專利名稱：木犀草素3’-葡萄糖醛酸苷在制備抗乙型肝炎病毒藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及木犀草素3’ -葡萄糖醛酸苷(luteolin 3’ -glucuronide)的新用途， 具體來說涉及木犀草素3’ -葡萄糖醛酸苷制備抗乙型肝炎病毒藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
病毒性乙型肝炎是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見病，它的防治是一個(gè)全球性公共 衛(wèi)生問題，已引起世界各國政府的關(guān)注。我國是病毒性肝炎的高發(fā)區(qū)，其中尤以乙型肝炎為 突出。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界無癥狀乙肝病毒攜帶者超過2. 8億，我國約占9300萬，其中1/3出現(xiàn) 肝損害的臨床表現(xiàn)。目前我國有乙肝患者3000萬，每年約有30萬人死于與乙肝有關(guān)的肝 硬化或肝癌。乙型肝炎不僅嚴(yán)重危害我國人民的健康，而且還給國家?guī)韲?yán)重的社會(huì)經(jīng)濟(jì) 負(fù)擔(dān)。乙型肝炎的治療時(shí)間長，醫(yī)療費(fèi)用較高，再加不恰當(dāng)?shù)臑E用藥物，更加重了額外的經(jīng) 濟(jì)負(fù)擔(dān)。雖然目前臨床上已在使用α-干擾素、拉米夫定、阿德福偉等數(shù)種藥物進(jìn)行乙型肝 炎的治療，但由于這些藥物都有比較嚴(yán)重的副作用，因而無法達(dá)到對(duì)乙肝患者進(jìn)行很好治 療的目的，所以仍然迫切需要新的抗乙肝病毒藥物的問世。海菖蒲在海南南海水域的海草床中屬優(yōu)勢(shì)種，屬于水鱉科海菖蒲屬。本發(fā)明人曾 報(bào)道從南海海草海菖蒲(Enhalus acoroides)中分離得到木犀草素3’-葡萄糖醛酸苷(見 文獻(xiàn) 1 :Qi SH, Zhang S, Qian P Y, et al. Botanica Marina, 2008, 51 :441_447·)。木犀草 素3’-葡萄糖醛酸苷(luteolin 3'-glucuronide)是一種黃酮苷，其結(jié)構(gòu)用下述式(1)表 示 木犀草素3’ -葡萄糖醛酸苷最初是從日本苔蘚類植物L(fēng)unularia cruciata (半 月笞)中分離至IJ 的(見文獻(xiàn) 2 =Markham K R, Porter L J. Phytochemistry, 1974， 13 :1553-1555.)，后來也曾有報(bào)道從日本苔蘚類植物Ricciocarpos natans (浮苔)， Marchantia polymorpha(地錢笞)中分離得至Ij (見文獻(xiàn) 3 =Markham K R, Porter I J. Phytochemistry, 1974，13 1937-1942.)，但不曾見其抗乙型肝炎病毒活性的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種木犀草素3’ _葡萄糖醛酸苷的新用途。
我們通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)木犀草素3’ -葡萄糖醛酸苷具有抗乙型肝炎病毒活性，從而實(shí) 現(xiàn)了本發(fā)明的目的。本發(fā)明的木犀草素3’ -葡萄糖醛酸苷可用于制備抗乙型肝炎病毒(HBV)的藥物。本發(fā)明的木犀草素3’ -葡萄糖醛酸苷的制備方法包括以下的步驟(1)將海菖蒲用甲醇、乙醇、甲醇_水或乙醇-水等有機(jī)溶劑提取，將提取液減壓濃 縮得到粗提取物；(2)將粗提取物懸溶于水，用氯仿或乙酸乙酯萃取，減壓濃縮得氯仿層或乙酸乙酯 層；(3)將氯仿層或乙酸乙酯層進(jìn)行常壓硅膠柱層析，用兩種有機(jī)溶劑的混合系統(tǒng)例 如氯仿_丙酮、氯仿_乙酸乙酯、石油醚_丙酮或石油醚_乙酸乙酯等溶劑系統(tǒng)為洗脫劑進(jìn) 行梯度洗脫，薄層層析TLC追蹤合并組分，將在TLC上能用體積比7 3的氯仿-甲醇溶劑 系統(tǒng)展開的組分用氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)梯度沖洗，得到粗產(chǎn)品； (4)將粗產(chǎn)品用重結(jié)晶、過高效液相色譜柱、過常壓柱等方法純化得到純品。純品 為黃色，在紫外燈254nm波長下有紫外熒光吸收，經(jīng)高效液相色譜柱(反相硅膠C18柱)分 析，用體積比25 75的乙腈-水沖洗時(shí)出峰時(shí)間約為8分鐘，在紫外波長約238，268，342nm 處有最大吸收。