本發(fā)明屬于分子生物學和腫瘤學領域，具體涉及一種環(huán)狀RNAcirc-NFATC3及其用途。
背景技術：
：原發(fā)性肝細胞癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC，以下簡稱肝癌)是全球范圍內最常見的惡性腫瘤之一。全球每年約有74萬患者被新診斷為肝細胞癌，同時約有69萬患者死于肝癌。其中我國占到了全球每年新發(fā)病例的55％，成為全世界肝癌最高發(fā)的地區(qū)之一。迄今，以手術治療為核心的綜合治療仍然是原發(fā)性肝癌患者獲得長期生存的唯一希望，但是目前肝癌治療狀況存在早期診斷困難，手術根治率低、復發(fā)率高、預后差的困擾。主要原因之一是早期診斷困難，AFP作為唯一被廣泛接受用于肝癌診斷或檢測的血清學標記物，其診斷肝癌的敏感度只能達到約50％，眾多因素最終導致超過70％的患者在首次就診時便已進入肝癌晚期，從而喪失了包括手術切除或肝移植的外科根治性治療的機會。故深入研究肝癌發(fā)生和發(fā)展中的分子機制、開發(fā)新的診斷標志物和治療靶點成為當前腫瘤研究的熱點和重點領域。環(huán)狀RNA(ciucularRNA，circRNA)是區(qū)別于傳統(tǒng)線性RNA的RNA家族新成員，不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴、并以共價鍵形成環(huán)形結構的非編碼RNA分子。最新研究表明circRNA具有閉合環(huán)狀結構，主要通過非典型可變剪切加工產生，廣泛存在于各種生物細胞中，具有結構穩(wěn)定，難以被RNA酶降解、表達豐度高、物種間保守性好，表達具有組織及時空特異性等特征,這些特點使得circRNA在新型疾病診斷與治療方法的開發(fā)應用上具有廣闊的前景。Circ-NFATC3(CircBaseID：hsa_Circ_0000711)，其在基因組上的定位為：chr16:68155889-68160513，相應的線性基因為NFATC3(NM_173165)，環(huán)化序列有1298個堿基，包含NFATC3基因的第二和第三個外顯子。申請人研究發(fā)現肝組織中NFATC3基因的RNA存在環(huán)化現象，且環(huán)狀RNAcirc-NFATC3在肝癌組織中表達量顯著下調，過表達circ-NFATC3抑制肝癌細胞的增殖、遷移、侵襲，提示circ-NFATC3可能成為肝癌診斷和治療的新途徑。技術實現要素：本發(fā)明的目的在于根據發(fā)明人對環(huán)狀RNAcirc-NFATC3在人肝癌中的表達及其對肝癌細胞生物學功能的調節(jié)作用的研究，提供基于circ-NFATC3基因及其表達產物在肝癌的診斷和治療方面的用途。為實現上述目的，本發(fā)明所采取的技術方案為：一種環(huán)狀RNAcirc-NFATC3，所述環(huán)狀RNAcirc-NFATC3的基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。所述環(huán)狀RNAcirc-NFATC3的結構是由如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列轉錄后經剪接形成的首尾相連的環(huán)狀RNA結構。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含上述環(huán)狀RNAcirc-NFATC3。本發(fā)明還提供了一種肝癌診斷試劑盒，所述試劑盒包含能夠擴增如上所述的環(huán)狀RNAcirc-NFATC3的引物。優(yōu)選地，所述擴增引物為由如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的DNA序列組成的引物對或由如SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示的DNA序列組成的引物對。本發(fā)明還提供了上述所述的環(huán)狀RNAcirc-NFATC3在制備治療肝癌的藥物中的用途。