本發(fā)明屬于分子生物學(xué)長(zhǎng)鏈非編碼RNA的應(yīng)用領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)、與其對(duì)應(yīng)的分離的多核苷酸、與其特異性結(jié)合的寡核苷酸引物對(duì)、lncRNA芯片、試劑盒，還涉及用所述試劑盒定量檢測(cè)血液中對(duì)應(yīng)長(zhǎng)鏈非編碼RNA的方法。
背景技術(shù)：
宮頸癌是發(fā)生在宮頸陰道部位或移行帶的鱗狀上皮細(xì)胞及宮頸管內(nèi)膜的柱狀上皮細(xì)胞交界處的惡性腫瘤，發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居第二位，僅次于乳腺癌。近年國外研究報(bào)道：在普通人群中宮頸癌的發(fā)病率有所下降，但在發(fā)展中國家，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率反而增加并有年輕化傾向。在中國，每年有13萬個(gè)新發(fā)宮頸癌病例，且發(fā)病年齡呈年輕化趨勢(shì)。目前，治療宮頸癌的方法主要有手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)治療，根據(jù)2010年NCCN宮頸癌臨床實(shí)踐指南，放療是治療宮頸癌的重要手段之一，其適應(yīng)癥廣泛，除嚴(yán)重的肝腎功能，造血功能障礙外，I～I(xiàn)V期患者均可進(jìn)行放射治療，尤其對(duì)于晚期、復(fù)發(fā)或者無法手術(shù)的患者，放射治療是治療的重要方法。然而宮頸癌是目前能通過早期診斷而完全治愈的婦科腫瘤，因此，早期發(fā)現(xiàn)并予以積極預(yù)防和及時(shí)治療，對(duì)提高宮頸癌的生存率，降低死亡率有重要意義。有創(chuàng)性檢查雖然能夠達(dá)到增高疾病診斷的正確率，但同時(shí)也增加了患者的痛苦。同時(shí)在對(duì)癌組織進(jìn)行活檢的過程中，也增加了人為導(dǎo)致癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的可能。長(zhǎng)期以來研究人員一直期望能夠找到一種早期檢測(cè)出惡性腫瘤的指標(biāo)，不僅能減輕患者痛苦，還能對(duì)腫瘤的診斷、分類、預(yù)后及治療發(fā)揮指導(dǎo)作用，因此有學(xué)者提出了腫瘤標(biāo)志物這一概念。
腫瘤標(biāo)志物(tumor marker，TM)是指在惡性腫瘤的發(fā)生和增殖過程中，因腫瘤細(xì)胞的相關(guān)基因表達(dá)或機(jī)體對(duì)腫瘤產(chǎn)生反應(yīng)而異常變化的一類物質(zhì)。其隨著腫瘤的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)行變化，主要表現(xiàn)為體液中某種正?；钚晕镔|(zhì)的異常增多或者異常物質(zhì)的出現(xiàn)。隨著腫瘤標(biāo)志物種類的不斷發(fā)現(xiàn)，和人們對(duì)腫瘤標(biāo)志物認(rèn)識(shí)的不斷加深，更多的腫瘤標(biāo)志物已被應(yīng)用于臨床。腫瘤標(biāo)志物的主要用途有：腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、腫瘤的普查及篩查、腫瘤的診斷及分期、腫瘤治療效果監(jiān)測(cè)、腫瘤的復(fù)發(fā)檢測(cè)、腫瘤治療的預(yù)后和腫瘤原發(fā)灶的尋找。宮頸上皮內(nèi)癌變和早期宮頸癌往往沒有任何臨床癥狀，有些患者在發(fā)生陰道流血或疼痛等臨床癥狀時(shí)才來就診，錯(cuò)過了最佳的診斷時(shí)機(jī)。此外，有研究顯示早期宮頸癌患者的5年生存率可達(dá)66％-95％，而中晚期患者的5年生存率僅為9％-64％，因此早期發(fā)現(xiàn)宮頸癌的腫瘤標(biāo)志物對(duì)于患者的早期診斷、治療有重要意義。
LncRNA是指長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，現(xiàn)已研究證實(shí)lncRNA在蛋白編碼基因的調(diào)控、干細(xì)胞的增殖和老化中發(fā)揮重要的作用。近年來隨著基因芯片技術(shù)的迅速發(fā)展，研究者已經(jīng)通過lncRNA芯片和lncRNA測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)大量在腫瘤中差異表達(dá)的lncRNA。LncRNA的作用在多種腫瘤中已證實(shí)，但是lncRNA在腫瘤的篩查中是否具有特異性還有待研究。