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槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸的制備方法

文檔序號(hào):10621826閱讀:859來源:國知局
槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸的制備方法,它以中藥杠板歸為原料進(jìn)行提取,所得提取液經(jīng)濾過,濃縮,調(diào)節(jié)乙醇含量為40~80%,去除雜質(zhì),上清液濃縮干后用甲醇-水溶解,經(jīng)反相柱層析,20-70%甲醇洗脫,薄層析檢測,含目標(biāo)物流分經(jīng)重結(jié)晶,脫色素,干燥,即可批量獲得純度大于99%的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸純品。本發(fā)明有機(jī)溶劑用量少,毒性小,操作簡單,成本低,易于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模制備及中試生產(chǎn)。
【專利說明】
槲皮素-3-0- β -D-葡萄糖醛酸的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域,具體涉及一種槲皮素-3-0-β -D-葡萄糖醛酸對照品的制 備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 槲皮素-3-0-β?-葡萄糖醛酸(結(jié)構(gòu)如下)是一種自然界存在或經(jīng)槲皮素體 內(nèi)代謝生成的黃酮類活性成分,具有抗氧化應(yīng)激與炎癥[王敏,劉保林,國旭丹。槲皮素 及其代謝物抑制氧化應(yīng)激與炎癥。食品科學(xué)。2013,34(15) :256-260]、抗老年癡呆[Ho M,F(xiàn)erruzzi M. G, Janie E. M, et al. Identification of brain-targeted bioactive dietary quercetin_3-0-glucuronide as a novel intervention for Alzheimer, s disease. FASEB,2013, 27,1-13]、抗脂氧化[Janisch K.M,Williamson G,Need P,et al.Properties of quercetin conjugates Modulation of LDL oxidation and binding to human serum albumin. Free Radical Research. 2004, 38 (8),877-884·]、抗血小板聚 集[Wright B,MoraeslL. A,Kemp C. F, et al.A structural basis for the inhibition of collagen-stimulated platelet function by quercetin and structurally related flavonoids. British Jounal of Pharmacology,2010,159,1312-1325]等生物活性,目前 在治療衰老相關(guān)疾?。▽@?hào):KR2013/008 031)、炎癥性相關(guān)心血管疾?。▽@?hào):US 20130109641A1、骨質(zhì)疏松(專利號(hào):US 20040162247)等方面均已有專利申請,顯示其在 治療及保健藥物領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊。但其物質(zhì)來源仍是制約其應(yīng)用前景主要障礙。目前 中國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心沒有該對照品,而美國Sigma公司懈皮素-3-〇- β D-葡萄糖酸酸對照品 售價(jià)高達(dá)1400元/毫克。中國天然藥物資源十分豐富,因此亟需從自然界尋找富含槲皮 素-3-0-β -D-葡萄糖醛酸的藥材,研究簡單制備工藝,降低制備成本,以填補(bǔ)國內(nèi)這一藥 用前景廣闊原料來源空白。
