物，可作為天然的甜味劑，具有消炎、抗癌，抗腫瘤、保肝護(hù)肝及增強(qiáng)細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的功效，此外還具有良好的美白作用，結(jié)合其消炎的功能，能起到潤(rùn)膚和清除自由基等多種功效，因此也被廣泛應(yīng)用于化妝品領(lǐng)域。但是由于甘草酸極性較強(qiáng)，不易透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮藥理作用，不僅限制其功能的發(fā)揮，也造成藥物的浪費(fèi)。單葡萄糖醛酸基甘草次酸(glycyrrhetinicacidmonoglucuronide，gamg)是甘草酸最外側(cè)糖苷鍵裂解后，水解去除一分子葡萄糖醛酸后生成的產(chǎn)物，在保留甘草酸功效的同時(shí)因其具有極性適中，易于透過(guò)細(xì)胞膜，生物利用度高，且具有更高的甜度，更好的生物安全性等優(yōu)點(diǎn)被認(rèn)為是甘草酸良好的替代品。利用化學(xué)法生產(chǎn)gamg時(shí)，存在低選擇性、高耗能、高污染等缺點(diǎn)。相比于化學(xué)法生物法改性具有反應(yīng)效率高、反應(yīng)條件溫和及底物特異性高等特點(diǎn)，而受到廣泛的關(guān)注。

動(dòng)物來(lái)源的β-葡萄糖醛酸苷酶的底物特異性差，甘草酸被其水解成gamg時(shí)，會(huì)進(jìn)一步作為底物被水解掉一個(gè)葡萄糖醛酸基(glca)，形成甘草酸次酸(glycyrrhetinicacid，ga)，如圖1所示，因此產(chǎn)物為ga和gamg的混合物，且酶的制備過(guò)程復(fù)雜，成本高。而大部分微生物產(chǎn)生的β-葡萄糖醛酸苷酶也同樣存在底物專一性差的問(wèn)題，且野生菌產(chǎn)生的β-葡萄糖醛酸苷酶酶活較低。利用基因工程重組蛋白表達(dá)技術(shù)可以解決野生菌酶表達(dá)酶活低的問(wèn)題，但是β-葡萄糖醛酸苷酶基因在模式菌株進(jìn)行重組表達(dá)后，失去了底物特異性，仍然難獲得單一的gamg產(chǎn)物(鄒樹(shù)平，天津大學(xué)博士論文，2010年)。因此尋找新的β-葡萄糖醛酸苷酶基因，構(gòu)建基因工程菌對(duì)其重組表達(dá)，獲取表達(dá)量高、酶活高、底物特異性強(qiáng)的重組酶可以實(shí)現(xiàn)以單一gamg為產(chǎn)物的規(guī)?；a(chǎn)，且方便后續(xù)gamg的提取和純化，降低了生產(chǎn)成本。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足，提供一種β-葡萄糖醛酸苷酶基因，工程菌及其應(yīng)用。該基因能夠在畢赤酵母中高效表達(dá)β-葡萄糖醛酸苷酶，且表達(dá)量及酶活均較高。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種β-葡萄糖醛酸苷酶，其特征在于，其氨基酸序列由seqidno.1所示的核苷酸序列所編碼。

編碼所述β-葡萄糖醛酸苷酶的基因片段。

所述的基因片段，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

包含所述基因片段的表達(dá)載體。可采用任何現(xiàn)有已知的空白表達(dá)載體，按照常規(guī)的連接步驟或商品表達(dá)載體的使用說(shuō)明進(jìn)行操作，將所述基因片段與空白表達(dá)載體即可獲得本發(fā)明所述的表達(dá)載體。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，優(yōu)選pgapzα空白質(zhì)粒載體，因?yàn)樵撡|(zhì)粒是強(qiáng)組成型表達(dá)質(zhì)粒，不需要定時(shí)添加誘導(dǎo)劑的繁瑣過(guò)程，且該質(zhì)粒上含有信號(hào)肽，可將表達(dá)的蛋白分泌到胞外，方便酶的收集；該實(shí)施例中構(gòu)建的所述表達(dá)載體是pgapzα-tpgus。

一種轉(zhuǎn)化體，其特征在于，包含所述的表達(dá)載體。可采用任何現(xiàn)有已知的表達(dá)宿主菌，按照常規(guī)的轉(zhuǎn)化步驟或商品宿主菌的使用說(shuō)明進(jìn)行操作，將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主菌中。本發(fā)明的一些實(shí)施例優(yōu)選采用畢赤酵母作為表達(dá)宿主，因?yàn)楫叧嘟湍甘鞘称钒踩?jí)菌株，具有非常強(qiáng)的蛋白質(zhì)分泌能力，并能進(jìn)行高密度發(fā)酵。這些實(shí)施例中的所述轉(zhuǎn)化體是包含上述表達(dá)載體pgapzα-tpgus的畢赤酵母工程菌。

