專利名稱：蛇葡萄素在制備與醛糖還原酶相關疾病的藥物中的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于天然藥物領域。
背景技術：
隨著生活水平的提高，糖尿病和其他高血糖病有逐年上升的明顯趨勢，1985年全世界患糖尿病人數(shù)為3000萬人，1995年為1.35億人，預計2005年超過2億人，我國現(xiàn)有糖尿病人數(shù)約4000萬人。糖尿病與癌癥、心血管病并稱世界三大疾病，一旦患病終生均需治療。由糖尿病并發(fā)癥(diabetic chronic complications，DCC)引起的死亡數(shù)在發(fā)達國家名列第三名，目前尚無根治的藥物。單純控制糖尿病患者的血糖濃度并不能解決患者的所有問題，糖尿病并發(fā)癥才是糖尿病人至殘和早亡的主要原因，也是現(xiàn)在藥物開發(fā)攻克的一重要方向。大量數(shù)據表明，醛糖還原酶和糖尿病并發(fā)癥有密切關系。在血糖濃度升高時，己糖激酶被葡萄糖飽和，大量葡萄糖經醛糖還原酶轉變?yōu)樯嚼娲?，由于山梨醇轉化為果糖的速率低于山梨醇生成的速率，且山梨醇分子不易透過細胞膜進到血液循環(huán)，因而在細胞內大量儲積而引起細胞內高滲效應、細胞水腫、細胞膜通透性發(fā)生變化，導致一系列病理變化，從而誘發(fā)糖尿病并發(fā)癥，如白內障、視網膜病變、神經病變、腎臟病變等。因此，抑制多元醇途徑中的關鍵酶-AR(aldose reductase)是防止和改善DCC的有效方法，國外已有多種此類藥物進入臨床，如索比尼爾、托瑞司他，后因嚴重的副作用或療效等原因又終止了臨床實驗或退出了市場。依帕司他是現(xiàn)臨床上使用的較好的醛糖還原酶抑制劑ARI(aldosereductase inhibitor)，其于1996年在日本上市，其療效較好，毒副作用相對較小，但是，依帕司他仍然有如下副作用約1％肝功能指數(shù)(ALT，AST或Y GT)上升，其他反應則包括腹瀉，皮膚紅疹，水疤。血漿Greatinine濃度上升等。糖尿病患者是需要終身服用藥物的，尋找療效更好、副作用更低的藥物是急需解決的問題。
本發(fā)明的詳細描述本發(fā)明的目的是提供一種新的療效較好、副作用更低的預防和/或治療與醛糖還原酶相關的疾病的藥物。
本發(fā)明的另一目的是提供一種新的療效較好、副作用更低的預防和/或治療高血糖并發(fā)癥包括糖尿病并發(fā)癥的藥物。
本申請人令人驚奇地發(fā)現(xiàn)蛇葡萄素在預防和/或治療高血糖病并發(fā)癥包括糖尿病并發(fā)癥的制藥領域具有較好的用途。尤其是其療效好、副作用低的特點，有望成為極具競爭力的預防和/或治療高血糖病并發(fā)癥包括糖尿病并發(fā)癥的藥物。
醛糖還原酶(AR)是聚醇代謝通路中的關鍵酶，它催化己糖的還原反應，將葡萄糖和半乳糖轉化為相應的還原產物山梨醇和半乳糖醇，山梨糖醇再在山梨醇脫氫酶的作用下氧化成果糖。在正常生理情況下，聚醇代謝途徑一般不起作用。但是，人體在高血糖的情況下，醛糖還原酶被激活，促使體內的葡萄糖轉化為山梨醇，半乳糖醇轉化為半乳糖醇，山梨醇脫氫酶和半乳糖脫氫酶的活力并未成比例的相應增加，導致山梨醇和半乳糖醇的聚集。大量研究證實，山梨糖醇的聚集和糖尿病并發(fā)癥如眼部組織病變、神經病變、腎臟病等密切相關。臨床上已經證實，抑制醛糖還原酶的活性，降低山梨醇的積累，是治療糖尿病并發(fā)癥和其他高血糖病的有效方法之一。