[0003] 杠板歸,為寥科植物杠板歸的干燥地上部分,又名貫葉寥、蛇倒退、蛇不過、老虎 刺、犁尖草等,具有清熱解毒、利水消腫、止咳,用于咽喉腫痛、肺熱咳嗽、小兒頓咳、水腫尿 少、濕熱瀉痢、濕疹、癤腫、蛇蟲咬傷等癥。杠板歸分布中國各地,資源豐富,原料廉價(jià)易 得。我們通過液相-質(zhì)譜聯(lián)用在線分析技術(shù)(見附圖1)發(fā)現(xiàn)杠板歸主要黃酮成分為槲皮 素-3-0- β -D-葡萄糖醛酸,但先前有關(guān)杠板歸黃酮類成分報(bào)道,多為槲皮素3-0- β -D-葡 萄糖醛酸衍生物及其苷元槲皮素[5-7],分析可能是槲皮素3-0- β -D-葡萄糖醛酸分離或 提取過程中條件劇烈被衍生化或水解生成人工產(chǎn)物所致。而目前從杠板歸中分離制備槲皮 素-3-〇-i3-D-葡萄糖醛酸(專利號(hào):CN 101851261Α)的制備方法需用高濃度乙醇提取、有 機(jī)溶劑萃取、反復(fù)硅膠柱層析等繁瑣操作,且有機(jī)溶劑用量大、毒性大、成本高。我們研究 采用簡單分離工藝即可從杠板歸大量制備槲皮素-3-0-β d-葡萄糖醛酸純品。
[0004]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是克服現(xiàn)有技術(shù)不足,提供一種操作簡單、環(huán)保、成本低廉且所得產(chǎn)品 純度高的槲皮素-3-0-β -D-葡萄糖醛酸的制備方法。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0007] -種槲皮素 -3-0-β -D-葡萄糖醛酸的制備方法,其整體思路為水或稀乙醇提取 藥材,醇水沉淀雜質(zhì),反相柱層析制備初步獲得目標(biāo)物質(zhì),重結(jié)晶精制,其具體制備步驟如 下:
[0008] a.取杠板歸藥材切段,用水或稀乙醇加熱回流提取2次,每次30~90min,濾過, 合并提取濾液;
[0009] b.提取濾液濃縮至適當(dāng)體積,調(diào)節(jié)濾液中的乙醇含量為40~80%,低溫靜置;過 濾或抽濾,去除沉淀;
[0010] c.醇沉后上清液真空減壓濃縮,20-70%甲醇-水溶解含目標(biāo)物樣品,上0DS反相 層析柱,20-70%甲醇洗脫。
[0011] d. 30-60%甲醇/乙醇洗脫流分濃縮,甲醇復(fù)溶,薄層析檢測,含目標(biāo)物流分低溫 靜置,析出淺黃色粉末。
[0012] e.離心分離或汲取母液,轉(zhuǎn)移析出物質(zhì),母液繼續(xù)重結(jié)晶,粗晶無水乙醇洗脫或凝 膠柱層析除色素,直到HPLC檢測純度大于98%,干燥,即制備獲得槲皮素-3-0-β -D-葡萄 糖醛酸純品。
[0013] 本發(fā)明與現(xiàn)有的槲皮素-3-0-β -D-葡萄糖醛酸純化制備技術(shù)比較,有如下優(yōu)點(diǎn), 無需繁瑣費(fèi)時(shí)、成本高、毒性大的多步驟分離、化學(xué)合成或條件設(shè)備苛刻、成本高的組織培 養(yǎng)方法,廉價(jià)易得,只需用到醇-水溶劑體系,環(huán)保、且分離用填料可再生,能反復(fù)使用,操 作簡單,無需用到貴重儀器設(shè)備,從而使樣品制備成本大大減低。
【附圖說明】
[0014] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步闡述。
[0015] 圖1是杠板歸藥材液相-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)色譜圖。A :二極管陣列檢測器(PDA) 響應(yīng)譜圖;B:提取離子流(EIC,m/z 477)譜圖(A、B是兩種檢測方式下的兩種結(jié)果,并列對 比,不分開)。