通過體外抗病毒試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的木犀草素3’ _葡萄糖醛酸苷對(duì)宿主 H印G2. 2. 15細(xì)胞無明顯的毒性，對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞的最大無毒濃度TCtl大于500 μ g/mL，對(duì) H印G2. 2. 15細(xì)胞表達(dá)HBeAg和HBsAg有顯著的抑制作用，且其抑制作用呈劑量依賴性，經(jīng)含 500 μ g/mL本發(fā)明的木犀草素3’ -葡萄糖醛酸苷的生長液培養(yǎng)9天后，細(xì)胞上清中HBeAg 與HBsAg含量分別為對(duì)照組的51%和70% (即抑制率分別為49%和30% )。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不限于下述實(shí)施例。實(shí)施例1 用自來水洗干凈后風(fēng)干得干重2. 5kg的海菖蒲，切碎后用乙醇有機(jī)溶劑(約15L) 室溫浸泡3次，每次5天，將提取液減壓濃縮得粗提取物，將粗提取物懸溶于水，用乙酸乙酯 萃取3次(每次400mL)，減壓濃縮得乙酸乙酯層(約24g)。用氯仿和甲醇(體積比1 1) 的混合溶劑將乙酸乙酯層溶解拌硅膠，涼干拌樣硅膠后，用約1200mL石油醚-丙酮(體積 比10 10)混合溶劑拌約400g硅膠進(jìn)行濕法裝柱，以石油醚-丙酮(2000mL體積比從 100 10到0 100變化)溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，薄層層析TLC(GF254)追蹤合并得7個(gè)組 分。將在TLC(GF254)上能用氯仿-甲醇體積比7 3溶劑系統(tǒng)展開的組分用氯仿-甲醇 (SOOmL體積比從7 3到6 4變化)溶劑系統(tǒng)梯度沖洗，得到粗品，將粗品用氯仿-甲醇 的混合溶劑重結(jié)晶，得黃色純品。該化合物在薄層層析板上用紫外燈254nm波長下有紫外 熒光吸收；經(jīng)高效液相色譜柱分析，用Waters 600控制器連有Waters 996光電二極管檢測(cè) 器，LunaTMC 18 (2)柱，250mmX4. 5讓i. d，室溫，體積比25 75的乙腈-水沖洗，流速ImL/ min，出峰時(shí)間約為8分鐘，在紫外波長約238，268，342nm處有最大吸收，其光譜數(shù)據(jù)如下C21H18O12 ；1H NMR(500MHz, DMS0) δΗ 7. 62 (1Η, dd, J = 1. 4and 8. 4Hz, Η_6，)， 7. 71 (1Η, d, J = 1. 4Ηζ，Η-2，)，6· 98 (1Η, d, J = 8. OHz, Η_5，)，6. 51 (1Η, s, Η_8)，6. 84 (1Η,S, Η-3)，6· 18 (1H, S, H_6)，5. 13 (1H, d, J = 7. OHz, Η_1”)，3· 96 (1Η, d, J = 9. 5Ηζ, Η_5”)， 3. 42(1Η, J = 9. 5and 9. 5Ηζ，Η_4”)，3. 36(lH，dd，J = 7. Oand 9. 5Ηζ，Η_2”)，3. 35(1Η, J = 9. 5and 9·5Ηζ，Η_3”)；13C 匪R(125MHz，DMSO) δ c 163. 3 (s，C_2)，102. 4 (d，C_3)，181. 5 (s， C-4)，161. 2 (s，C-5)，98. 7 (d, C_6)，164. 3 (s, C_7)，94. 0 (d, C_8)，157. 1 (s, C_9)，103. 4 (s, C-10)，122. l(s，C-l，)，115. l(d，C_2，)，145. 8(s，C_3，)，151. 0(s，C_4，)，116. 9(d，C_5，)， 122. l(d, C-6，)，102. 3 (d, C_l”)，73. 4 (d，C_2”)，75. 6 (d，C_3”)，71. 8 (d，C_4”)，74. 5 (d， C-5”)，172.4(s，C-6”).經(jīng)文獻(xiàn)查閱，核磁共振圖譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(見文獻(xiàn)4 =Armie Heitza, Andree Carnatb, Didier Fraisseb, et al. Fitoterapia，2000，71 :201_202·)基本一致，故 化合物結(jié)構(gòu)用式(1)表示。