本發(fā)明的另一目的是尋找一種與現(xiàn)有用藥不同類型的AR抑制劑，現(xiàn)在臨床上使用的是Carboxylic acids和Hydantoins，后者因為有過敏反應停用，前者是目前使用較好的一類藥，典型代表是Epalrestat和Tolrestat。但是，Carboxylic acids的抑制劑不僅仍有副作用，且對糖尿病并發(fā)癥的治療作用仍然有一定局限性，如依帕司他僅僅對視網膜病變程度較輕微者，服用Epalrestat后，病變惡化的程度要比病變嚴重者為緩和，對其他并發(fā)癥則幾無效果；Tolrestat的情況類似，發(fā)現(xiàn)麻木感與運動神經功能服用Tolrestat組要比控制組改善為多，但疼痛感與感覺神經功能則無多大進步。
本發(fā)明的原理是尋找一種醛糖還原酶抑制劑，由于其抑制了醛糖還原酶的活性，因此由醛糖還原酶引起的疾病即可能得到控制，如細胞內山梨醇濃度的聚集導致的白內障、視網膜病變、神經病變、腎臟病變等，細胞內肌纖維醇濃度下降導致的高血糖并發(fā)癥，如神經病變等，NADPH與NAD+等輔酶缺乏引起的需要NADPH與NAD+等輔酶的生理反應，細胞內Na+大幅升高，K+，ATP、游離胺基酸與還原態(tài)Glutathione的濃度下降，Na+與CI-的濃度上升，導致細胞滲透壓增高，導致高血糖并發(fā)癥。
本發(fā)明采用的方法是以還原輔酶-II為輔酶，以依帕司他作為陽性對照，檢測蛇葡萄素對醛糖還原酶的抑制效果。從實驗中發(fā)現(xiàn)，蛇葡萄素是一種較好的AR抑制劑。且隨著蛇葡萄素含量的增加，其抑制活性也增加；見表1和表2。
本發(fā)明還令人驚奇的發(fā)現(xiàn)蛇葡萄素不僅不會導致轉氨酶升高，正相反，它對降低轉氨酶具有明顯的療效。
本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)通過蛇葡萄素和依帕司他的酶動力學的比較，蛇葡萄素對AR的抑制機理不同于依帕司他，依帕司他屬于反競爭型抑制，蛇葡萄素屬于競爭-反競爭的混合型抑制，見

圖1。這也預示著蛇葡萄素對依帕司他無效的糖尿病并發(fā)癥有效。 (1)由不加抑制劑的直線方程知1/Vmax＝79.36，1/Km＝7.87×106。
(2)依帕司他為反競爭抑制1/V′max＝1/Vmax(1+[I0]/Ki)，[I0]為2×10-6M，從y＝163.42+1.0×10-5x知V′max＝163.42，將1/V′max、1/Vmax[I0]代入方程計算知依帕司他的抑制常數(shù)Ki為1.89×10-6M(3)顯齒蛇葡萄素為混合型抑制，1/V′max＝1/Vmax(1+[I0]/K′i)，[I0]為20×10-6M，從y＝111.47+3×10-5x知1/K′m＝3.72×106 1/V′max＝111.47，將1/V′max、1/Vmax[I0]代入方程[49]計算知顯齒蛇葡萄素的抑制常數(shù)K′i為4.94×10-5M由1/K′m＝1/Km×(1+[I0]/K′i)/(1+[I0]/Ki)計算知顯齒蛇葡萄素Ki為1.01×10-5M由K′i＞Ki知蛇葡萄素為競爭-非競爭型抑制本發(fā)明提供了蛇葡萄素在制備預防和/或治療高血糖疾病的藥物中的用途，其中所述疾病包括糖尿病并發(fā)癥。根據本發(fā)明，蛇葡萄素可以制備成預防和/或治療糖尿病并發(fā)癥和高血糖病藥。根據本發(fā)明，蛇葡萄素本身可以直接藥用，也可以通過藥物領域常規(guī)配制技術和載體，配制成藥物組合物。本發(fā)明組合物可以制備成針劑、片劑，還原酶(AP)作為酶，還原型輔酶-II(NADPH)作為輔酶，樣品溶解液為0.1Mol的磷酸鹽緩沖液(pH6.2)，5mmol的巰基乙醇，0.5Mol的Li2SO4，250μMol的NADPH，75μg/l的AP。陰性對照為不加任何抑制劑的溶液，陽性對照為不同濃度的依帕司他，試驗樣品為蛇葡萄素，將上述溶液配好后，加入終濃度為0.5mmol的底物DL-甘油醛，混勻，測定波長為340nm的吸光度，每分鐘檢測一次，連續(xù)記錄10分鐘。