[0016] 圖2是槲皮素-3-0- β -D-葡萄糖醛酸液相-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)色譜圖。A :二極 管陣列檢測器(PDA)響應(yīng)譜圖;B :電噴霧電離(ESI)負(fù)離子模式下總離子流(TIC)譜圖。
[0017] 圖3是槲皮素-3-0- β -D-葡萄糖醛酸液相-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)色譜圖。A :二極 管陣列檢測器(PDA)響應(yīng)譜圖;B :電噴霧電離(ESI)正離子模式下總離子流(TIC)譜圖。
[0018] 圖4是槲皮素 -3-0-β -D-葡萄糖醛酸負(fù)離子模式質(zhì)譜圖。A :高分辨電噴霧一級 質(zhì)譜(HR-ESI-MS) ;B :高分辨電噴霧二級質(zhì)譜(HR-ESI-MS/MS)質(zhì)譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 實(shí)施例1
[0020] 取杠板歸藥材400g (約4cm/段),加8倍量水微沸加熱回流提取2次,每次1小 時(shí),紗布濾過,濃縮至相當(dāng)于藥材濃度〇. 8g/ml,加乙醇調(diào)整其濃度為50%,低溫靜置,待沉 淀完全,上清液濾過,濃縮,樣品20%甲醇溶解,上0DS開放層析柱(直徑5cmX長32cm), 甲醇-0.05%乙酸水(20 : 80 - 35 : 65 - 45 : 55)梯度洗脫,每半個(gè)柱體積為1個(gè)洗脫 流分,每個(gè)比例洗脫2個(gè)柱體積,45%甲醇洗脫流分減壓濃縮,甲醇復(fù)溶,薄層析,CHC1 3-Me0 H-H20-HC00H(7 : 3 : 0. 5 : 0. 2)展開,254nm下有明顯暗斑點(diǎn)(比移值Rf約0. 4),流分低溫 靜置,待析出大量淺黃色粉末,移除帶色素母液,結(jié)晶部分少量乙醇洗滌,干燥,稱重,HPLC 分析純度為99. 8%,LC-MS電噴霧正負(fù)離子模式分析均只有1個(gè)色譜峰(見附圖2, 3)。
[0021] 槲皮素-3-0-β -D-葡萄糖醛酸結(jié)構(gòu)鑒定:淺黃色無定形粉末(MeOH), UVAnax(MeOH)nm :256,355nm ;HR-ESI-MS :m/z[M-H] 477. 06616(C21H17013,計(jì)算值: 477.〇 6746),分子式為(:21!118013;]^/]^出51) :111/2(%):3〇1.〇3442(100).(見圖4)。
[0022] 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[段營輝,戴毅,高昊,葉文才,姚新生。草珊瑚的化學(xué)成分研 究。中草藥,2010,41(1) :29-32],基本一致。
[0023] 實(shí)施例2
[0024] 取杠板歸藥材400g (約4cm/段),加8倍量30 %乙醇微沸加熱回流提取2次, 每次1小時(shí),紗布濾過,濃縮至相當(dāng)于藥材濃度〇.8g/ml,加乙醇調(diào)整其濃度為50%,低溫 靜置,待沉淀完全,上清液濾過,濃縮,樣品20%甲醇溶解,上0DS開放色譜柱(直徑5cmX 長32cm),甲醇-水(20 : 80 - 30 : 70 - 40 : 60)梯度洗脫,每半個(gè)柱體積為1個(gè)洗 脫流分,各流分減壓濃縮,甲醇復(fù)溶,薄層析,CHCl3-Me0H-H 20-HC00H(7 : 3 : 0. 5 : 0. 2) 展開,254nm下有明顯暗斑點(diǎn)為含目標(biāo)物流分(比移值Rf約0. 4),低溫靜置,待析出大 量淺黃色粉末,結(jié)晶部甲醇溶解,上凝膠色譜柱,甲醇洗脫,TLC檢測CHCl3-Me0H-H 20-HC0 0H(7 : 3 : 0. 5 : 0. 2)展開,與對照品比較,254nm下相同位置斑點(diǎn)即為目標(biāo)物。
[0025] 實(shí)施例3
