本發(fā)明涉及一種銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞調(diào)控因子及其應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

持留菌是某個細(xì)菌群體在致死濃度抗菌藥物壓力情況下，以一定比例隨機表型異化的小亞群。表現(xiàn)為臨時休眠狀態(tài)或緩慢生長狀態(tài)，可耐受致死濃度的抗菌藥物，但這種抗菌藥物耐受性不能遺傳。當(dāng)致死濃度抗菌藥物的壓力消失后，持留菌又會迅速恢復(fù)為正常細(xì)胞，對抗菌藥物敏感。由于持留菌對抗菌藥物具有高耐受性，殘存的持留菌在體內(nèi)抗菌藥物濃度降低或免疫力下降時可以再次引起感染。由此清除持留菌對于有效控制感染具有重要意義。隨著學(xué)科的交叉與研究的深入，持留菌逐漸被醫(yī)學(xué)微生物學(xué)、環(huán)境微生物學(xué)和微生物生態(tài)學(xué)等各領(lǐng)域研究者所關(guān)注，不同的持留菌形成機制被不斷發(fā)現(xiàn)。

毒素‐抗毒素(Toxin‐Antitoxin)系統(tǒng)(TA系統(tǒng))是目前研究較為清楚的持留菌形成機制，它可以改變細(xì)胞某些主要的生命活動狀態(tài)，抑制某些大分子的合成，從而使細(xì)胞處于持留態(tài)。此外，可誘發(fā)細(xì)胞形成持留態(tài)的因素還包括DNA損傷、高溫及酸壓力、呼吸抑制、化學(xué)信號響應(yīng)等。研究發(fā)現(xiàn)，不同細(xì)菌的持留菌形成機制不盡相同，而且同種細(xì)菌的持留菌形成機制也非單一。通過各領(lǐng)域研究學(xué)者的不斷深入研究，不同持留菌形成機制被發(fā)現(xiàn)。但是目前尚未發(fā)現(xiàn)可以完全清除持留菌的抗菌藥物或其他手段，可見有效控制持留菌感染面臨嚴(yán)峻考驗。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞調(diào)控因子。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供一種銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞調(diào)控因子的應(yīng)用。

本發(fā)明最后解決的技術(shù)問題是提供與上述銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞調(diào)控因子結(jié)合的細(xì)菌表面相關(guān)蛋白及其應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞調(diào)控因子，所述的銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞調(diào)控因子為小分子單鏈DNA，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，全長為12bp。

所述的銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞調(diào)控因子優(yōu)選5’末端磷酸化或5’末端未磷酸化；5’末端磷酸化的銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞調(diào)控因子簡稱為P‐poly(C)；5’末端未磷酸化的銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞調(diào)控因子簡稱為poly(C)。

poly(C)：5’‐CCCCCCCCCCCC‐3’

P‐poly(C)：PO₄^3‐5’‐CCCCCCCCCCCC‐3’

本發(fā)明所述的銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞調(diào)控因子在控制銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞與正常細(xì)胞之間切換中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的應(yīng)用，優(yōu)選5’末端磷酸化的銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞調(diào)控因子與銅綠假單胞菌細(xì)菌表面相關(guān)結(jié)合蛋白結(jié)合，銅綠假單胞菌就會由正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌至魬B(tài)細(xì)胞；當(dāng)5’末端未磷酸化的銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞調(diào)控因子與銅綠假單胞菌細(xì)菌表面相關(guān)結(jié)合蛋白結(jié)合時，銅綠假單胞菌會由持留態(tài)細(xì)胞變?yōu)檎＜?xì)胞；所述的銅綠假單胞菌細(xì)菌表面相關(guān)結(jié)合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，共含有352個氨基酸。

一種調(diào)節(jié)銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞與正常細(xì)胞之間切換的細(xì)菌表面相關(guān)結(jié)合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

編碼所述的細(xì)菌表面相關(guān)結(jié)合蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，該基因全長為1059bp，G+C含量為65.72％。