測定的結果見表1表1、不同樣品濃度對醛糖還原酶的抑制活性
由表1結果可知蛇葡萄素對AP具有明顯的抑制活性，且隨濃度的提高，其抑制活性越強。因此蛇葡萄素對與AR相關的疾病具有預防和治療作用。
實施例2不同底物濃度時蛇葡萄素對醛糖還原酶的抑制活性以依帕司他作為陽性對照藥，醛糖還原酶(AP)作為酶，還原型輔酶-II(NADPH)作為輔酶，樣品溶解液為0.1Mol的磷酸鹽緩沖液(pH6.2)，5mmol的巰基乙醇，0.5Mol的Li2SO4，250μMol的NADPH，75μg/l的AP。陰性對照為不加任何抑制劑的溶液，陽性對照為不同濃度的依帕司他，試驗樣品為蛇葡萄素，將上述溶液配好后，加入不同濃度的底物DL-甘油醛，混勻，測定波長為340nm的吸光度，每分鐘檢測一次，連續(xù)記錄10分鐘。
測定的結果見表2
表2、不同底物濃度時樣品對醛糖還原酶的抑制活性樣品底物濃度 底物濃度 底物濃度 底物濃度 底物濃度 底物濃度(mmol)/活 (mmol)/ (mmol)/ (mmol)/ (mmol)/ (mmol)/性活性 活性 活性 活性 活性陰性對照5/12.79 4/11.91 2/12.19 1/11.68 0.5/9.27 0.1/5.59陽性對照5/9.584/8.062/7.671/6.530.5/6.00 0.1/5.19(2×10-6M)蛇葡萄素5/6.764/6.352/6.201/4.710.5/4.27 0.1/3.45(20×10-6M)結論蛇葡萄素在不同底物濃度時，都具有對AR的抑制活性。
實施例3將實施例1和實施例2得到的結果進行酶動力學分析，得到了圖1的動力學曲線，由圖1的結果可知，蛇葡萄素的抑制類型不同于依帕司他，蛇葡萄素為競爭-非競爭型抑制。推理見“本發(fā)明的詳細描述”。
實施例4蛇葡萄素對四氯化碳引起的小鼠試驗性肝損傷的影響將動物隨機分為六組正常對照組、陽性對照組、模型對照組、蛇葡萄素組三組100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg。正常對照組是動物不給任何藥，只給溶劑；陽性對照組為聯(lián)苯雙酯200mg/kg，qdx6，po，聯(lián)苯雙酯為常用的肝炎治療藥，以聯(lián)苯雙酯治療模型動物，觀察療效，作為對照；模型對照組為檢驗藥效，動物必須先制成肝炎模型，使動物患肝炎；蛇葡萄素組是在上述模型基礎上，再給蛇葡萄素，以觀察療效，三組都為Bidx6po。各組動物分組給藥，每組10只小鼠，一日兩次，服用體積0.5ml/20g小鼠，連續(xù)服用六天，末次給藥后1小時腹腔注射1％四氯化碳油溶液0.2ml/只小鼠，空腹16小時后由眼眶靜脈采血，分離血清，測定血清的SGPT(ALT)、SGOT(AST)含量和血清總膽紅素(T-BIL苯甲酸鈉咖啡因比色法)含量， 并與陽性對照組、正常對照組、模型對照組比較，模型對照組服用等量相應溶劑，陽性對照組采用聯(lián)苯雙酯200mg/kg，pox6，每日一次。結果見表3.