[0026] 取杠板歸藥材400g (約4cm/段),加8倍量水微沸加熱回流提取2次,每次1小 時(shí),紗布濾過,濃縮至相當(dāng)于藥材濃度〇. 8g/ml,加乙醇調(diào)整其濃度為50%,低溫靜置,待沉 淀完全,上清液濾過,濃縮,樣品20%甲醇溶解,上0DS中低壓層析柱(直徑4cmX長33cm), 甲醇-0.05%乙酸水(20 : 80 - 30 : 70 - 40 : 60)梯度洗脫,40%甲醇洗脫流分減壓濃 縮,甲醇復(fù)溶,薄層析,CHCl3-Me0H-H20-HC00H(7 : 3 : 0. 5 : 0. 2)展開,254nm下有明顯暗 斑點(diǎn)(比移值Rf約0. 4)流分低溫靜置,待析出大量淺黃色粉末,移除帶色素母液,結(jié)晶部 分少量乙醇洗滌,干燥,稱重,HPLC分析純度大于99%。
[0027] 實(shí)施例4
[0028] 取杠板歸藥材400g (約4cm/段),加8倍量水微沸加熱回流提取2次,每次1小 時(shí),紗布濾過,濃縮至相當(dāng)于藥材濃度0. 8g/ml,加乙醇調(diào)整其濃度為50%,低溫靜置,待沉 淀完全,上清液濾過,濃縮,樣品20%甲醇溶解,上ODS中低壓層析柱(直徑4cmX長33cm), 甲醇-0.05%乙酸水(20 : 80 - 30 : 70 - 40 : 60)梯度洗脫,40%甲醇洗脫流分減壓濃 縮,甲醇復(fù)溶,薄層析,CHCl3-Me0H-H20-HC00H(7 : 3 : 0. 5 : 0. 2)展開,254nm下有明顯暗 斑點(diǎn)(比移值Rf約0. 4)流分低溫靜置,待析出大量淺黃色粉末,移除帶色素母液,結(jié)晶部 甲醇溶解,上凝膠色譜柱,甲醇洗脫,TLC檢測CHCl 3-Me0H-H20-HC00H(7 : 3 : 0. 5 : 0. 2) 展開,與對照品比較,254nm下相同位置斑點(diǎn)即為目標(biāo)物,HPLC分析純度大于99%。
[0029] 本發(fā)明所要求保護(hù)的具體技術(shù)方案,不限于上述實(shí)施例所表達(dá)的技術(shù)方案的具體 組合。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種槲皮素-3-0- β -D-葡萄糖醛酸的制備方法,其特征在于步驟如下: a. 取杠板歸藥材切段,用水或稀乙醇加熱回流提取2次,每次30~90min,濾過,合并 提取濾液; b. 提取濾液濃縮至適當(dāng)體積,調(diào)節(jié)濾液中的乙醇含量為40~80%,低溫靜置;過濾或 抽濾,去除沉淀; c. 醇沉后上清液真空減壓濃縮,20-70 %甲醇-水溶解含目標(biāo)物樣品,反相柱層析, 20-70 %甲醇洗脫; d. 甲醇洗脫流分濃縮,甲醇復(fù)溶,薄層析檢測,含目標(biāo)物流分低溫靜置,析出淺黃色粉 末; e. 離心分離或汲取母液,轉(zhuǎn)移析出物質(zhì),母液繼續(xù)重結(jié)晶,粗晶無水乙醇洗脫或凝膠柱 層析除色素,直到HPLC檢測純度大于98%,干燥,即制備獲得槲皮素-3-0- β -D-葡萄糖醛 酸純品。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的槲皮素-3-0- β -D-葡萄糖醛酸的制備方法,其特征在于:步 驟1中,柱層析洗脫溶劑為甲醇-水或甲醇-稀酸水體系,稀酸水為濃度小于1 %的甲酸水 或乙酸水。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的槲皮素-3-0- β -D-葡萄糖醛酸的制備方法,其特征在于:反 相柱層析的填料為反相C-18或C-8填料,層析柱為開放式或中低壓柱層析系統(tǒng)。
【文檔編號(hào)】C07H1/08GK105985392SQ201510053441
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年1月28日
【發(fā)明人】黎雄, 黃閏月, 趙亞, 曾星, 趙晉, 蘇子仁
【申請人】廣東省中醫(yī)院
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