本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一類葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶UGT1A1的誘導(dǎo)劑及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

膽紅素是體內(nèi)鐵卟啉化合物的主要代謝產(chǎn)物，不溶于水，很難由腎臟排出，在體內(nèi)過量蓄積可對大腦和神經(jīng)系統(tǒng)引起不可逆的損害。當(dāng)肝臟葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶UGT1A1功能正常時(shí)，膽紅素在肝細(xì)胞UGT1A1酶作用下，與葡萄糖醛酸結(jié)合，轉(zhuǎn)變?yōu)樗苄缘慕Y(jié)合膽紅素，由腎臟排出。遺傳因素或后天因素均能引起UGT1A1酶活性的下降，從而影響膽紅素的代謝清除，引發(fā)臨床上的高膽紅素血癥。Gilbert(GS)綜合征與Crigler-Najjar(CNS)綜合征的發(fā)病機(jī)制均為遺傳因素導(dǎo)致的UGTA1酶活性不足，造成血清中非結(jié)合膽紅素升高?？梢姡琔GT1A1活性差異在高膽紅素血癥發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而開發(fā)UGT1A1酶的誘導(dǎo)劑對于治療高膽紅素血癥具有非常重要的意義。

UGT1A1酶不僅能代謝清除內(nèi)源毒物，也可以促進(jìn)多種外源底物的代謝解毒。CPT-11是喜樹堿的結(jié)構(gòu)衍生物，通過抑制細(xì)胞內(nèi)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ι的活性，抑制癌細(xì)胞生長，從而達(dá)到治療腫瘤的作用。目前CPT-11單獨(dú)或聯(lián)合用藥已作為轉(zhuǎn)移性大腸癌的一線治療方案，同時(shí)該藥對多種實(shí)體腫瘤均有好的療效【Lancet.2000；355:1041-7.】。雖然CPT-11在臨床取得了令人滿意的治療效果，但是由其引發(fā)的嚴(yán)重不良反應(yīng)成為不可回避的問題。CPT-11的毒副作用主要包括：遲發(fā)性腹瀉與中性粒細(xì)胞減少【.Clinical Pharmacology&Therapeutics.2002；72:265-75.European journal of cancer.2010；46:1856-65.】。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，CPT-11的這種劑量依賴性毒性與其活性代謝產(chǎn)物SN-38在人體內(nèi)的蓄積有關(guān)，其中負(fù)責(zé)將SN-38 轉(zhuǎn)化為無毒成分SN-38G的主要二相藥物代謝酶UGT1A1的活性與其毒性發(fā)生密切關(guān)系。UGT1A1*28與UGT1A1*6這兩個(gè)基因型已被報(bào)道能顯著降低酶的活性，多個(gè)臨床研究證實(shí)UGT1A1酶的這兩個(gè)基因型與CPT-11引發(fā)的毒性具有統(tǒng)計(jì)相關(guān)性【The pharmacogenomics journal.2002；2:43-7.Drug Metabolism and Disposition.2009；37:272-6.】。而最新研究結(jié)果也顯示，提高腸道中UGT1A1酶的活性能顯著降低CPT-11引發(fā)的毒性【Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.2013；110:19143-8.】，這也為探索降低CPT-11毒副作用提供了新的思路。因此，開發(fā)出安全有效的UGT1A1酶誘導(dǎo)劑，用以降低CPT-11引發(fā)的毒副反應(yīng)，顯得尤為重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一類新型葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶UGT1A1的誘導(dǎo)劑及其應(yīng)用，該類藥物可顯著提高UGT1A1的表達(dá)量與活性，進(jìn)而用于治療高膽紅素血癥或緩解CPT-11等抗腫瘤藥物引發(fā)的毒副反應(yīng)。

本發(fā)明提供的一類新型葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶UGT1A1的誘導(dǎo)劑，具體為4’,7-二羥基-3’-異戊烯基異黃酮及其乙酰化衍生物，其通式結(jié)構(gòu)式如下所示：

其中：R₁、R₂為—Ac或—H中的任意一種。

一類葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶UGT1A1的誘導(dǎo)劑的應(yīng)用，該類誘導(dǎo)劑可顯著誘導(dǎo) 上調(diào)UGT1A1酶的表達(dá)與活性，進(jìn)而增加機(jī)體對膽紅素的代謝清除能力，降低其致毒反應(yīng)。