所述的細(xì)菌表面相關(guān)結(jié)合蛋白作為治療靶點在控制銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞與正常細(xì)胞之間切換中的應(yīng)用，所述的5’末端磷酸化的銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞調(diào)控因子與所述的銅綠假單胞菌細(xì)菌表面相關(guān)結(jié)合蛋白結(jié)合或所述的銅綠假單胞菌細(xì)菌表面相關(guān)結(jié)合蛋白空載時，銅綠假單胞菌就會由正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌至魬B(tài)細(xì)胞；當(dāng)所述的5’末端未磷酸化的銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞調(diào)控因子與所述的銅綠假單胞菌細(xì)菌表面相關(guān)結(jié)合蛋白結(jié)合時，銅綠假單胞菌會由持留態(tài)細(xì)胞變?yōu)檎＜?xì)胞；所述的銅綠假單胞菌細(xì)菌表面相關(guān)結(jié)合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一種調(diào)控銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞與正常細(xì)胞之間切換的試劑，包括所述的銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞調(diào)控因子。

本發(fā)明所述的應(yīng)用均不涉及疾病的治療方法，僅限用于非疾病治療方法以外的應(yīng)用，如科研方面。

有益效果：

1.構(gòu)建銅綠假單胞菌胞外小分子單鏈DNA文庫，篩選得到有效控制銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞與正常細(xì)胞相互切換的銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞調(diào)控因子。

2.通過雙向凝膠電泳得到銅綠假單胞菌表面相關(guān)結(jié)合蛋白，與上述銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞調(diào)控因子構(gòu)成持留菌調(diào)控分子組件，有效控制銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞與正常細(xì)胞的相互切換。

3.該銅綠假單胞菌表面相關(guān)結(jié)合蛋白共352個氨基酸，由1059bp(從起始密碼子到終止密碼子)編碼而成，其G+C含量為65.72％。

4.由銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞調(diào)控因子與細(xì)菌表面相關(guān)結(jié)合蛋白組成的分子組件，可以有效調(diào)控銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞與正常細(xì)胞之間的切換，為藥物消除銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞提供相關(guān)靶位點。

5.基于銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞調(diào)控因子單鏈DNA 5’末端磷酸化/去磷酸化的持留態(tài)快速切換方法也可以直接用于制備相應(yīng)藥物消除銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞。

附圖說明

圖1胞外小分子單鏈DNA與細(xì)菌表面相關(guān)結(jié)合蛋白構(gòu)成的分子組件調(diào)控銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞與正常細(xì)胞相互切換的效果圖。

圖2胞外小分子單鏈DNA 5’末端磷酸化/去磷酸化調(diào)控銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞與正常細(xì)胞相互切換的效果圖。

具體實施方式

根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

實施例1：銅綠假單胞菌胞外小分子單鏈DNA的獲取

1.1.培養(yǎng)至穩(wěn)定期(培養(yǎng)約33h)的銅綠假單胞菌菌液離心獲取上清液，上清液經(jīng)0.22μm聚四氟乙烯濾膜(購自Whatman)過濾去除殘余菌體。

1.2經(jīng)蛋白酶K(protein K，購自寶生物工程(大連)有限公司)在37℃處理2h以去除上清液中所含有的蛋白質(zhì)。

1.3上述所獲得的產(chǎn)物經(jīng)超濾離心管(購自Millipore公司)離心去除大分子雙鏈DNA和殘余大分子蛋白質(zhì)，獲取超濾后的滲濾液。

1.4超濾后的滲濾液經(jīng)脫氧核苷酸雙鏈酶(Exonuclease III，購自寶生物工程(大連)有限公司)和RNA酶(RNase，購自寶生物工程(大連)有限公司)在37℃處理1h，由此去除滲濾液中的殘余雙鏈DNA和RNA。