具有β-葡萄糖醛酸苷酶功能的重組蛋白，其功能區(qū)的氨基酸序列為seqidno.1所示的核苷酸序列所編碼。

用于制備單葡萄糖醛酸基甘草次酸的制品，其特征在于，其活性成分包括所述的β-葡萄糖醛酸苷酶，和/或

所述的基因片段，和/或

所述的表達(dá)載體，和/或

所述的轉(zhuǎn)化體，和/或

所述的重組蛋白。

所述制品還包括用于制備單葡萄糖醛酸基甘草次酸的常規(guī)成分，和/或

連接轉(zhuǎn)化所述的基因片段的常規(guī)試劑，和/或

構(gòu)建所述的表達(dá)載體的常規(guī)試劑，和/或

擴(kuò)繁所述的轉(zhuǎn)化體的常規(guī)培養(yǎng)成分，和/或

轉(zhuǎn)化表達(dá)所述的重組蛋白的常規(guī)試劑。

一種用于制備單葡萄糖醛酸基甘草次酸的制品的制備方法，其特征在于，采用所述的β-葡萄糖醛酸苷酶，和/或，

所述的基因片段，和/或

所述的表達(dá)載體，和/或

所述的轉(zhuǎn)化體，和/或

所述的重組蛋白

作為制備所述制品的活性成分之一；和/或

在標(biāo)有制備單葡萄糖醛酸基甘草次酸用途的包裝盒內(nèi)放置有所述的β-葡萄糖醛酸苷酶，和/或

所述的基因片段，和/或

所述的表達(dá)載體，和/或

所述的轉(zhuǎn)化體，和/或

所述的重組蛋白。

一種制備單葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法，其特征在于，在制備單葡萄糖醛酸基甘草次酸的過(guò)程中添加和/或使用所述的β-葡萄糖醛酸苷酶，和/或

所述的基因片段，和/或

所述的表達(dá)載體，和/或

所述的轉(zhuǎn)化體，和/或

所述的重組蛋白。

所述的β-葡萄糖醛酸苷酶，其特征在于，來(lái)自保藏號(hào)為cgmccno.11765的嗜松籃狀菌(talaromycespinophilum)菌株li-93。

本發(fā)明提供的β-葡萄糖醛酸苷酶來(lái)源于一株嗜松籃狀菌(talaromycespinophilum)li-93(保藏號(hào)為cgmccno:11765)，該基因能夠在畢赤酵母中高效表達(dá)嗜松籃狀菌β-葡萄糖醛酸苷酶，且表達(dá)量及酶活均較高。將上述工程菌表達(dá)的嗜松籃狀菌β-葡萄糖醛酸苷酶用于單葡萄糖甘草次酸的生產(chǎn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)底物特異性好，無(wú)副產(chǎn)物甘草次酸的生成，gamg的產(chǎn)率為95％左右，高于本領(lǐng)域的現(xiàn)有水平。

所述嗜松籃狀菌(talaromycespinophilum)菌株li-93已送保藏，其保藏信息如下：

菌種保藏名稱：li-93

保藏號(hào)：cgmccno.11765

分類命名：嗜松籃狀菌

拉丁名：talaromycespinophilum

保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心

保藏單位地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)

保藏日期：2015年11月30日

附圖說(shuō)明

圖1是β-葡萄糖醛酸苷酶水解甘草酸反應(yīng)示意圖；

圖2是嗜松籃狀菌β-葡萄糖醛酸苷酶基因擴(kuò)增電泳圖；1：目標(biāo)片段，m:dna分子量標(biāo)準(zhǔn)；

圖3是嗜松籃狀菌β-葡萄糖醛酸苷酶基因插入畢赤酵母基因組中驗(yàn)證電泳圖；1：以陽(yáng)性克隆

基因組為模板擴(kuò)增tpgus基因，2：對(duì)照，以gs115菌株基因組為模板擴(kuò)增tpgus基因，m：dna分子量標(biāo)準(zhǔn)；

圖4是嗜松籃狀菌β-葡萄糖醛酸苷酶基因(tpgus)表達(dá)載體pgapzα-tpgus圖譜；

圖5是畢赤酵母工程菌表達(dá)重組嗜松籃狀菌β-葡萄糖醛酸苷酶轉(zhuǎn)化甘草酸單銨鹽生成單葡萄

糖醛酸基甘草次酸(gamg)的高效液相色譜分析圖，1：甘草酸(gl)的標(biāo)準(zhǔn)品，2：甘草次酸(ga)的標(biāo)準(zhǔn)品，3：gamg的標(biāo)準(zhǔn)品，4：轉(zhuǎn)化前，5轉(zhuǎn)化后。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