而且目前關(guān)于lncRNA的研究主要集中于腫瘤與正常組織的比較，對(duì)于治療后lncRNA水平變化是否對(duì)癌癥預(yù)后以及治療方案的確定有指示作用仍有待研究，尤其是在放療后宮頸癌的lncRNA的變化尚未見報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明人利用生物信息學(xué)的方法篩選出宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中差異性表達(dá)的lncRNA，并與放療后的lncRNA芯片相結(jié)合，從而篩選出與宮頸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的lncRNA作為腫瘤標(biāo)記物，通過血液中l(wèi)ncRNA的定量檢測(cè)輔助進(jìn)行計(jì)算，為宮頸癌放療效果的預(yù)后以及后續(xù)治療方案的確定提供參考。
為此，本發(fā)明包括下述技術(shù)方案：
第一方面的技術(shù)方案提供了一種lncRNA，所述的lncRNA具有如SEQ ID NO:3所示的序列。
另外，還提供了第一方面技術(shù)方案所述的lncRNA的用途，用于制備用于定量檢測(cè)血液樣本中具有如SEQ ID NO:3所示的序列的lncRNA的寡核苷酸引物對(duì)、lncRNA芯片或試劑盒。
第二方面的技術(shù)方案提供了一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸能轉(zhuǎn)錄成第一方面技術(shù)方案所述的具有如SEQ ID NO:3所示的序列的lncRNA。
第三方面的技術(shù)方案提供了寡核苷酸引物對(duì)，所述的寡核苷酸引物對(duì)特異性地結(jié)合于第一方面技術(shù)方案所述的具有SEQ ID NO:3所示的序列的lncRNA。
優(yōu)選地，所述的寡核苷酸引物對(duì)具有如SEQ ID NO:1-2所示的序列。所述SEQ ID NO:1-2分別對(duì)應(yīng)為SEQ ID NO:3所示的lncRNA的上游和下游引物的序列。
第四方面的技術(shù)方案提供了一種lncRNA芯片，所述的lncRNA芯片包括：固相載體；以及固定在所述固相載體上的第三方面技術(shù)方案所述的寡核苷酸引物對(duì)。優(yōu)選地，所述的寡核苷酸引物對(duì)具有如SEQ ID NO:1-2所示的序列。
另外，還提供了所述lncRNA芯片的用途，用于制備用于定量檢測(cè)血液樣本中具有如SEQ ID NO:3所示的序列的lncRNA的試劑盒。
第五方面的技術(shù)方案提供了一種用于定量檢測(cè)血液樣本中具有如SEQ ID NO:3所示的序列的lncRNA的試劑盒，所述的試劑盒中含有第三方面技術(shù)方案所述的寡核苷酸引物對(duì)或第四方面技術(shù)方案所述的lncRNA芯片。優(yōu)選地，所述的寡核苷酸引物對(duì)具有如SEQ ID NO:1-2所示的序列。
第六方面的技術(shù)方案提供了一種定量檢測(cè)血液樣本中具有如SEQ ID NO:3所示的序列的lncRNA的方法，使用第三方面技術(shù)方案所述的寡核苷酸引物對(duì)、第四方面技術(shù)方案所述的lncRNA芯片、或第五方面技術(shù)方案所述的試劑盒。優(yōu)選地，所述的寡核苷酸引物對(duì)具有如SEQ ID NO:1-2所示的序列。
在本發(fā)明中，篩選lncRNA的研究步驟簡(jiǎn)述為在取得宮頸癌樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行宮頸癌原始數(shù)據(jù)預(yù)處理后，篩選宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中差異表達(dá)的lncRNA，從中篩選放療后差異表達(dá)并且有治療價(jià)值的lncRNA，再通過繪制ROC曲線評(píng)價(jià)lncRNA作為腫瘤標(biāo)志物的能力。
另外，本發(fā)明針對(duì)上述篩選出的lncRNA NONHSAG006570，設(shè)計(jì)了可與其特異性結(jié)合的具有SEQ ID NO:1-2的序列的群的寡核苷酸引物對(duì)，進(jìn)而獲得包括固相載體以及固定在所述固相載體上的寡核苷酸引物對(duì)的lncRNA芯片、含有上述寡核苷酸引物對(duì)或上述lncRNA芯片的試劑盒。
通過使用上述的寡核苷酸引物對(duì)、lncRNA芯片、或試劑盒，本發(fā)明通過對(duì)血液樣本提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR和PCR，提供了一種定量檢測(cè)血液樣本中上述lncRNA NONHSAG006570表達(dá)水平改變的便捷方法。此方法可用于放療后迅速檢測(cè)宮頸癌預(yù)后以及后續(xù)治療方案的輔助確定，具體參見下文介紹。
附圖說明