1.5采用酚‐氯仿抽提及乙醇沉淀的方法獲得銅綠假單胞菌胞外小分子單鏈DNA，將其以20ng/ul的濃度溶解在無菌水中。

實施例2：銅綠假單胞菌胞外小分子單鏈DNA文庫構(gòu)建，獲得持留菌調(diào)控因子

2.1上述所得的銅綠假單胞菌胞外小分子單鏈DNA在脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase，購自寶生物工程(大連)有限公司)作用下，使其3’末端加上poly(A)。

2.2以oligo(dT)為引物，采用Ex Taq DNA聚合酶(Ex Taq DNA polymerase，購自寶生物工程(大連)有限公司)通過PCR的方式獲得上述片段的互補鏈，從而獲得雙鏈DNA片段。

2.3將上述雙鏈DNA片段與pMD 19‐T載體(購自寶生物工程(大連)有限公司)在16℃條件下過夜酶聯(lián)，酶聯(lián)產(chǎn)物經(jīng)PCR清潔回收試劑盒(購自Axygen公司)清潔回收，回收的DNA溶于10mmol/L的Tris‐HCl(pH8.0)中。

2.4制備大腸桿菌DH 5α高效電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞，具體方法參照J(rèn).薩姆布魯克等編的《分子克隆實驗指南》。

2.5清潔回收的酶聯(lián)產(chǎn)物以電轉(zhuǎn)化的方式轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH 5α感受態(tài)細(xì)胞，具體方法參照J(rèn).薩姆布魯克等編的《分子克隆實驗指南》。涂布含有100mg/L氨芐青霉素的LB平板。37℃培養(yǎng)24h后，分離純化所獲得的克隆子。

2.6插入片段的核苷酸序列由寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行序列測定。

2.7英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成各克隆子所獲得的核苷酸序列，并測試上述所獲得的多條胞外小分子單鏈DNA對銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞與正常細(xì)胞相互切換的有效性，從而獲得銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞調(diào)控因子。篩選銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞調(diào)控因子的方法為將所得胞外單鏈小分子DNA加回已水洗的銅綠假單胞菌中，測試其持留菌比例。若處理組持留菌比例與銅綠假單胞菌未水洗原始菌液持留菌比例相同，我們既可確定該處理組所添加的胞外單鏈小分子DNA為銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞調(diào)控因子。經(jīng)篩選銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞調(diào)控因子核苷酸序列為SEQ ID NO.1。

實施例3：銅綠假單胞菌細(xì)菌表面相關(guān)結(jié)合蛋白的獲取

3.1英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示3’末端具有Cy5熒光基團標(biāo)記的銅綠假單胞菌持留菌控制因子。

3.2上述合成產(chǎn)物與等體積磷酸鹽緩沖液(10mmol/L，pH7.0)重懸的銅綠假單胞菌(水洗兩遍)37℃作用20min。

3.3上述作用產(chǎn)物離心后將菌體水洗以去除多余熒光標(biāo)記調(diào)控因子。

3.4等體積磷酸鹽緩沖液(10mmol/L，pH7.0)重懸上述菌體，采用終濃度為1％的甲醛交聯(lián)15min，再用終濃度為0.125mol/L甘氨酸終止交聯(lián)5min。

3.5上述產(chǎn)物重懸于等體積磷酸鹽緩沖液(10mmol/L，pH7.0)，超聲破碎。離心后沉淀以10μg/μl的濃度溶于含2％Triton X‐100的磷酸鹽緩沖液(10mmol/L，pH7.0)，即為我們所獲得的銅綠假單胞菌細(xì)胞膜總蛋白。

3.6銅綠假單胞菌細(xì)胞膜總蛋白跑雙向電泳，蛋白質(zhì)通過等電點和分子量彼此分開。經(jīng)熒光凝膠掃描及銀染方式，我們獲得銅綠假單胞菌細(xì)菌表面相關(guān)結(jié)合蛋白。其氨基酸序列為SEQ ID NO.2，編碼該結(jié)合蛋白的基因核苷酸序列為SEQ ID NO.3。