以下實(shí)施例中使用的pcr引物序列：

實(shí)施例6中的甘草酸單銨鹽純度為75％，購(gòu)自新疆天山制藥廠。

本發(fā)明中β-葡萄糖醛酸苷酶酶活定義：每分鐘生成1nmolgamg所需的酶量為一個(gè)活力單位(u)。

本發(fā)明中g(shù)amg的產(chǎn)率定義為：

實(shí)施例1：嗜松籃狀菌β-葡萄糖醛酸苷酶基因的擴(kuò)增

提取嗜松籃狀菌li-93的總rna，反轉(zhuǎn)錄成cdna后以此為模板，采用上游引物tpgus-f和下游tpgus-r擴(kuò)增嗜松籃狀菌β-葡萄糖醛酸苷酶基因tpgus，得到長(zhǎng)度1554bp的tpgus基因片段，如圖2所示。將上述所得基因片段與克隆載體pmd19-t連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α菌株，提取質(zhì)粒pmd19-t-tpgus，對(duì)質(zhì)粒上tpgus基因進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，其序列如seqidno.1所示，結(jié)果表明正確無(wú)誤。

實(shí)施例2：嗜松籃狀菌β-葡萄糖醛酸苷酶基因表達(dá)載體構(gòu)建

以實(shí)施例1中的pmd19-t-tpgus為模板，采用上游引物tpgus-f-kpni和下游引物tpgus-r-noti擴(kuò)增嗜松籃狀菌β-葡萄糖醛酸苷酶基因tpgus，瓊脂糖電泳驗(yàn)證擴(kuò)增結(jié)果，并切膠回收目的片段。采用dna膠回收試劑盒回收目的片段后，采用內(nèi)切酶kpni和noti進(jìn)行雙酶切后，與同樣采用內(nèi)切酶kpni和noti進(jìn)行雙酶切后的pgapzα質(zhì)粒連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α菌株，涂布于含有抗生素zeocin的lb篩選平板上。采用引物tpgus-f-kpni和3’aox進(jìn)行菌落pcr驗(yàn)證。將陽(yáng)性克隆接于含有抗生素zeocin的lb液體培養(yǎng)基內(nèi)，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒，對(duì)tpgus基因進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明正確無(wú)誤。因此上述提取獲得的質(zhì)粒即為嗜松籃狀菌β-葡萄糖醛酸苷酶的表達(dá)載體，見(jiàn)圖4。

實(shí)施例3：嗜松籃狀菌β-葡萄糖醛酸苷酶基因表達(dá)工程菌的構(gòu)建

采用內(nèi)切酶avrii處理實(shí)施例2中構(gòu)建的表達(dá)載體，使其線性化后采用電轉(zhuǎn)法將其轉(zhuǎn)入畢赤酵母菌株中。將電轉(zhuǎn)產(chǎn)物涂布于含有博來(lái)霉素的ypd篩選平板上，30℃培養(yǎng)2-5天。從篩選平板上隨機(jī)挑選6-10個(gè)陽(yáng)性克隆，分別提取其基因組。以提取的各克隆的基因組為模板，采用上游引物tpgus-f和下游引物3’aox擴(kuò)增目標(biāo)片段，以gs115菌株的基因組為模板的擴(kuò)增結(jié)果作為對(duì)照，驗(yàn)證轉(zhuǎn)化結(jié)果，如圖3所示，與對(duì)照相比，獲得了目的條帶，進(jìn)一步對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果顯示tpgus基因已成功插入畢赤酵母基因組中。采用高濃度的博來(lái)霉素ypd平板進(jìn)一步篩選包含多拷貝數(shù)tpgus基因的工程菌。

實(shí)施例4：利用畢赤酵母工程菌制備嗜松籃狀菌β-葡萄糖醛酸苷酶

挑取實(shí)施例2中具有多拷貝tpgus基因的畢赤酵母工程菌的單菌落接于ypd液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)24小時(shí)后，以體積比5％的接種量接于新的ypd液體培養(yǎng)基，30℃振蕩培養(yǎng)，每24小時(shí)添加葡萄糖至2g/l，培養(yǎng)過(guò)程中所述具有多拷貝tpgus基因的畢赤酵母工程菌分泌出的重組蛋白即嗜松籃狀菌β-葡萄糖醛酸苷酶；每12小時(shí)取樣檢測(cè)酶活。取酶活達(dá)到最大時(shí)的發(fā)酵液、離心、收集發(fā)酵液上清，即為重組β-葡萄糖醛酸苷酶的粗酶液，測(cè)得酶活為66.24u/ml。