表3.蛇葡萄素對四氯化碳引起小鼠肝損傷的血清SGOT的變化組別劑量mg/kg血清SGPT 血清T-BIL(U)X±SD SGOT(U)X±SD模型對照組 0 Bidx6po 109.2±9.883.7±4.6 5.78±2.91蛇葡萄素50 Bidx6po 108.3±10.12 79.4±10.3蛇葡萄素100 Bidx6po 85.3±4.3471.0±10.4 4.24±2.11
蛇葡萄素200 Bidx6po 68.3±4.89* 68.4±9.2** 3.42±1.32聯(lián)苯雙酯200 qdx6po 63.6±4.10** 61.2±4.2** 3.12±1.24*P＜0.05 **P＜0.01與模型組比較從表3的數(shù)據可以看出蛇葡萄素具有極好的治療肝炎的作用。以及降低T-BIL含量，顯示蛇葡萄素用明顯的降酶退黃的保肝作用，且各種轉氨酶的指數(shù)下降。
實施例5蛇葡萄素對D-半乳糖胺致小鼠肝損傷的保護作用將動物隨機分為六組，陽性對照組、模型對照組、正常對照組、蛇葡萄素組分為三組100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg，各組的意義同上述實施例4。正常對照組、模型對照組服用相應的溶劑，陽性對照組腹腔注射200mg/kg，pox6，qd，末次給藥后1小時D半乳糖胺100mg/kg，16小時后由眼眶取血，分離血清，測定血清SGPT，血清SGOT的變化，結果見表4表4蛇葡萄素對D-半乳糖胺致小鼠肝損傷的血清SGPT，SGOT的變化組別劑量mg/kg血清SGPT血清SGOT(U)X±SD(U)X±SD正常對照組 相應溶劑 ＜4033.7±4.7模型對照組 相應溶劑 90.7±17.3 58.3±15.5蛇葡萄素50 Bidx6po 48 50蛇葡萄素100 Bidx6po 34±12.841.2±11.0蛇葡萄素200 Bidx6po 22.4** 31.8*聯(lián)苯雙酯200 qdx6po 23.6±3.9** 33.8±15.2**P＜0.05，**P＜0.01與模型組比較從表4的數(shù)據可以看出蛇葡萄素具有極好的保肝作用，且各種轉氨酶的指數(shù)下降。
實施例6蛇葡萄素的急性毒性研究取小鼠預試后，另選取20只小鼠，雌雄各半，以蛇葡萄素的最大濃度和最大體積給小鼠灌胃給藥，24h給藥3次，連續(xù)觀察7d，記錄小鼠活動行為、大小便和飲食等情況。結果觀察7天，未見動物有行為異常、死亡等情況，體重正常增長。計算其最大灌胃量為26.0g·kg-l。
權利要求
1.一種用于預防和/或治療與醛糖還原酶相關疾病的藥物組合物，特征在于其含有預防和/或治療與醛糖還原酶相關疾病有效量的蛇葡萄素和藥學可接受賦形劑。
2.根據權利要求1的藥物組合物，其中所述與醛糖還原酶相關疾病包括高血糖并發(fā)癥。
3.根據權利要求2的藥物組合物，其中所述高血糖并發(fā)癥包括糖尿病并發(fā)癥。
4.根據權利要求3的藥物組合物，其中所述糖尿病并發(fā)癥包括白內障、視網膜病變、神經病變、腎臟病變。
5.蛇葡萄素在制備醛糖還原酶抑制劑藥物中的用途。
6.根據權利要求5的用途，其中所述醛糖還原酶抑制劑藥物包括治療高血糖病并發(fā)癥的藥物。
7.根據權利要求6的用途，其中所述高血糖病并發(fā)癥包括糖尿病并發(fā)癥。
8.根據權利要求7的用途，其中所述糖尿病并發(fā)癥包括白內障、視網膜病變、神經病變、腎臟病變。
9.根據權利要求5-8任一項的用途，其中所述藥物是藥學中可接受的常規(guī)劑型。
10.根據權利要求9的用途，其中所述劑型包括片劑，膠囊，沖劑，顆粒劑，針劑，滴丸，口服液，緩釋藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種預防和/或治療與醛糖還原酶相關疾病的藥物，其含有預防和/或治療與醛糖還原酶相關疾病的有效量的蛇葡萄素和藥學可接受賦形劑，其中所述與醛糖還原酶相關疾病包括高血糖并發(fā)癥，高血糖并發(fā)癥包括糖尿病并發(fā)癥。本發(fā)明還公開了所述藥物在制備預防和/或治療與醛糖還原酶相關疾病的藥物中的用途。
文檔編號A61P3/00GK1682713SQ200410062289
公開日2005年10月19日 申請日期2004年7月5日 優(yōu)先權日2004年4月12日
發(fā)明者任啟生, 宋新榮, 劉華棟 申請人:北京江中澤生科技有限責任公司