圖1為lncRNA NONHSAG006570的ROC曲線，其相應(yīng)具體數(shù)據(jù)參見表4。
具體實(shí)施方式
對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)中存在的治療后lncRNA水平變化是否對(duì)癌癥預(yù)后有指示作用仍少有研究，尤其是在放療后宮頸癌的lncRNA的變化尚未見報(bào)道的問題，本研究通過對(duì)24例宮頸正常組織樣本和28例宮頸癌樣本，通過芯片差異顯著性分析篩選宮頸癌發(fā)生過程中差異表達(dá)的lncRNA，將其與放療后的lncRNA芯片相結(jié)合，篩選出有治療價(jià)值的lncRNA NONHSAG006570，對(duì)該lncRNA進(jìn)行功能研究分析發(fā)現(xiàn)，NONHSAG006570參與有絲分裂細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、有絲分裂細(xì)胞周期的G2/M期、染色體分離等生物學(xué)過程，KEGG信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)它在癌癥、細(xì)胞周期、MAPK等信號(hào)通路中發(fā)揮作用。
通過使用上述定量檢測(cè)血液樣本中的lncRNA NONHSAG006570的方法，可對(duì)臨床采集血樣進(jìn)行l(wèi)ncRNA的高通量檢測(cè)，分別采集放療前、放療3次后、放療6次后血樣進(jìn)行l(wèi)ncRNA NONHSAG006570的高通量分析。然后將放療3次后與放療6次后的樣本分別與放療前的樣本進(jìn)行比較，篩選出比值變化上調(diào)大于1.5倍以上的樣本，可視為放療后宮頸癌預(yù)后差的對(duì)象，建議結(jié)合其他診斷方法，并建議進(jìn)行放療之外的其它治療方案。
此方法方便簡(jiǎn)捷，通過對(duì)定量檢測(cè)出的患病個(gè)體在放療前后血液樣本中上述的lncRNA的表達(dá)進(jìn)行比較，利于在放療后早期判斷預(yù)后并予以積極預(yù)防和及時(shí)治療，對(duì)提高宮頸癌的生存率，降低死亡率有重要意義。并且，定量檢測(cè)血液樣本中上述的lncRNA的表達(dá)比較有創(chuàng)性檢查，減少了患者的痛苦，也避免了對(duì)癌組織進(jìn)行活檢的過程中會(huì)增加了人為導(dǎo)致的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的可能。
具體地，本發(fā)明包括下述技術(shù)方案：
第一方面的技術(shù)方案提供了一種lncRNA，所述的lncRNA具有如SEQ ID NO:3所示的序列。
另外，還提供了第一方面技術(shù)方案所述的lncRNA的用途，用于制備用于定量檢測(cè)血液樣本中具有如SEQ ID NO:3所示的序列的lncRNA的寡核苷酸引物對(duì)、lncRNA芯片或試劑盒。進(jìn)一步地，也可用于制備放療后宮頸癌預(yù)后評(píng)估的芯片或試劑盒。
第二方面的技術(shù)方案提供了一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸能轉(zhuǎn)錄成第一方面技術(shù)方案所述的具有如SEQ ID NO:3所示的序列的lncRNA。
第三方面的技術(shù)方案提供了寡核苷酸引物對(duì)，所述的寡核苷酸引物對(duì)特異性地結(jié)合于第一方面技術(shù)方案所述的具有SEQ ID NO:3所示的序列的lncRNA。
優(yōu)選地，所述的寡核苷酸引物對(duì)具有如SEQ ID NO:1-2所示的序列。所述SEQ ID NO:1-2分別對(duì)應(yīng)為SEQ ID NO:3所示的lncRNA的上游和下游引物的序列。
第四方面的技術(shù)方案提供了一種lncRNA芯片，所述的lncRNA芯片包括：固相載體；以及固定在所述固相載體上的第三方面技術(shù)方案所述的寡核苷酸引物對(duì)。優(yōu)選地，所述的寡核苷酸引物對(duì)具有如SEQ ID NO:1-2所示的序列。
另外，還提供了所述lncRNA芯片的用途，用于制備用于定量檢測(cè)血液樣本中具有如SEQ ID NO:3所示的序列的lncRNA的試劑盒。進(jìn)一步地，也用于制備放療后宮頸癌預(yù)后評(píng)估的試劑盒。
第五方面的技術(shù)方案提供了一種用于定量檢測(cè)血液樣本中具有如SEQ ID NO:3所示的序列的lncRNA的試劑盒，所述的試劑盒中含有第三方面技術(shù)方案所述的寡核苷酸引物對(duì)或第四方面技術(shù)方案所述的lncRNA芯片。優(yōu)選地，所述的寡核苷酸引物對(duì)具有如SEQ ID NO:1-2所示的序列。所述試劑盒具體可用于放療后宮頸癌的預(yù)后評(píng)估。