實(shí)施例5、本發(fā)明所述的用于制備單葡萄糖醛酸基甘草次酸的制品及方法

本實(shí)施例提供一種用于制備單葡萄糖醛酸基甘草次酸的制品，其活性成分可以是seqidno.1所示核苷酸序列所編碼的所述β-葡萄糖醛酸苷酶，也可以是實(shí)施例1所述的基因片段經(jīng)連接轉(zhuǎn)化而得的產(chǎn)物，也可以是實(shí)施例2所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化表達(dá)而得的產(chǎn)物，或者是實(shí)施例3中所述的轉(zhuǎn)化體經(jīng)培養(yǎng)后獲得的產(chǎn)物，或者是功能區(qū)氨基酸由seqidno.1所示核苷酸序列編碼的重組蛋白。

所述制品的活性成分優(yōu)選為實(shí)施例4中具有多拷貝tpgus基因的畢赤酵母工程菌分泌的重組蛋白

所述制品還包括用于制備單葡萄糖醛酸基甘草次酸的常規(guī)成分，和/或

連接轉(zhuǎn)化所述的基因片段的常規(guī)試劑，和/或

構(gòu)建所述的表達(dá)載體的常規(guī)試劑，和/或

擴(kuò)繁所述的轉(zhuǎn)化體的常規(guī)培養(yǎng)成分，和/或

轉(zhuǎn)化表達(dá)所述的重組蛋白的常規(guī)試劑。

本實(shí)施例還提供一種用于制備單葡萄糖醛酸基甘草次酸的制品的制備方法，步驟包括，采用所述的β-葡萄糖醛酸苷酶，和/或，所述的基因片段，和/或所述的表達(dá)載體，和/或所述的轉(zhuǎn)化體，和/或所述的重組蛋白作為制備所述制品的活性成分之一；和/或

在標(biāo)有制備單葡萄糖醛酸基甘草次酸用途的包裝盒內(nèi)放置有所述的β-葡萄糖醛酸苷酶，和/或所述的基因片段，和/或所述的表達(dá)載體，和/或所述的轉(zhuǎn)化體，和/或所述的重組蛋白。

優(yōu)選地，所述制備方法的步驟包括，采用實(shí)施例4中具有多拷貝tpgus基因的畢赤酵母工程菌分泌的重組蛋白作為所述制品的活性成分之一，和/或

在標(biāo)有制備單葡萄糖醛酸基甘草次酸用途的包裝盒內(nèi)放置有實(shí)施例4中具有多拷貝tpgus基因的畢赤酵母工程菌分泌的重組蛋白。

實(shí)施例6：采用本發(fā)明所述制備單葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法制備gamg

本實(shí)施例提供一種制備單葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法，步驟包括，在制備單葡萄糖醛酸基甘草次酸的過(guò)程中添加和/或使用seqidno.1所示核苷酸序列所編碼的所述β-葡萄糖醛酸苷酶，也可以是實(shí)施例1所述的基因片段經(jīng)連接轉(zhuǎn)化而得的產(chǎn)物，也可以是實(shí)施例2所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化表達(dá)而得的產(chǎn)物，或者是實(shí)施例3中所述的轉(zhuǎn)化體經(jīng)培養(yǎng)后獲得的產(chǎn)物，或者是功能區(qū)氨基酸由seqidno.1所示核苷酸序列編碼的重組蛋白。

優(yōu)選地，本實(shí)施例具體采用實(shí)施例4中具有多拷貝tpgus基因的畢赤酵母工程菌分泌的重組蛋白進(jìn)行g(shù)amg的制備。取實(shí)施例4中粗酶液100ml，向其中加入甘草酸單銨鹽至2g/l，于45℃，150rpm反應(yīng)1-2小時(shí)，每15min取樣，采用高效液相檢測(cè)底物的消耗量和產(chǎn)物生成量。反應(yīng)1.5小時(shí)后，90％以上的gl轉(zhuǎn)化完畢，gamg的增加量不再明顯，如圖5所示，計(jì)算gamg的產(chǎn)率為95.21％。

sequencelisting

<110>北京理工大學(xué)

南京精微生物科技有限公司

<120>一種β-葡萄糖醛酸苷酶及其基因與應(yīng)用

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<223>嗜松籃狀菌（talaromycespinophilum）β-葡萄糖醛酸苷酶基因tpgus全長(zhǎng)序列

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<223>嗜松籃狀菌（talaromycespinophilum）β-葡萄糖醛酸苷酶基因tpgus擴(kuò)增引物tpgus-f

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<223>嗜松籃狀菌（talaromycespinophilum）β-葡萄糖醛酸苷酶基因tpgus擴(kuò)增引物tpgus-r

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<223>陽(yáng)性克隆驗(yàn)證下游引物3'aox

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<223>酶切位點(diǎn)上游引物tpgus-f-kpni

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<223>酶切位點(diǎn)下游引物tpgus-r-noti

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