本發(fā)明還提供了circ-NFATC3基因作為靶基因在制備治療肝癌的藥物中的用途，所述circ-NFATC3基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果在于：(1)本發(fā)明首先通過設計特異的環(huán)狀RNA引物進行RT-PCR、一代測序、RNA酶降解實驗證實circ-NFATC3基因的客觀存在；(2)本發(fā)明通過檢測肝癌病人中circ-NFATC3基因表達情況，發(fā)現其表達水平明顯降低，因此，可作為肝癌的診斷標志；(3)本發(fā)明對circ-NFATC3基因進行了體外細胞功能學的研究，通過將circ-NFATC3基因序列構建到LVminiCirc慢病毒載體上，以構建過表達circ-NFATC3基因的Huh7穩(wěn)定肝癌細胞系。過表達circ-NFATC3基因的肝癌細胞與轉染空載體的對照肝癌細胞相比，其增殖速度、細胞遷移率及細胞侵襲能力等均顯著降低。circ-NFATC3基因及其表達產物可以應用在制備治療肝癌的藥物中。circ-NFATC3基因及其表達產物作為診斷肝癌的標志物，使肝癌診斷更加準確、快速，作為制備治療肝癌藥物的靶基因為治療肝癌提供了新的治療靶點和治療途徑。附圖說明圖1為本發(fā)明實施例1中circ-NFATC3基因表達產物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖2為反映本發(fā)明實施例2中RNaseR對circ-NFATC3和GAPDH影響情況的柱狀圖。圖3為本發(fā)明實施例2中QPCR檢測肝癌組織中circ-NFATC3表達結果對比圖；圖4為本發(fā)明實施例3中構建好的穩(wěn)定細胞株熒光顯微鏡圖和表達結果圖；圖5為本發(fā)明實施例4中在肝癌細胞Huh7中特異性過表達circ-NFATC3基因后的細胞增殖曲線示意圖，其中橫坐標為天數，縱坐標為酶標儀檢測的490nm吸光值；圖6為本發(fā)明實施例5中在肝癌細胞Huh7中特異過表達circ-NFATC3基因后的細胞遷移實驗結果示意圖，其中橫坐標為處理組名稱，縱坐標為發(fā)生遷移的細胞數目。圖7為本發(fā)明實施例6中在肝癌細胞Huh7中特異過表達circ-NFATC3基因后的細胞侵襲實驗結果示意圖，其中橫坐標為處理組名稱，縱坐標為發(fā)生侵襲的細胞數目。具體實施方式本發(fā)明首先通過設計能擴增環(huán)狀RNA的特異性引物，PCR擴增出來NFATC3基因的環(huán)狀RNA，接著進行RNaseR降解實驗，確定了NFATC3基因表達一種由1298個核苷酸組成的，具有閉合環(huán)狀結構的環(huán)狀RNA分子。進一步，本發(fā)明通過采用熒光定量PCR的方法檢測circ-NFATC3基因在肝癌樣本中的表達差異，結果顯示circ-NFATC3基因在肝癌組織中的表達水平明顯低于癌旁組織中的表達水平。故可制作檢測該基因表達變化的試劑盒以用于診斷肝癌。接著，我們對circ-NFATC3基因進行了體外細胞功能學的研究，通過將可以過表達circ-NFATC3基因序列的特異載體轉染到Huh7肝癌細胞系，以建立該基因表達上調的細胞株。過表達circ-NFATC3基因的肝癌細胞與轉染空載體的對照肝癌細胞相比，其增殖速度、細胞遷移率及細胞侵襲能力等均顯著降低。因此，circ-NFATC3基因及其表達產物可以應用在制備治療肝癌的藥物中。本發(fā)明所涉及的技術均為分子克隆常規(guī)技術手段，其中涉及的酶、引物、試劑以及反應條件在未作說明的情況下均可根據本領域技術人員的經驗進行合理選擇，其中涉及試劑耗材屬于市售的普通產品，其中涉及的檢測手段以及儀器也均為本領域技術人員所熟知并熟練掌握。下面通過實施例和試驗例對本發(fā)明的技術方案做進一步的說明，但不應理解為對本發(fā)明的限制。實施例1：RT-PCR反應檢測circ-NFATC3基因在肝癌組織中的表達。具體實驗方案如下：1.RNA提取1)組織處理：取10mg左右組織加入1mlTrizol，用勻漿機勻漿；離心15分鐘，12000g，取上清。