第六方面的技術(shù)方案提供了一種定量檢測(cè)血液樣本中具有如SEQ ID NO:3所示的序列的lncRNA的方法，使用第三方面技術(shù)方案所述的寡核苷酸引物對(duì)、第四方面技術(shù)方案所述的lncRNA芯片、或第五方面技術(shù)方案所述的試劑盒。優(yōu)選地，所述的寡核苷酸引物對(duì)具有如SEQ ID NO:1-2所示的序列。
通過提取新鮮血液中的RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA后，通過實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行具有如SEQ ID NO:3所示的序列的lncRNA的相對(duì)定量。
以下是本發(fā)明的具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的描述，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于這些實(shí)施例。凡是不背離本發(fā)明構(gòu)思的改變或等同替代均包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，在實(shí)施例中，包括了很多常用試劑、常規(guī)方法，故實(shí)施例中出現(xiàn)的試劑不僅限于列出的試劑供應(yīng)商品牌。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法，或按照制造廠商所建議的條件與實(shí)驗(yàn)步驟。
篩選lncRNA作為腫瘤標(biāo)志物主要通過如下步驟：
1.取得宮頸癌樣本數(shù)據(jù)
從GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)的主頁面選擇編碼是GSE63514的樣本集，此樣本集中共包含128個(gè)樣本芯片，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)?zāi)康淖罱K選用24例正常宮頸組織和28例宮頸癌組織納入后續(xù)分析。
2.預(yù)處理宮頸癌原始數(shù)據(jù)
經(jīng)過ncFANs在線服務(wù)器的處理后重新注釋共10914個(gè)探針，其中編碼基因9196個(gè)，lncRNA共1718個(gè)。
3.篩選宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中差異表達(dá)的lncRNA
進(jìn)行差異表達(dá)基因和lncRNA篩選，首先對(duì)28例宮頸癌組織和24例正常宮頸組織的樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，將有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的lncRNA納入后續(xù)分析；然后將宮頸癌組織表達(dá)均值與宮頸正常組織表達(dá)均值進(jìn)行比較，將符合宮頸癌組織表達(dá)均值/宮頸正常組織表達(dá)均值≥2或者≤0.5的lncRNA納入后續(xù)分析；對(duì)于發(fā)生改變的樣本數(shù)少于總樣本數(shù)20％的基因剔除，通過三次篩選后將剩余的lncRNA做進(jìn)一步的分析。本研究中共有54個(gè)lncRNA差異性表達(dá)，其中上調(diào)23個(gè)，下調(diào)31個(gè)(結(jié)果見表1，表2)。
表1宮頸癌中上調(diào)的lncRNA
表2宮頸癌中下調(diào)的lncRNA
4.篩選放療后差異表達(dá)的lncRNA
臨床采集血樣進(jìn)行l(wèi)ncRNA的高通量檢測(cè)，分別采集放療前、放療3次后、放療6次后血樣進(jìn)行l(wèi)ncRNA的高通量分析。為擴(kuò)大lncRNA的篩選范圍，保證lncRNA不被漏選，將差異變化的標(biāo)準(zhǔn)降低為1.5倍，即將放療3次后與放療6次后的樣本分別與放療前的樣本進(jìn)行比較，比值變化大于1.5倍以上或小于0.666倍以下的lncRNA保留，納入后續(xù)的篩選范疇。
5.篩選有治療價(jià)值的lncRNA
將上述步驟3中篩選出來的lncRNA與步驟4中篩選出來的lncRNA比對(duì)，篩選出在腫瘤發(fā)展過程中上調(diào)的同時(shí)在放療后下調(diào)的lncRNA，或者是在腫瘤發(fā)展過程中下調(diào)的而在放療后上調(diào)的lncRNA，最終篩選出NONHSAG006570(見實(shí)施例中的表3)。
評(píng)價(jià)lncRNA作為腫瘤標(biāo)志物的能力是通過繪制ROC曲線來進(jìn)行的。