一類葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶UGT1A1的誘導(dǎo)劑的應(yīng)用，該類誘導(dǎo)劑可通過誘導(dǎo)人腸道及肝臟體系的UGT1A1酶，加快CPT-11水解產(chǎn)物SN38的代謝清除，進(jìn)而預(yù)防或減緩SN38產(chǎn)生的毒副效應(yīng)。

一類含有葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶UGT1A1的誘導(dǎo)劑的藥物，該類藥物可采用多種劑型，如普通片劑、緩釋片、腸溶片、膠囊劑、滴丸、注射劑等劑型。

本發(fā)明所述UGT1A1強(qiáng)效誘導(dǎo)劑的應(yīng)用，該類藥物可通過誘導(dǎo)UGT1A1酶的表達(dá)，增強(qiáng)肝臟對膽紅素的代謝，進(jìn)而減緩或消除由于膽紅素體內(nèi)蓄積導(dǎo)致的高膽紅素血癥。由此可見，該類藥物能治療由UGT1A1活性不足引起的Gilbert綜合征、Crigler-Najjar綜合征。

本發(fā)明還提供了所述的UGT1A1酶誘導(dǎo)劑的另一個(gè)應(yīng)用，所述的藥物能誘導(dǎo)UGT1A1酶的表達(dá)與活性，提高其底物的代謝清除：該類誘導(dǎo)劑在與藥物(UGT1A1酶的底物或其代謝產(chǎn)物為UGT1A1酶的底物)合用時(shí)，通過誘導(dǎo)人腸道及肝臟體系的UGT1A1酶，增加藥物(UGT1A1酶的底物或其代謝產(chǎn)物為UGT1A1酶的底物)的肝腸代謝清除，減少其毒副效應(yīng)。

本發(fā)明提供的4,7-二羥基-3’-異戊烯基異黃酮及其乙?；苌镌谥委煾吣懠t素血癥與提高其外源底物代謝清除方面的應(yīng)用，該類藥物可作為單體或藥物組合物使用。

本發(fā)明涉及的UGT1A1酶誘導(dǎo)劑——4,7-二羥基-3’-異戊烯基異黃酮的乙酰化衍生物，可在肝腸組織被酯酶水解，在靶器官釋放出4,7-二羥基-3’-異戊烯基異黃酮，避免首過效應(yīng)，提高口服生物利用度。

本發(fā)明涉及的治療高膽紅素血癥的藥物具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1.活性強(qiáng)：該類藥物對UGT1A1酶的誘導(dǎo)能力強(qiáng)，其對UGT1A1酶的誘導(dǎo)能力顯著強(qiáng)于目前公認(rèn)的陽性對照藥物白楊素。

2.安全性高：該類藥物大劑量小鼠整體給藥后，未發(fā)現(xiàn)明顯毒副作用，其LD₅₀>2g/kg,屬于相對安全的藥物候選物。

3.膜通透性強(qiáng)：該類藥物可被腸上皮細(xì)胞快速吸收，其還可快速穿透肝細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)作用靶點(diǎn)，其細(xì)胞膜通透性遠(yuǎn)高于陽性對照藥物白楊素。

附圖說明

圖1 UGT1A1誘導(dǎo)劑4’,7-二羥基-3’-異戊烯基異黃酮及其乙?；苌锏慕Y(jié)構(gòu)式；

圖2 UGT1A1誘導(dǎo)劑4’,7-二羥基-3’-異戊烯基異黃酮二乙酰的NMR譜圖；

圖3 4’,7-二羥基-3’-異戊烯基異黃酮誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞UGT1A1酶mRNA表達(dá)隨時(shí)間的變化；

圖4 4’,7-二羥基-3’-異戊烯基異黃酮誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞UGT1A1酶mRNA表達(dá)隨濃度的變化；