2)向上清中加入200ul氯仿，上下用力顛倒混勻半分鐘，靜置3分鐘。3)4℃，12000g離心15分鐘，此時可見裂解液分三層：上層為水相的RNA；中層為DNA，脂類等；下層為細胞殘渣，蛋白，多糖等。4)取上清到新的EP管內；加入等體積的異丙醇，混勻，靜置10分鐘后，4℃，12000g離心10分鐘。5)小心去掉上清，注意不要丟失RNA沉淀，加入1ml75％乙醇,上下顛倒，使沉淀塊重懸起。6)4℃，12000g離心10分鐘,小心去掉上清，盡量吸干管壁的液體，注意不要丟失RNA沉淀，若沉淀松動可再次離心。晾干約15分鐘，至管壁無液體。7)加入適量體積(20-30ul)的DEPC水溶解RNA，58℃水浴10分鐘。8)取出2ul定量，測量buffer:10mMTrisCl(pH7.8)，根據定量結果進行逆轉錄。(1A260＝40μg/ml,A260/A280＝1.8～2.1)。2.cDNA逆轉錄1)實驗體系M-MLVReverseTranscriptase：3.引物：環(huán)狀RNA引物為反向引物，同時設計一對正向引物做對照，RT-PCR時設立一組gDNA模板對照，證實circRNA來自轉錄后剪切，而不是基因融合等突變。同時檢測線性基因GAPDH作為陰性對照。使用的引物如下所列：SEQIDNO:2Circ-NFATC3_FdivergentGTGACTTTGGAGCTGAAACGATGGSEQIDNO:3Circ-NFATC3_RdivergentAAGGTAGCCGAGGGGCAGTAASEQIDNO:4Circ-NFATC3_FconvergentCCATCGTTTCAGCTCCAAAGTCACSEQIDNO:5Circ-NFATC3_RconvergentTTACTGCCCCTCGGCTACCTTSEQIDNO:6hsaGAPDHconvergent_FGAGTCAACGGATTTGGTCGTSEQIDNO:7hsaGAPDHconvergent_RGACAAGCTTCCCGTTCTCAGSEQIDNO:8hsaGAPDHdivergent_FTCCTCACAGTTGCCATGTAGACCCSEQIDNO:9hsaGAPDHdivergent_RTGCGGGCTCAATTTATAGAAACCGGG4.PCR：以GAPDH作為內對照。PCR的反應體系：每個反應管中分別加入2μl10×Buffer，分別加入2μldNTP，1μl正向引物，1μl反向引物，1μlcDNA模板，0.2μlTaq酶，加水至20μl。PCR反應條件如下：94℃，5分鐘預變性；94℃，30秒變性；55℃，30秒退火；72℃，30秒延伸；35個循環(huán)，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，結果見圖1，圖1中環(huán)狀RNA引物為反向引物(黑色三角形符號)，同時設計一對正向引物做對照(白色三角形符號)，RT-PCR時設立一組gDNA模板對照，證實circRNA來自轉錄后剪切，而不是基因融合等突變，同時檢測線性基因GAPDH作為陰性對照。實施例2：QPCR檢測肝癌中circ-NFATC3的表達情況1.RNA提取：同實施例1；2.cDNA逆轉錄：同實施例1；3.QPCR擴增實驗1)實驗體系：選用實施例1的circ-NFATC3divergent引物用于擴增環(huán)狀RNAcirc-NFATC3，實施例1的hsaGAPDHconvergent引物用于擴增內參基因。2)反應條件：第一步：95℃2min第二步(40個循環(huán))：95℃3秒，60℃30秒第三步60–95℃溶解曲線3)上機進行目標基因擴增4)qPCR相對定量結果目標基因的相對表達量計算公式為：2-△△Ct＝2-【(△Ct)Test-(△Ct)Control】。Ct目的為目標基因Ct值，Ct管家為管家基因Ct值。△Ct＝Ct目的-Ct管家，表示各樣本目的基因相對管家基因的相對Ct值，△△Ct＝(△Ct)Test-(△Ct)Control，表示處理組相對對照組進行歸一化，2-△△Ct表示處理組相對對照組的相對表達量，表示目標基因相對表達倍數。