本文所用術(shù)語“ROC曲線”又稱為受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve)，是反映敏感性和特異性連續(xù)變量的綜合指標(biāo)，是用構(gòu)圖法揭示敏感性和特異性的相互關(guān)系。它通過將連續(xù)變量設(shè)定出多個(gè)不同的臨界值，從而計(jì)算出一系列敏感性和特異性，再以靈敏性為縱坐標(biāo)、特異度為橫坐標(biāo)繪制成曲線，曲線下面積(AUC)越大，診斷準(zhǔn)確性越高。在ROC曲線上，最靠近坐標(biāo)圖左上方的點(diǎn)為敏感性和特異性均較高的臨界值。
使用Medcalc軟件繪制ROC曲線，根據(jù)靈敏度、特異度及曲線下面積AUC判斷NONHSAG006570作為腫瘤標(biāo)志物的能力。ROC分析結(jié)果顯示：NONHSAG006570的曲線下面積AUC為0.893，靈敏度82.1％，特異度為79.2％，提示NONHSAG006570作為腫瘤標(biāo)志物的能力較強(qiáng)(具體見實(shí)施例中的表4和說明書附圖1)。
將在以下通過實(shí)施例更具體地描述本發(fā)明。不應(yīng)被解釋為本發(fā)明限于這些實(shí)施例或受這些實(shí)施例限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可在本發(fā)明的技術(shù)概念內(nèi)進(jìn)行各種方式的修改和改進(jìn)。
<實(shí)施例1>篩選lncRNA作為腫瘤標(biāo)志物
(一)初步篩選
1.宮頸癌樣本數(shù)據(jù)下載
進(jìn)入GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)的主頁面，輸入關(guān)鍵詞“cervical cancer progress”，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康淖罱K選擇編碼是GSE63514的樣本集，此樣本集中共包含128個(gè)樣本芯片，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)?zāi)康淖罱K選用24例正常宮頸組織和28例宮頸癌組織納入后續(xù)分析。
2.宮頸癌原始數(shù)據(jù)的預(yù)處理
下載的宮頸癌的原始數(shù)據(jù)為.CEL為存儲(chǔ)格式的，需要將數(shù)據(jù)上傳到ncFANs在線服務(wù)器，實(shí)現(xiàn)對(duì)原始芯片數(shù)據(jù)的重新注釋。經(jīng)過ncFANs的處理后共有10914個(gè)探針被重新注釋，其中編碼基因9196個(gè)，lncRNA共1718個(gè)。
3.宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中差異表達(dá)lncRNA的篩選
進(jìn)行差異表達(dá)基因和lncRNA篩選，首先需要對(duì)28例宮頸癌組織和24例正常宮頸組織的樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，將有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的lncRNA納入后續(xù)分析；然后將宮頸癌組織表達(dá)均值與宮頸正常組織表達(dá)均值進(jìn)行比較，宮頸癌組織表達(dá)均值/宮頸正常組織表達(dá)均值≥2或者≤0.5，符合上述要求的lncRNA納入后續(xù)分析；對(duì)于發(fā)生改變的樣本數(shù)少于總樣本數(shù)20％的基因剔除，通過三次篩選后將剩余的lncRNA做進(jìn)一步的分析。本研究中共有54個(gè)lncRNA差異性表達(dá)，其中上調(diào)23個(gè)，下調(diào)31個(gè)。
(二)篩選lncRNA的實(shí)驗(yàn)
1.RNA抽提實(shí)驗(yàn)步驟：
細(xì)胞、組織(包含miRNA)總RNA提取試驗(yàn)步驟如下：
1)細(xì)胞收集
細(xì)胞數(shù)量在102-107之間，懸浮細(xì)胞，低速離心收集102-107細(xì)胞；貼壁細(xì)胞，小心倒出培養(yǎng)液。加入300μl(少量細(xì)胞幾百)/600μl(幾千以上)裂解/結(jié)合緩沖液，震蕩或反復(fù)抽打，以至細(xì)胞裂解。
2)組織制備
組織在0.5-250mg之間，從活體上取下的組織應(yīng)在15分鐘內(nèi)用液氮浸沒迅速降溫，液氮運(yùn)輸。體積較小的組織最好用RNA保存，干冰運(yùn)輸。
3)用mirVanaTM RNA Isolation Kit分離試劑盒(Applied Biosystem p/n AM1556)提取總RNA
3.1)加入10倍體積的裂解/結(jié)合緩沖液(1ml裂解/結(jié)合緩沖液/0.1g組織)勻漿器徹底混勻。