圖5 該類藥物誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞UGT1A1酶活性的能力；

圖6 該類藥物的細(xì)胞毒性。

具體實(shí)施方式

下列實(shí)施例是為了進(jìn)一步說明本發(fā)明，而不是要限制其范圍。

實(shí)施例1

4’,7-二羥基-3’-異戊烯基異黃酮二乙酰衍生物的制備

稱取4’,7-二羥基-3’-異戊烯基異黃酮(圖1，化合物A)200mg溶于二氯甲烷 10mL中，加入三乙胺0.5mL，反應(yīng)液冷卻至0℃，緩慢滴加乙酰氯100μL。反應(yīng)1h，TLC檢測反應(yīng)結(jié)束，緩慢加入水20mL，二氯甲烷30mL提取兩次，合并有機(jī)相，水洗，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓蒸干后得粗品。粗品4mL甲醇加熱回流30min，冷卻，過濾，收集濾餅，真空干燥后得4’,7-二羥基-3’-異戊烯基異黃酮二乙酰衍生物(圖1，化合物C)230mg，白色固體，收率91％。其中4,7-二羥基-3’-異戊烯基異黃酮二乙酰的核磁譜圖如圖2所示。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:1.69(s,6H,2CH₃),2.31(s,3H,COCH₃),2.34(s,3H,COCH₃)，3.23(d,J＝4Hz,2H,CH₂),5.20(t,J＝8Hz,1H,CH＝C),7.13(d,J＝4Hz,1H,ArH),7.33(dd,J＝8.8Hz,J＝2Hz,1H,ArH),7.44(dd,J＝8.4Hz,J＝2Hz,1H,ArH),7.48(d,J＝2Hz,1H,ArH),7.58(d,J＝2Hz,,1H,ArH),8.19(d,J＝8.4Hz,1H,ArH),8.55(s,1H,OCH＝C)；

ESI-MS:m/z 407.1為[M+H]⁺，445.1為[M+K]⁺。

實(shí)施例2

該類藥物誘導(dǎo)UGT1A1酶mRNA表達(dá)的能力

將Caco-2接種于24孔板中，孵育24小時(shí)后將培養(yǎng)基更換為新鮮的含有4’,7-二羥基-3’-異戊烯基異黃酮的含藥培養(yǎng)基，化合物終濃度為25μM。每天更換含藥新鮮培養(yǎng)基，分別在培養(yǎng)12、24、48、72h后用RNA提取試劑收集細(xì)胞。按RNA提取試劑所附的操作流程提取總mRNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。隨后用real-time PCR儀測定細(xì)胞中UGT1A1酶的mRNA表達(dá)水平。通過測定新補(bǔ)骨脂異黃酮隨時(shí)間對UGT1A1酶表達(dá)的誘導(dǎo)能力(圖3)可以看出4’,7-二羥基-3’-異戊烯基異黃酮對UGT1A1的誘導(dǎo)能力隨誘導(dǎo)時(shí)間增加而增強(qiáng)。采用同樣的技術(shù)考察誘導(dǎo)劑濃度對UGT1A1誘導(dǎo)能力的影響(圖4)，表明4’,7-二羥基-3’-異戊烯基異黃酮在0-50μM濃度范圍內(nèi)隨誘導(dǎo)劑濃度增加，誘導(dǎo) 能力增強(qiáng)。另外，7-二羥基-3’-異戊烯基異黃酮的乙?；苌飳aco-2細(xì)胞UGT1A1 mRNA誘導(dǎo)能力與7-二羥基-3’-異戊烯基異黃酮相當(dāng)，25μM7-二羥基-3’-異戊烯基異黃酮單乙酰和7-二羥基-3’-異戊烯基異黃酮雙乙酰與Caco-2細(xì)胞孵育72h，均能提高10倍左右的UGT1A1 mRNA表達(dá)。

實(shí)施例3

熒光探針法測定該類藥物誘導(dǎo)UGT1A1酶活性的能力

Caco-2細(xì)胞接種于75cm²的培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)至70％融合時(shí)，加入25μM 4’,7-二羥基-3’-異戊烯基異黃酮及其乙酰化衍生物，培養(yǎng)期間每天更換含藥新鮮培養(yǎng)基，直到孵育3天。孵育結(jié)束后，用胰酶消化收集細(xì)胞，并用冰PBS清洗細(xì)胞3次。在細(xì)胞沉淀中加入含有1％cocktail蛋白酶抑制劑的PBS，置于冰上進(jìn)行超聲破碎，隨后9000g離心20min，收集上清即為細(xì)胞S9成分，用以測定UGT1A1酶的活性。UGT1A1酶活性的測定流程如下：