TotalRNA按3U/ug的比例加入RNaseR進行消化，QPCR檢測加與不加RNaseR對circ-NFATC3和GAPDH的影響，結果見圖2，RNaseR消化證實circ-NFATC3對RNA酶不敏感。RNaseR是一個能消化線性RNA，但對環(huán)狀RNA沒有影響的RNA酶，將totalRNA用RNaseR消化后再進行QPCR檢測，結果顯示加與不加RNaseR對circ-NFATC3表達沒有明顯影響，但是線性基因GAPDH經RNaseR消化后表達顯著降低。QPCR檢測肝癌和相應癌旁組織中circ-NFATC3和GAPDH的表達水平，結果見圖3，在24對肝癌臨床組織樣本中檢測circ-NFATC3的表達，結果顯示circ-NFATC3在癌組織中顯著下調。Control：癌旁組織，Tumor：肝癌組織。實施例3：過表達circ-NFATC3慢病毒及其穩(wěn)定細胞系構建1.過表達circ-NFATC3慢病毒載體構建：在上海捷瑞公司合成circ-NFATC3線性全序列，序列經過退火成雙鏈DNA片段，通過多克隆位點插入到LVminiCirc載體，重組質粒通過測序進行鑒定，Control陰性對照為未插入序列的LVminiCirc空載體。2.慢病毒包裝(1)轉染前24h，用胰酶消化對數生長期的293T細胞，傳代到10cm細胞培養(yǎng)皿，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。24h待細胞密度達70％～80％時即可用于轉染。細胞狀態(tài)對于病毒包裝至關重要，因此需要保證良好的細胞狀態(tài)和較少的傳代次數。(2)轉染前將細胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。(3)向一滅菌離心管中加入所制備的各DNA溶液(LVminiCirc-Circ-NFATC3/LVminiCirc載體10μg，pGag/Pol載體5μg、pRev載體5μg、pVSV-G載體5μg)，與相應體積的Opti-MEM混合均勻，調整總體積為1.5ml。(4)將Lipofectamine2000試劑輕柔搖勻，取60μlLipofectamine2000試劑在另一管中與1.5mlOpti-MEM混合，在室溫下溫育5分鐘。(5)把稀釋后的DNA與稀釋后的Lipofectamine2000進行混合，輕輕地顛倒混勻，不要振蕩。(6)混合后，在室溫下溫育20分鐘，以便形成DNA與Lipofectamine2000稀釋液的轉染復合物。(7)將DNA與Lipofectamine2000混合液轉移至293T細胞的培養(yǎng)液中，混勻，于37℃，5％CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(8)培養(yǎng)6小時后吸去含有轉染混和物的培養(yǎng)基，每瓶細胞中加入含10％血清的細胞培養(yǎng)基10ml，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)48小時。3.病毒的收獲及濃縮(1)收集轉染后48小時和72小時(轉染即可為0小時計起)的293T細胞上清液。(2)于4℃，4000g離心10min，除去細胞碎片。(3)以0.45μm濾器過濾上清液于50ml離心管中。(4)把病毒粗提液樣品加入到過濾杯中(最多19ml)，蓋上蓋子。將過濾杯插到濾過液收集管中。(5)組合好后，做好平衡，放在轉頭上。(6)在5000×g離心，至需要的病毒濃縮體積。通常需要的時間為10-15分鐘。(7)離心結束后，過濾杯中的即為病毒濃縮液。(8)將病毒濃縮液移出，分裝后保存在病毒管中，可在4℃保存一周，或-80℃長期保存。取其中一支進行病毒生物學滴度測定。4.慢病毒感染細胞：(1)根據細胞的量將細胞在1.5ml管中離心收集然后用100-200ul的無血清培養(yǎng)液稀釋細胞沉淀，以細胞完全浸沒在培養(yǎng)基中為準。(2)吸取過表達的circ-NFATC3病毒液加入細胞中，將1.5ml管放在37℃度培養(yǎng)箱中孵育30分鐘。