3.2)加入1/10體積的均質(zhì)添加劑，渦旋混勻，冰上放置10分鐘。以上操作均在冰上。
3.3)加入與裂解(不計(jì)均質(zhì)添加劑)相同體積的酸化的酚-氯仿(acid-phenol:chloroform)(300μl裂解/300μl酸化的酚-氯仿)，渦旋30-60秒，室溫10,000g離心5分鐘，分相若不好，則需重新離心。取上清置一新管中，記體積。
3.4)加入1.25倍體積100％乙醇，渦旋混勻，反復(fù)過純化柱，體積不超過700μl，10,000g離心15秒。
3.5)加入350μl洗液1，離心5～10秒，清洗純化拄，10,000g離心15秒，棄過濾液。3.6DNase I 10μl和緩沖液RDD 70μl加入膜上(QIAGEN#79254)，20-30℃放置15分鐘。
3.7)加入350μl洗液1，離心5～10秒，清洗純化拄，10,000g離心15秒，棄過濾液。
3.8)加入500μl洗液2/3，離心5～10秒，清洗純化柱二次，10,000g離心15秒，棄過濾液，離心1分鐘。
3.9)將離心柱放置到新的收集管中，柱中心加入100μL 95℃預(yù)熱的洗脫液或無核酸酶水，室溫最高轉(zhuǎn)速離心20-30秒，收集管中液體即為提取的總RNA，可放置在-70℃保存。
2.高通量檢測(cè)：
A.實(shí)驗(yàn)主要試劑及儀器：
主要試劑：
主要儀器耗材：
B.實(shí)驗(yàn)步驟:
1.總RNA的純化(QIAGENMini Kit)
如果總RNA的純度不高，會(huì)影響探針的標(biāo)記效率和芯片雜交結(jié)果。所以使用QIAGENKit純化總RNA，詳細(xì)操作原理和方法見RNeasy Mini Protocol。
1)取總RNA≤100μg溶解于100μl無RNase水中，加入350μl緩沖液RLT并充分混勻。
2)加入250μl無水乙醇，加樣槍槍頭充分混勻。
3)將共計(jì)700μl含總RNA的溶液轉(zhuǎn)入套在2ml離心管內(nèi)的RNeasy柱子內(nèi)，≥8000g離心30秒，棄去濾過液。
4)吸取500μl緩沖液RPE到RNeasy mini柱子內(nèi)，≥8000g離心洗滌30秒，棄去濾過液，再用500μl緩沖液RPE在≥8000g離心洗滌2min，棄去濾過液和2ml的套管，將RNeasy mini柱子轉(zhuǎn)入一新的1.5ml Eppendorf管中。
5)吸取40μl無RNase的水，≥8000g離心洗脫1min。
6)重復(fù)步驟5一次。
2.cDNA第一鏈和第二鏈一步法合成
1)取0.2μg RNA于0.2ml離心管中，如下配置反應(yīng)溶液：
2)65℃保溫10分鐘，冰浴5分鐘
注意：提前把5×第一鏈緩沖液在80℃預(yù)熱3-4分鐘
3)配置如下cDNA合成體系：
4)將上述4.7μl混合物加入變性后冰浴的RNA中。
5)用槍頭混勻，之后離心。
6)PCR：40℃2小時(shí)；70℃15分鐘；冰浴5分鐘
3.熒光標(biāo)記cRNA合成
1)如下配置轉(zhuǎn)錄混合物：
2)加入6μl轉(zhuǎn)錄混合物并混勻
3)PCR：40℃2小時(shí)
4.cRNA純化(QIAGENMini Kit)
QIAGEN RNeasy Mini kit純化cRNA，具體方法可參見QIAGEN公司隨試劑盒提供的操作手冊(cè)。
1)加入84μl無RNase水，加入350μl緩沖液RLT并充分混勻。
2)加入250μl無水乙醇，加樣槍槍頭充分混勻。
3)將共計(jì)700μl含總RNA的溶液轉(zhuǎn)入套在2ml離心管內(nèi)的RNeasy柱子內(nèi)，≥8000g離心15-30sec，棄去濾過液。
4)吸取500μl緩沖液RPE到RNeasy mini柱子內(nèi)，≥8000g離心洗滌15-30sec，棄去濾過液，再用500μl緩沖液RPE在≥8000g離心洗滌2min，棄去濾過液和2ml的套管，將RNeasy mini柱子轉(zhuǎn)入一新的1.5ml Eppendorf管中。
5)吸取30μl無RNase的水，靜置1min，≥8000g離心洗脫1min。
6)重復(fù)步驟5一次。
5.cRNA濃度測(cè)定
1)cRNA質(zhì)控
用分光光度計(jì)分析RNA濃度。
需要在260和280nm測(cè)定吸光度來確定樣品的濃度和純度。確定RNA的A260/A280在1.9-2.1以確定其純度較純。
2)按下面的計(jì)算公式確定調(diào)整cRNA的含量：
調(diào)整cRNA含量＝RNAm-(總RNAi)
(y)RNAm＝體內(nèi)試驗(yàn)(IVT)后測(cè)得cRNA量(μg)
總RNAi＝開始總RNA的量(μg)
y＝在IVT過程中加入的雙鏈cDNA產(chǎn)物占全部cDNA產(chǎn)物的百分?jǐn)?shù)
6.熒光分子濃度及摻入率計(jì)算
Cy3-濃度(pmol/μl)＝A552/0.15
Cy3-摻入率(pmol/μg)＝Cy3-濃度/cRNA濃度(μg/μl)