(1)200微升體外代謝反應(yīng)體系中，含有50mM Tris-Hcl緩沖液(PH＝7.4)，細(xì)胞S9的蛋白濃度為1mg/ml，Mgcl₂為5mM,UGT1A1探針底物濃度為20μM，于37℃條件下震蕩預(yù)孵5分鐘；

(2)向反應(yīng)體系中加入U(xiǎn)DPG A(終濃度4mM)，起始反應(yīng)；于37℃條件下反應(yīng)90分鐘后，加入200μl的乙腈，劇烈震蕩后，終止反應(yīng)；

(3)采用高速冷凍離心機(jī)，在20000g的條件下，高速離心上述體系10分鐘后，取上清，采用熒光酶標(biāo)儀對水解代謝產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測。結(jié)果(圖5)表明4’,7-二羥基-3’-異戊烯基異黃酮及其乙?；苌飳GT1A1酶活性的誘導(dǎo)能力強(qiáng)于對照藥物白楊素。

實(shí)施例4

該類藥物的透膜評估

該類藥物的透膜評估采用經(jīng)典的Caco-2細(xì)胞模型。將Caco-2細(xì)胞接種于Transwell，培養(yǎng)21天以后，利用電阻率儀測定跨膜電阻值(TEER)確定上皮細(xì)胞層緊密性和完整性后，即可用于藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。在細(xì)胞層頂側(cè)(絨毛面，A面)培養(yǎng)液中加入藥液，同時(shí)在底側(cè)(基底面，B面)加入1.5ml空白緩沖溶液，開始轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，分別在30min、60min、90min、120min在底側(cè)取100μl藥液，并同時(shí)補(bǔ)足100μl空白緩沖溶液。利用HPLC測定待測藥物濃度。利用公式：P_app＝ΔQ/(Δt·A·C₀)計(jì)算藥物的表觀滲透系數(shù)(apparent permeability coefficients，P_app)，其中ΔQ為Δt內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)量，A為膜面積，C₀為藥物的初始濃度，根據(jù)算得的P_app值評價(jià)其透膜能力變化。結(jié)果顯示，三個(gè)化合物都是高通透性的藥物，證明該類藥物可被腸上皮細(xì)胞快速吸收，其還可快速穿透肝、腸細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)作用靶點(diǎn)，其細(xì)胞膜通透性遠(yuǎn)高于陽性對照藥物白楊素。

實(shí)施例5

該類藥物的毒性評估

該類藥物的細(xì)胞毒性評估采用標(biāo)準(zhǔn)的MTT方法。Caco-2細(xì)胞種植于96孔板，每孔10000個(gè)細(xì)胞。貼壁24h后，加入系列濃度的藥物，對照組加入等濃度的DMSO，培養(yǎng)基中的DMSO濃度均保持為0.5％。加藥孵育48小時(shí)后，棄去含藥培養(yǎng)基，加入含有0.5mg/ml MTT的無血清培養(yǎng)基，37℃孵育4小時(shí)。孵育結(jié)束后，輕輕吸去培養(yǎng)基，每孔加入150μL DMSO，震蕩混勻10分鐘。酶標(biāo)儀檢測490nm下的吸收。結(jié)果如圖6所示，該類藥物為50μM時(shí)，Caco-2細(xì)胞的存活率大于95％，表明該化合物具有較好安全性。

選取昆明小鼠(購于大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心)，雌雄各半，體重19-22g。將小鼠隨機(jī)分組，每組20只，雌雄各半。4’,7-二羥基-3’-異戊烯基異黃酮及其乙?；苌锘鞈矣?.5％CMC-Na中，濃度為1g/L。實(shí)驗(yàn)組包括藥物不同劑量 組(50～2000mg/kg)以及0.5％CMC-Na空白對照組。連續(xù)觀察給藥后小鼠的行為狀態(tài)直至14天，并于第14天對不同給藥組小鼠進(jìn)行大體解剖并觀察內(nèi)臟情況。高劑量組2.0g/kg和1.5g/kg給藥組分別觀察到7和3例死亡例，其他劑量組均無死亡例。對死亡個(gè)體進(jìn)行解剖并未發(fā)現(xiàn)肝、腎等主要器官的明顯病變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示小鼠口服該類藥物的LD₅₀值大于2.0g/kg，屬于輕度毒性級別。