另取LVminiCirc空載體對照病毒感染做對照細胞系。(3)將管中混合溶液吸出加到培養(yǎng)皿中或孔里。(4)加入足夠量的新鮮培養(yǎng)液。(5)12小時后換液。(6)48小時后加入2ug/mlpuromycin進行穩(wěn)定細胞株篩選。5.穩(wěn)定細胞株鑒定：構建好的穩(wěn)定細胞株熒光顯微鏡下拍照觀察，GFP陽性率>95％，同時收取部分細胞QPCR檢測，證實circ-NFATC3的過表達效率>2倍。結果見圖4，將circ-NFATC3基因特異的序列構建到LVminiCirc慢病毒載體上，通過慢病毒構建過表達circ-NFATC3的Huh7-circ-NFATC3穩(wěn)定細胞株，結果顯示GFP陽性率>95％，QPCR檢測證實circ-NFATC3成功過表達，過表達效果達到2倍。實施例4：過表達circ-NFATC3基因的肝癌細胞增殖能力測定(1)將Huh7-circ-NFATC3細胞株及對照細胞消化成單細胞懸液，計數，調整細胞濃度為1×105個/ml，分到96孔板，每孔100ul，即每孔細胞為1×104個，各9孔。(2)分別在不同的時間點(24h、48h、72h)加入MTS試劑，比例為1：10，即100μl培養(yǎng)液加入10μl檢測液。(3)37℃孵育4h后，酶標儀檢測490nm吸光值。結果見圖5，過表達circ-NFATC3的肝癌細胞株生長速度減慢，在肝癌細胞Huh7中特異性過表達circ-NFATC3基因后的細胞增殖曲線示意圖，其中橫坐標為天數，縱坐標為酶標儀檢測的490nm吸光值。實施例5過表達circ-NFATC3基因的肝癌細胞遷移能力檢測(1)胰酶消化成單細胞懸液，計數，用無血清培養(yǎng)基調整細胞濃度至1×106/ml。(2)加入100μl細胞懸液至小室上室，在下室中加入600μl含不同濃度胎牛血清的完全培養(yǎng)基。37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育24h。(3)取出小室，用棉簽擦去上室的細胞，4％多聚甲醛固定10min，PBS洗滌一次，結晶紫染色10min，PBS洗滌一次，顯微鏡觀測并拍照。結果見圖6，過表達Circ-NFATC3的肝癌細胞株遷移率增加，在肝癌細胞Huh7中特異過表達circ-NFATC3基因后的細胞遷移實驗結果示意圖，其中橫坐標為處理組名稱，縱坐標為發(fā)生遷移的細胞數目。實施例6：過表達circ-NFATC3基因的肝癌細胞細胞侵襲實驗(1)將Matrigel置于4℃中過夜溶解，用預冷的基礎培養(yǎng)基按Matrigel：培養(yǎng)基＝1：3的比例稀釋，取40μl加入預冷的Transwell小室中，動作要慢，避免產生氣泡。(2)37℃孵育2小時使Matrigel凝固。(3)分別在上下室加入100μl和600μl基礎培養(yǎng)基，37℃水合過夜。次日吸去培養(yǎng)基。(4)實驗細胞胰酶消化后，取適量細胞懸液，800rpm離心5分鐘。(5)吸去上清，用基礎培養(yǎng)基重懸細胞后，細胞計數并用基礎培養(yǎng)基調整細胞濃度至1×106/ml，取100μl加入至Transwell小室上室，在下室加入600μl完全培養(yǎng)基。(6)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48小時后，取出小室，用棉簽擦去上室的細胞，4％多聚甲醛固定15分鐘，PBS洗滌一次，1％結晶紫染色10分鐘，PBS洗滌一次，顯微鏡下觀察細胞是否穿過小孔。如有穿過，終止其他實驗組，拍照并統(tǒng)計穿過的細胞數。結果見圖7，過表達Circ-NFATC3的肝癌細胞株侵襲率增加，在肝癌細胞Huh7中特異過表達circ-NFATC3基因后的細胞侵襲實驗結果示意圖，其中橫坐標為處理組名稱，縱坐標為發(fā)生侵襲的細胞數目。最后所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非對本發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的實質和范圍。當前第1頁1 2 3