7.cRNA樣品片段化和芯片雜交
1)按下表配制片段化混合液，然后在60℃溫浴30min進(jìn)行片段化，冰浴1min
2)加入2×GEx雜交緩沖液混勻
3)上芯片，65℃17小時(shí)，10rpm滾動(dòng)雜交
8.芯片洗滌及掃描
取出芯片于洗液1中洗滌1分鐘，再將芯片放入洗液2中洗滌1分鐘(37℃)。
在安捷倫掃描儀中掃描，分辨率為3μm/5μm，掃描儀自動(dòng)以100％掃描一次。
(三)最終篩選作為腫瘤標(biāo)記物的lncRNA
1.放療后差異表達(dá)lncRNA的篩選
對(duì)臨床采集血樣進(jìn)行上述lncRNA的高通量檢測(cè)，分別采集放療前、放療3次后、放療6次后血樣進(jìn)行l(wèi)ncRNA的高通量分析。為擴(kuò)大lncRNA的篩選范圍，保證lncRNA不被漏選，將差異變化的標(biāo)準(zhǔn)降低為1.5倍，即將放療3次后與放療6次后的樣本分別與放療前的樣本進(jìn)行比較，比值變化大于1.5倍以上或小于0.666倍以下的lncRNA保留，納入后續(xù)的篩選范疇。
2.血液檢測(cè)用有治療價(jià)值lncRNA的篩選
將初步篩選的步驟3中從組織中篩選出來的lncRNA與在最終篩選步驟1中從血液中篩選出來的lncRNA進(jìn)行比對(duì)，篩選出在腫瘤發(fā)展過程中上調(diào)的同時(shí)在放療后下調(diào)的lncRNA，或者是在腫瘤發(fā)展過程中下調(diào)的而在放療后上調(diào)的lncRNA，最終篩選出NONHSAG006570(表3)，它在腫瘤發(fā)展過程中上調(diào)，可有效用于有效及時(shí)地篩查出宮頸癌患者。
表3lncRNA在腫瘤發(fā)生過程中和放療后的比值變化
注：T-腫瘤；N-正常；R-放療；C-放療前對(duì)照
(四)評(píng)價(jià)lncRNA作為腫瘤標(biāo)志物的能力
使用Medcalc軟件繪制ROC曲線，根據(jù)靈敏度、特異度及曲線下面積AUC判斷NONHSAG006570作為腫瘤標(biāo)志物的能力。ROC分析結(jié)果顯示：NONHSAG006570的曲線下面積AUC為0.893，靈敏度82.1％，特異度為79.2％。
上述結(jié)果提示，NONHSAG006570作為腫瘤標(biāo)志物的能力較強(qiáng)，適合用作血液檢測(cè)用的lncRNA以預(yù)測(cè)宮頸癌放療預(yù)后(具體見表4和說明書圖1)。
表4NONHSAG006570在宮頸癌中的ROC分析
<實(shí)施例2>對(duì)放療后血液樣本的實(shí)時(shí)PCR定量檢測(cè)
對(duì)接受常規(guī)放療的宮頸癌患者17例(均為鱗狀細(xì)胞癌，47％為III期，53％為II期)，取其放療前、放療后1～6周血液樣本，進(jìn)行NONHSAG006570的實(shí)時(shí)PCR定量檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)步驟具體為：
(一)在血液中提取RNA
1、新鮮采集的血樣放入EDTA抗凝的采血管中，4℃離心機(jī)3000rpm離心10min，使血細(xì)胞與血漿分離，將上層血漿收集-20℃分裝保存。
2、按照采血樣體積1:3加入紅細(xì)胞裂解液，輕輕上下顛倒混勻，靜置至液體呈現(xiàn)紅色透明狀態(tài)提示紅細(xì)胞裂解完成。
3、3000rpm離心10min，棄上清，再加入3ml紅細(xì)胞裂解液，用移液器輕輕混勻，靜置10min將未裂解的紅細(xì)胞繼續(xù)裂解。
4、3000rpm離心10min，棄上清，用移液器吸去多余裂解液。
5、加1ml TRIZOL試劑，輕輕吹打直至沉淀徹底消失，全程冰上操作。
6、加入TRIZOL五分之一體積的預(yù)冷的三氯甲烷，劇烈震蕩15秒，室溫靜置5min。
7、使用低溫高速離心機(jī)在4℃條件下，12000rpm離心15分鐘，小心吸取上層水相，加入新的EP管中。
8、上層水相加入等體積的預(yù)冷異丙醇后，立刻顛倒混勻，使水相和異丙醇充分接觸，室溫靜置10min或-20冰箱過夜沉淀RNA。
9、低溫高速離心機(jī)12000rpm離心10分鐘，棄上清，可以看見沉淀到管底的RNA沉淀，緩緩加入1ml 75％乙醇，輕輕顛倒幾次，4℃，7500rpm離心5分鐘，沉淀變?nèi)榘咨?/p>
10、沉淀室溫干燥至透明狀，加入20-50微升DEPC處理水(或高壓2h的雙蒸水)進(jìn)行溶解，于57℃水浴鍋中溶解10min，分裝，-80℃保存。
(二)cDNA合成
按照大連Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Primereagent Kit Perfect(m RNA)說明書，將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以此為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)。