實施例4：銅綠假單胞菌形成持留態(tài)相關(guān)分子組件的功能研究

4.1培養(yǎng)至穩(wěn)定期(約33h)的銅綠假單胞菌菌液離心棄上清，菌體經(jīng)無菌水充分水洗2遍。等體積LB重懸菌體。

4.2通過4.1所獲得的菌液加終濃度為5mg/L氧氟沙星，37℃、250rpm作用3h。稀釋涂布LB平板，從而獲得該處理(即圖1中的水洗菌)下銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞所占比例。對照組為未去除上清的原始銅綠假單胞菌菌液(即圖1中的原始菌)。

4.3通過4.1所獲得的菌液，加入終濃度為10μmol/L的poly(C)，室溫作用10min后，終濃度為5mg/L氧氟沙星，37℃、250rpm作用3h。稀釋涂布LB平板，從而獲得該處理(即圖1中的水洗菌+poly(C))下銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞所占比例。

4.4通過4.1所獲得的菌液，加入終濃度為10μmol/L的P‐poly(C)，室溫作用10min后，加入終濃度為5mg/L氧氟沙星，37℃、250rpm作用3h。稀釋涂布LB平板，從而獲得該處理(即圖1中的水洗菌+P‐poly(C))下銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞所占比例。

結(jié)果如圖1所示，當(dāng)銅綠假單胞菌細(xì)菌表面相關(guān)結(jié)合蛋白空載或與5’末端磷酸化的P‐poly(C)結(jié)合時，銅綠假單胞菌就會由正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌至魬B(tài)細(xì)胞，此時持留菌比例較高；當(dāng)細(xì)胞表面結(jié)合蛋白與5’末端未磷酸化的poly(C)結(jié)合時，銅綠假單胞菌會由持留態(tài)細(xì)胞變?yōu)檎＜?xì)胞，此時持留菌比例較低。

實施例5：銅綠假單胞菌胞外小分子單鏈DNA 5’末端磷酸化/去磷酸化的持留態(tài)快速切換功能研究

5.1培養(yǎng)至穩(wěn)定期(約33h)的銅綠假單胞菌菌液經(jīng)T4多聚核苷酸激酶(T4polynucleotide kinase，購自寶生物工程(大連)有限公司)37℃處理30min，即通過T4多聚核苷酸激酶作用使得DNA 5’末端磷酸化。然后加入終濃度為5mg/L氧氟沙星，37℃、250rpm作用3h。稀釋涂布LB平板，從而獲得該處理下銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞所占比例(即圖2中的原始菌+磷酸化酶)。對照組為原始銅綠假單胞菌菌液(即圖2中的原始菌)。

5.2通過4.1所獲得的菌液，分別加入終濃度為10μmol/L的poly(C)和P‐poly(C)，室溫作用10min后，經(jīng)T4多聚核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase，購自寶生物工程(大連)有限公司)和堿性磷酸酯酶(alkaline phosphatase(calf intestine)，購自寶生物工程(大連)有限公司)在37℃條件下分別處理30min后，加入終濃度為5mg/L氧氟沙星，37℃、250rpm作用3h。稀釋涂布LB平板，從而獲得兩種處理(即圖2中的水洗菌+poly(C)+磷酸化酶組和水洗菌+P‐poly(C)+磷酸化酶)下銅綠假單胞菌持留態(tài)細(xì)胞所占比例。

結(jié)果如圖2所示，當(dāng)調(diào)控銅綠假單胞菌形成持留態(tài)的相關(guān)分子組件中胞外小分子DNA5’末端含有磷酸基團時，銅綠假單胞菌就會由正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌至魬B(tài)細(xì)胞，此時持留菌比例較高；當(dāng)組件中胞外小分子DNA5’末端沒有磷酸基團時，銅綠假單胞菌會由持留態(tài)細(xì)胞變?yōu)檎＜?xì)胞，此時持留菌比例較低。