實(shí)施例2 式(1)化合物抗乙型肝炎病毒實(shí)驗(yàn)藥物對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞毒性測(cè)定將胰酶消化后的H印G2. 2.15細(xì)胞，以5 X IO3/ 孔密度接種到96孔培養(yǎng)板中，37°C ,5%C02培養(yǎng)48h后，棄液，用含F(xiàn)BS 5%的1640培養(yǎng)基 將藥物倍比稀釋成4個(gè)系列濃度(分別為62. 5 μ g/mL, 125 μ g/mL, 250 μ g/mL, 500 μ g/mL) 加入96孔板，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，100 μ L/孔，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照組。藥物作用第4 天時(shí)，換含相同藥物濃度的培養(yǎng)液一次，繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞的變化，第8天時(shí)，記錄藥 物作用于細(xì)胞的無毒濃度。結(jié)果式(1)的化合物對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞的最大無毒濃度大于 500 μ g/mL，在上述不同濃度下作用4天和8天時(shí)都沒觀察到細(xì)胞病變。 藥物對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞表達(dá)HBeAg和HBsAg的抑制實(shí)驗(yàn)經(jīng)胰酶消化后的 H印G2. 2. 15細(xì)胞，以3X IO4/孔密度接種到24孔培養(yǎng)板中，37°C，5% C02孵箱培養(yǎng)48h后， 棄液，用含F(xiàn)BS 5%的1640培養(yǎng)基將藥物倍比稀釋成4個(gè)系列濃度(分別為62. 5 μ g/mL， 125 μ g/mL, 250 μ g/mL, 500 μ g/mL)加入24孔板，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)平行孔，ImL/孔，同時(shí)設(shè) 無藥的細(xì)胞對(duì)照組。分別于第3、6、9天更換新鮮培養(yǎng)基，并將各孔上清液收集至1. 5mL的 離心管中凍存?zhèn)溆?。采用ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，操作按照試劑盒的使用說明進(jìn)行，最后用酶標(biāo)儀讀 取波長450nm處的A值。數(shù)據(jù)采用SPSS軟件分析，統(tǒng)計(jì)描述用mean士SD表示，計(jì)量資料齊 性檢驗(yàn)后進(jìn)行方差分析。結(jié)果見表1和表2 (實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值X 100% )。表1式(1)的化合物對(duì)HBeAg表達(dá)量的抑制作用 表2式(1)的化合物對(duì)HBsAg表達(dá)量的抑制作用
權(quán)利要求
下述式(1)的化合物在制備抗乙型肝炎病毒的藥物中的應(yīng)用式(1)。FSA00000177224200011.tif
全文摘要
本發(fā)明涉及下式(1)表示的木犀草素3’-葡萄糖醛酸苷在制備抗乙型肝炎病毒藥物中的應(yīng)用。這種木犀草素3’-葡萄糖醛酸苷對(duì)宿主HepG2.2.15細(xì)胞無明顯的毒性，對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的最大無毒濃度TC0大于500μg/ml，對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞表達(dá)HBeAg和HBsAg有顯著的抑制作用，經(jīng)含500μg/ml式(1)化合物生長液培養(yǎng)9天后，細(xì)胞上清中HBeAg與HBsAg含量分別為對(duì)照組的51％和70％(即抑制率分別為49％和30％)。式(1)
文檔編號(hào)A61P31/20GK101862343SQ20101020825
公開日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2010年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月23日
發(fā)明者漆淑華 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院南海海洋研究所