配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下：
混合液共10μl體系，反應(yīng)液的配置全程在冰上進(jìn)行
反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下:
37℃ 15min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))
85℃ 5sec(反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng))
4℃ -----
(三)Real-time PCR檢測(cè)
1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：
先對(duì)逆轉(zhuǎn)錄cDNA產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋，共稀釋成4、16、64、256倍共四個(gè)梯度，每個(gè)稀釋倍數(shù)平行三副孔上樣。
配制PCR反應(yīng)體系如下：
全程冰上混合操作。
采用兩步法進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：
95℃預(yù)變性，酶激活30s
95℃變性20s
60℃退火20s
變性退火共45循環(huán)。
完成后進(jìn)入PCR儀自帶的標(biāo)準(zhǔn)曲線程序，完成標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線提供的擴(kuò)增曲線和融解曲線判斷引物的特異性以及通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率確定反應(yīng)的擴(kuò)增效率。融解曲線為單一峰，擴(kuò)增效率指標(biāo)為：0.8＜E＜1.2，越接近1越好，在擴(kuò)增效率范圍內(nèi)，才可利用比較閾值法，即目的基因的量＝2-△△CT進(jìn)行計(jì)算。
2.PCR檢測(cè)
在滿足引物特異性好，擴(kuò)增效率高之后進(jìn)行PCR檢測(cè)，使用管家基因GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行RNA量的校正。
使用上述標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時(shí)所用PCR反應(yīng)體系以及兩步法PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件同上。
3.結(jié)果計(jì)算
采用比較閾值法計(jì)算結(jié)果，即目的基因的量＝2-△△Ct，在該公式中，Ct指的是熱循環(huán)儀檢測(cè)到反應(yīng)體系中熒光信號(hào)的強(qiáng)度值，△△Ct＝(Ct目的基因–Ct管家基因)實(shí)驗(yàn)組–(Ct目的基因–Ct管家基因)對(duì)照，或△△Ct＝[Ct GI(未知樣品)–Ct GAPDH(未知樣品)]–[Ct GI(校正樣品)–Ct GAPDH(校正樣品)]。GI是目的基因，校正樣品是任何被選做代表1倍目的基因表達(dá)量的樣品。
經(jīng)計(jì)算，NONHSAG006570在放療后與放療前相比顯著下降，放療第三～六周達(dá)到基本穩(wěn)態(tài)濃度，與放療前相比，其比值的閾值為0.522[0.396-0.6](95％可信區(qū)間)，結(jié)果與表3有較好的一致性，表明血液樣本可用于替代組織活檢樣本作為靈敏度和特異性均較高的宮頸癌無損性檢測(cè)標(biāo)志物，而且減輕患者痛苦并減少人為導(dǎo)致癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的可能。
另外，NONHSAG006570在放療后預(yù)后較好的患者體內(nèi)下調(diào)明顯，在放療后預(yù)后較差的患者體內(nèi)下調(diào)則不明顯，表明還可有效用于預(yù)測(cè)宮頸癌患者的放療預(yù)后情況。具體結(jié)果顯示，放療好轉(zhuǎn)的患者指標(biāo)降低，與放療前相比為0.655(0.5979,0.7121)。放療未好轉(zhuǎn)的患者指標(biāo)無顯著性變化，與放療前相比為0.9518(0.7268,1.1767)。
另外，放療第三～六周的時(shí)間點(diǎn)可及時(shí)有利地幫助確定是否患者預(yù)后較好，并且輔助判斷患者是否需要進(jìn)一步放療療程，為臨床總體治療方案的確定提供可靠的輔助參考。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。